超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)柑橘樣品中氟吡呋喃酮及其代謝物殘留

李雙雙，歐曉明,*，金晨鐘*，晏 姣，張貴群，梁 驥，梁貴平

(1.湖南人文科技學(xué)院 農(nóng)藥無害化應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖南省農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 婁底 417000；2.湖南化工研究院 國家農(nóng)藥創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410014；3.湖南加法檢測(cè)有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410014)

氟吡呋喃酮(Flupyradifurone)，商品名為Sivanto或Sivanto Prime，化學(xué)名為4-[(6-氯-3-吡啶基甲基)(2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮，是德國拜耳公司開發(fā)的一種新型丁烯酸內(nèi)酯類殺蟲劑，可作用于靶標(biāo)害蟲的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，為昆蟲煙堿乙酰膽堿受體激動(dòng)劑，主要登記用于防治蔬菜、果樹、棉花、大豆等作物的蚜蟲、粉虱、木虱、葉蟬等害蟲，表現(xiàn)出明顯的內(nèi)吸、觸殺、胃毒、滲透和選擇作用，且對(duì)蜜蜂安全[1-2]，其代謝物為二氟乙酸(DFA)、二氟乙氨基呋喃酮(DFEAF)和6-氯煙酸(6-CNA)。目前針對(duì)氟吡呋喃酮的研究主要集中于合成和應(yīng)用方面，如楊吉春[3]、曹慶亮[4]、趙國建[5]等研究了氟吡呋喃酮的合成，陳敏[6]、胡菡青[7]等進(jìn)行了氟吡呋喃酮對(duì)番茄煙粉虱和柑橘木虱的田間藥效試驗(yàn)，武鵬等[8]報(bào)道了氟吡呋喃酮的原藥分析方法，而有關(guān)氟吡呋喃酮及其代謝物在柑橘上的殘留分析方法及其在環(huán)境中的歸趨研究尚未見報(bào)道[9-12]。基于此，本文采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-MS/MS)建立了同時(shí)檢測(cè)柑橘樣品中氟吡呋喃酮及其代謝物殘留的方法，以期為該藥劑在柑橘生態(tài)系統(tǒng)中的合理安全用藥及其環(huán)境安全評(píng)價(jià)提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1290-646型超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司)，AL204型電子天平(瑞士梅特勒·托利多儀器有限公司)，Scout SE型百分之一電子天平(奧豪斯公司)，HY-B1 型回旋振蕩器(金壇市醫(yī)療儀器廠)，Vortex-5型渦旋混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，Zonkia SC-3614型低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)。

乙腈(質(zhì)譜純，Honeywell公司)，甲酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，氯化鈉(分析純，西隴化工公司)，PSA填料(北京安捷飛科技有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)品：氟吡呋喃酮(純度99.4%)、二氟乙酸(DFA，純度95.5%)、二氟乙氨基呋喃酮(DFEAF，純度99.3%)、6-氯煙酸(6-CNA，純度98.9%)均由湖南化工研究院國家農(nóng)藥創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心提供。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(自制)。

1.2 樣品分析方法

1.2.1提取與凈化準(zhǔn)確稱取適量柑橘樣品(柑橘皮10 g、柑橘全果20 g)于150 mL具塞錐形瓶中，加入40 mL乙腈，回旋振蕩1 h，靜置取上清液2 mL，加200 mg PSA，渦旋20 s，離心5 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)相濾膜至進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。

稱取柑橘橘肉20 g于150 mL具塞錐形瓶中，加入40 mL乙腈，回旋振蕩1 h，提取液轉(zhuǎn)移至100 mL具塞量筒中，加入5 g NaCl，劇烈搖動(dòng)，靜置10 min，上清液過0.22 μm有機(jī)相濾膜至進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。

1.2.2分析條件色譜條件：Thermo Hypercarb色譜柱(100 mm×3 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸溶液(70∶30，體積比)，等度洗脫，流速0.4 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

質(zhì)譜條件：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，正負(fù)離子掃描(ESI)，離子噴霧電壓3 500 V，霧化氣壓力103.4 kPa，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速7 L/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的確定

取1 mg/L的氟吡呋喃酮及代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用針泵進(jìn)樣的方式，首先進(jìn)行全掃描(Q1scan)，確定各成分的母離子，其次通過MS2SIM確定錐孔電壓(DP)，再用Product Ion功能找出子離子并確定碰撞能量(CE)，最后用MRM 掃描的方式優(yōu)化各質(zhì)譜參數(shù)。

氟吡呋喃酮及其3個(gè)代謝產(chǎn)物均含氨基或羰基，易形成穩(wěn)定的[M+H]+的準(zhǔn)分子離子，配制 1 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用兩通連接液相色譜與質(zhì)譜，在正離子模式下全掃描得到氟吡呋喃酮母離子(m/z288.8)和DFEAF母離子(m/z164.0)；在負(fù)離子模式下全掃描得到6-CNA母離子(m/z156.0)和DFA母離子(m/z95.1)。將分子離子作為母離子，給予一定的碰撞能量和碰撞氣體，全掃描二級(jí)離子，選取豐度較強(qiáng)、干擾較小的 2 個(gè)子離子分別作為定性及定量離子(見表1)。

2.2 碎裂電壓與碰撞能量的優(yōu)化

以氟吡呋喃酮為例對(duì)碎裂電壓進(jìn)行優(yōu)化。將氟吡呋喃酮配成1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以10 μL進(jìn)樣。初步考察了碎裂電壓為200、150、100、50、20 V時(shí)的響應(yīng)值，結(jié)果顯示150～200 V之間的響應(yīng)值較高；再考察了碎裂電壓為200、180、160、140、120 V時(shí)的響應(yīng)值，結(jié)果顯示160 V出現(xiàn)最大響應(yīng)值；最后將電壓設(shè)定為175、170、165、160、155、150 V，結(jié)果顯示電壓為165 V時(shí)響應(yīng)值最大。實(shí)驗(yàn)選擇氟吡呋喃酮、DFEAF、6-CNA、DFA的最優(yōu)碎裂電壓分別為165、100、50、35 V。

在最優(yōu)電壓條件下，以氟吡呋喃酮為例對(duì)碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化。將氟吡呋喃酮配成1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣10 μL。先將碰撞能量設(shè)置為50、40、30、20、10、5 V，結(jié)果顯示子離子m/z288.8/125.8在20 V時(shí)出現(xiàn)最大響應(yīng)值，m/z288.8/89.9在30 V時(shí)出現(xiàn)最大響應(yīng)值；再細(xì)分各子離子的碰撞能量，發(fā)現(xiàn)子離子m/z288.8/125.8在22 V時(shí)出現(xiàn)最大響應(yīng)值，m/z288.8/89.9在34 V時(shí)出現(xiàn)最大響應(yīng)值。氟吡呋喃酮及其代謝物優(yōu)化后的碎裂電壓和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 氟吡呋喃酮及其代謝物的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Table 1 MS/MS conditions of flupyradifurone and its metabolites

2.3 流動(dòng)相的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)對(duì)比了甲醇-水和乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)的質(zhì)譜響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)氟吡呋喃酮及其3個(gè)代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜響應(yīng)更好，因此采用乙腈作為流動(dòng)相中的有機(jī)相。另外，考察了在水相中分別添加 0.1%甲酸、1.0 mol/L 乙酸銨和 0.1%甲酸- 1.0 mol/L 乙酸銨對(duì)色譜分離及靈敏度的影響，結(jié)果顯示3 種添加劑對(duì)目標(biāo)分析物的色譜峰形及分離的影響差別不大，但添加少量甲酸后，各化合物的離子化效率更高，靈敏度更好，且添加甲酸的效果好于添加乙酸銨?；诖?，本實(shí)驗(yàn)最終采用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相。

2.4 吸附劑的優(yōu)化

分別考察了不同質(zhì)量的PSA對(duì)凈化效果和回收率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn) PSA用量為50、100、200、400 mg時(shí)，氟吡呋喃酮及其代謝物的回收率分別為52%～69%、67%～86%、89%～100%、70%～84%。本實(shí)驗(yàn)最終選用200 mg PSA作為吸附劑。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的考察

基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effects，ME)是指基質(zhì)中的共提取干擾物質(zhì)影響目標(biāo)化合物的離子化，從而使目標(biāo)化合物在儀器上的響應(yīng)發(fā)生增強(qiáng)或抑制的現(xiàn)象[13]。因此在進(jìn)行農(nóng)殘測(cè)定時(shí)，對(duì)目標(biāo)化合物在不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)尤為重要。本文采用較為常用的相對(duì)響應(yīng)值法評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)：ME=(B/A-1)×100%，其中A 為純?nèi)軇┲谢衔锏捻憫?yīng)值，B 為柑橘基質(zhì)中添加相同濃度農(nóng)藥的響應(yīng)值[14]。實(shí)驗(yàn)考察了0.05、0.1、0.5 mg/L 3個(gè)加標(biāo)水平下4種化合物在全果、果肉、果皮3種柑橘基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，在上述3個(gè)水平下的基質(zhì)效應(yīng)分別為-16.65%～9.68%、18.76%～8.29%和-15.91%～10.59%，基質(zhì)效應(yīng)均小于20%，屬于弱基效應(yīng)，對(duì)結(jié)果影響較小。

2.6 線性關(guān)系與定量下限

將500 mg/L的氟吡呋喃酮及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈稀釋配成1、5、10、50、100、500 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按“1.2.2”的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以監(jiān)測(cè)離子峰面積(y) 對(duì)相應(yīng)質(zhì)量濃度(x，μg/L) 作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到氟吡呋喃酮及其代謝物的線性方程。結(jié)果表明，在1～500 μg/L范圍內(nèi)，氟吡呋喃酮及其代謝物的峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.997 9～0.999 6。

定量下限(LOQ)采用加標(biāo)回收率進(jìn)行驗(yàn)證，以符合一定的準(zhǔn)確度和精密度要求的最低加標(biāo)濃度確定為定量下限。經(jīng)驗(yàn)證，該方法的檢出限(LOD，S/N=3)為0.001 mg/L，氟吡呋喃酮及其代謝物在柑橘全果、橘肉中的LOQ為0.05 mg/kg，橘皮中的LOQ為0.1 mg/kg。與其他方法[9-11]相比，本方法的分析時(shí)間更短，檢出限低于或接近已有方法，靈敏度較高。

2.7 加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量，在空白柑橘基質(zhì)中對(duì)氟吡呋喃酮及其代謝物進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平處理5個(gè)重復(fù)，按“1.2.2”的方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表2。由表2可見，氟吡呋喃酮及其代謝物在柑橘全果、果肉中的回收率為71.9%～106%，RSD為0.8%～9.1%；柑橘果皮中的回收率為77.9%～100%，RSD為1.2%～6.5%，說明該方法的精密度和準(zhǔn)確度均符合農(nóng)藥殘留分析的基本要求[15]。

表2 氟吡呋喃酮及其代謝物在柑橘樣品中添加回收率Table 2 The recovery of flupyradifurone and its metabolites in citrus samples

2.8 實(shí)際樣品的分析

根據(jù)《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[15]和《農(nóng)藥登記殘留田間試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》[16]進(jìn)行了17%氟吡呋喃酮溶液在柑橘作物上的最終殘留田間試驗(yàn)，有效成分用量分別為低劑量制劑2 000倍液(有效成分100 mg/kg)和高劑量制劑1 333倍液(有效成分150 mg/kg)，各設(shè)3次施藥和4次施藥兩個(gè)處理，另設(shè)清水空白對(duì)照，處理間設(shè)保護(hù)帶，施藥間隔期為10 d，每個(gè)處理重復(fù)3次，末次施藥后間隔14、21、28 d采集柑橘樣品，按照“1.2.2”方法測(cè)定氟吡呋喃酮及其代謝物在柑橘中的最終殘留量，結(jié)果見表3。由表3可見，氟吡呋喃酮相較于其代謝產(chǎn)物的檢出率更高，且以在柑橘果皮中的檢出濃度較高。

表3 氟吡呋喃酮及其代謝物在實(shí)際柑橘樣品中的殘留量Table 3 Detection data of flupyradifurone and its metabolites in citrus field samples

(續(xù)表3)

CompoundEffective dose(mg/kg)Times of applicationResidual quantity(mg/kg)Citrus fruitCitrus pulpCitrus peel4<0.05<0.05<0.11503<0.05<0.05<0.14<0.05<0.05<0.1DFA1003<0.05<0.05<0.14<0.05<0.05<0.11503<0.05^0.051 8<0.05<0.1^0.1224<0.05<0.05<0.1^0.116

3 結(jié) 論

本文采用UPLC-MS/MS技術(shù)建立了同時(shí)檢測(cè)柑橘全果、果肉、果皮中氟吡呋喃酮及其代謝物殘留量的定性定量分析方法。樣品以乙腈提取，經(jīng)分散固相萃取凈化，直接上機(jī)分析，較常用的液相色譜法縮短了樣品前處理的時(shí)間。該方法選擇性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、靈敏度高，且前處理簡(jiǎn)單，溶劑用量少，適用于柑橘樣品中氟吡呋喃酮及其代謝物的快速檢測(cè)，并成功應(yīng)用于實(shí)際樣品的測(cè)定。