CDH1基因1018位點突變對乳腺癌非同源末端連接修復途徑的影響及作用機理研究

湯永喆，王 杰，何 奇

上海交通大學醫(yī)學院附屬國際和平婦幼保健院乳腺科，上海200030

乳腺癌已成為中國女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤［1］。乳腺癌患者的基因損傷修復能力較正常人相比有退化。

非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）修復途徑是DNA損傷修復過程中極為重要的一部分，NEHJ途徑通過多種功能性蛋白分子復合來發(fā)揮作用，這其中減數(shù)分裂重組蛋白11同系物A（meiotic recombination 11 homolog A，MRE11）是負責招募并組成蛋白復合體的重要組成部分［2-3］，對MRE11的檢測間接說明了其 NHEJ 修復的程度［4-5］。乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene l，BRCA1）是已明確的乳腺癌易感基因［6-7］。

本研究中經(jīng)過對部分乳腺癌患者及其直系家庭成員進行血液樣品的采集與檢測，篩選出已知乳腺癌致病基因突變7種、意義不明突變6種以及疑似致病基因突變38種。經(jīng)過生物信息學軟件預測，上皮鈣黏蛋白編碼基因（E-cadherin gene，CDH1）的1018位點錯義突變c.1018A＞G（p.Thr340Ala）極有可能是一種致病突變類型，針對該位點突變，本研究利用DNA損傷修復過程中的NHEJ途徑的報告系統(tǒng)，對該突變位點進行驗證。

1 材料和方法

1.1 材料

MDA-MB-231細胞系購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫，胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購自生工生物工程（上海）股份有限公司，CDH1基因質(zhì)粒購自上海吉凱基因化學技術有限公司（圖1），CDH1抗體購自美國Sigma公司，MRE11抗體、BRCA1抗體購自美國Abcam公司，β-actin抗體購自北京全式金生物技術有限公司；NHEJ報告系統(tǒng)由南京金凱瑞基因公司合成。共收集上海交通大學醫(yī)學院附屬國際和平婦幼保健院乳腺科65份乳腺癌患者全血樣品，于深圳華大醫(yī)學檢驗中心進行相關基因檢測。

圖 1 CDH1-pcDNA3.1 質(zhì)粒圖譜Fig. 1 The plasmid profile of CDH1-pcDNA3.1

1.2 方法

1.2.1 致病基因突變位點的篩查

本研究選取2014年5月—2017年5月在上海交通大學醫(yī)學院附屬國際和平婦幼保健院活檢或手術后病理確診為乳腺惡性腫瘤的患者共65例，收集患者血液樣本檢測?；颊呔鶠榕裕挲g24～56歲，中位年齡34歲?；颊叽嬖谝欢ǖ倪z傳性乳腺癌高危因素，如在詢問病史過程中發(fā)現(xiàn)患者具有血緣關系的三級親屬中存在至少一種腫瘤家族史（乳腺癌、卵巢癌、胃癌及前列腺癌等，雙側(cè)乳腺癌患者，患者發(fā)病年齡小于45歲等）。在本研究中受檢的65份血液樣本中，31例患者未發(fā)現(xiàn)突變基因；6例患者中存在已知致病基因突變共6種，23例患者發(fā)現(xiàn)意義不明突變38種，5例患者中發(fā)現(xiàn)疑似致病基因突變7種（表1）。其中1例28歲女性患者，經(jīng)病理確診左側(cè)乳腺癌，其家族中雖然父母均未患病，但外公、外婆、阿姨、奶奶均為乳腺癌患者，故推測該患者罹患病癥為家族性隱性遺傳性乳腺癌（家系圖見圖2）。對其全血樣品進行乳腺癌致病基因篩選，經(jīng)遺傳分子檢測后發(fā)現(xiàn)該患者CDH1基因（NM_004360）第1018位點發(fā)生突變（c.1018 A＞G）導致氨基酸發(fā)生了改變（p.Thr340Ala），該遺傳方式符合孟德爾遺傳定律，故選取該基因位點，進行后續(xù)實驗驗證。

表 1 遺傳性乳腺癌/卵巢癌基因檢測結(jié)果匯總表Tab. 1 Summary of genetic testing results for breast cancer/ovarian cancer

圖 2 乳腺癌患者家系圖Fig. 2 The pedigree of a breast cancer patient

1.2.2 CDH1-KO細胞系的構(gòu)建

利用CRISPR/cas9系統(tǒng)構(gòu)建CDH1-gRNA，序列為5’-CACCGGAGAGACACTGCCAA CTGGC-3’，將cas9質(zhì)粒與gRNA質(zhì)粒按1∶1的比例轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞系，48～60 h后將細胞進行稀釋培養(yǎng)，挑取單克隆細胞后接種入24孔板，提取基因組DNA進行測序驗證，得到CDH1敲除（CDH1-knockout，CDH1-KO）細胞系。

1.2.3 CDH1基因及其突變體對細胞增殖的影響

CDH1基因突變體（NM_004360）c.1018 A＞G質(zhì)粒，采用定點突變PCR技術，由長片段引物擴增后得到。將pcDNA3.1空載質(zhì)粒（EV）、CDH1基因質(zhì)粒（CDH1）以及CDH1-1018位點突變質(zhì)粒（CDH1-1018）分別轉(zhuǎn)染進入CDH1-KO細胞系，取24、36、48、60和72 h時間節(jié)點，利用MTT法對細胞增殖率進行測定。

1.2.4 CDH1基因點突變對DNA損傷修復效率的影響

本實驗運用了一種綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記的NHEJ報告系統(tǒng)［2］，該系統(tǒng)被一個上游的、翻譯移碼的起始位點（Koz-ATG） 所抑制，經(jīng)過i-sceⅠ酶切造成DNA雙鏈斷裂后，Koz-ATG會被切除，之后DNA末端的修復會允許GFP在正確的翻譯框中進行翻譯，采用流式細胞術進行檢測，按照GFP會正常發(fā)光的概率，可以估算出損傷后DNA修復的效率［8］。

將pcDNA3.1空載質(zhì)粒（EV）作為對照，將CDH1基因質(zhì)粒（CDH1）與CDH1-1018位點突變體質(zhì)粒（CDH1-1018）轉(zhuǎn)染進入CDH1-KO細胞系，于48 h用i-sceⅠ酶進行酶切，收集細胞并采用流式細胞術進行驗證。

1.2.5 CDH1基因突變對DNA損傷修復過程中相關蛋白質(zhì)表達情況的影響

將pcDNA3.1空載質(zhì)粒（EV）作為對照，將CDH1基因質(zhì)粒（CDH1）與CDH1-1018位點突變體質(zhì)粒（CDH1-1018）轉(zhuǎn)染CDH1-KO細胞系，收集細胞制備蛋白樣品，對NHEJ修復途徑相關蛋白MRE11及乳腺癌相關蛋白BRCA1的表達情況進行驗證。

1.3 統(tǒng)計學處理

對不同時點細胞增殖率檢測結(jié)果采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。組間比較采用配對卡方檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 CDH1-KO細胞系的構(gòu)建

CRISPR/Cas9與gRNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進入細胞，挑取單克隆細胞并進行鑒定，通過PCR及Western blot檢測驗證CDH1-KO細胞系建立并已成功挑取單克隆株培養(yǎng)（圖3、4）。

2.2 CDH1基因及其突變體對細胞增殖的影響

將pcDNA3.1空載質(zhì)粒（EV）、CDH1野生型基因質(zhì)粒（CDH1）以及CDH1-1018位點突變質(zhì)粒（CDH1-1018）分別轉(zhuǎn)染進入細胞，取24、36、48、60和72 h共5個時間節(jié)點，使用MTT法對3種細胞進行細胞增殖能力檢測（圖5）。

圖 3 CDH1-KO細胞系PCR結(jié)果圖Fig. 3 PCR results of the CDH1-KO cancer cell lines

MTT細胞增殖實驗結(jié)果顯示，CDH1基因?qū)毎脑鲋衬芰哂幸欢ǖ挠绊?，對比轉(zhuǎn)染空載的CDH1-KO細胞株，CDH1回補細胞株的增殖能力大幅提升（P＜0.01），而且CDH1-1018位點突變細胞回補株的增殖能力不如CDH1野生株（P＜0.05）。

圖 4 Western blot檢測CDH1-KO細胞系蛋白表達情況Fig. 4 The protein expression in CDH1-KO cancer cell line detected by Western blot

圖 5 MTT細胞增殖實驗顯示CDH1基因及CDH1-1018突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細胞增殖率Fig. 5 MTT assay indicated cell proliferation rate after CDH1-KO cells were transfected with CDH1 and CDH1-1018 plasmid

2.3 CDH1基因點突變對DNA損傷修復效率的影響

運用NHEJ報告系統(tǒng)（圖6）對DNA損傷修復效果進行驗證，報告系統(tǒng)中GFP熒光強度間接反映在DNA損傷修復過程中NHEJ途徑的效率。將報告系統(tǒng)與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CDH1-KO細胞株中，用流式細胞術進行綠色熒光檢測（圖7）。

流式細胞術檢測GFP熒光效率，結(jié)果表明，CDH1基因參與了NHEJ修復途徑，在回補CDH1基因后，NHEJ損傷修復效率有了明顯升高（P＜0.01）。而回補CDH1-1018位點突變體質(zhì)粒后，NHEJ修復效率有所升高（P＜0.05），但低于回補CDH1質(zhì)粒的效率。

圖 6 NHEJ報告系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖Fig. 6 NHEJ reporting system structure

圖 7 流式細胞術檢測i-sceⅠ酶切后GFP熒光效率Fig. 7 Detection of GFP by flow cytometry after i-sceⅠ enzyme digestion

2.4 CDH1基因突變對DNA損傷修復過程中相關蛋白質(zhì)表達情況的影響

在CDH1-KO細胞系中，將pcDNA3.1空載質(zhì)粒（EV）、CDH1野生型基因質(zhì)粒（CDH1）以及CDH1-1018位點突變質(zhì)粒（CDH1-1018）分別轉(zhuǎn)染進入細胞，并檢測NHEJ修復途徑中相關蛋白MRE11及乳腺癌相關蛋白BRCA1等的表達情況，β-actin作為內(nèi)參。

Western blot檢測結(jié)果表明，NHEJ修復途徑中的關鍵蛋白分子MRE11在CDH1-KO細胞中表達很弱，回補CDH1野生型質(zhì)粒后MRE11有很大程度上的表達恢復，而回補CDH1-1018位點突變型質(zhì)粒后，MRE11的表達量有所恢復，但其程度相較CDH1野生型質(zhì)?；匮a效果較弱；對BRCA1蛋白表達量的檢測，則說明了CDH1基因?qū)RCA1蛋白表達的促進效果：CDH1野生型質(zhì)?；匮a后，BRCA1蛋白表達量較高，CDH1-1018位點突變質(zhì)?；匮a后，BRCA1蛋白表達量略見升高，但其效果弱于前者（圖8）。

圖 8 Western blot法檢測CDH1基因質(zhì)粒以及CDH1-1018位點突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CDH1-KO細胞系后MRE11蛋白及BRCA1蛋白Fig. 8 Western blot results of MRE11 protein and BRCA1 protein after CDH1-KO cell line was transfected with CDH1 and CDH1-1018 plasmids

3 討 論

CDH1基因表達強弱對細胞的增殖能力具有一定的影響，且CDH1-1018位點突變細胞株的增殖能力弱于野生型CDH1細胞株，說明該位點的突變可影響細胞增殖，具有研究價值。

通過NHEJ報告系統(tǒng)與流式細胞術檢測DNA損傷后GFP熒光效率，說明CDH1基因?qū)τ贜HEJ修復途徑的重要性。而且回補CDH1-1018位點突變體后，DNA損傷修復過程中NHEJ途徑的效率比野生型CDH1有所降低，說明CDH1基因第1018位點A＞G的突變可使NHEJ修復方式的效率降低，由此推測此位點的突變類型很可能為致病突變，會引起DNA損傷修復過程的減弱。

通過對NHEJ修復途徑中的關鍵蛋白分子MRE11的檢測，表明CDH1基因?qū)HEJ途徑的影響顯著。回補CDH1-1018位點突變質(zhì)粒后，MRE11的表達量回升效率低于野生型CDH1，說明1018位的突變對MRE11的表達有一定程度的抑制作用；同時，也說明該位點的突變對NHEJ修復途徑有較大影響。本研究通過對BRCA1蛋白表達量的檢測發(fā)現(xiàn)，CDH1基因?qū)RCA1蛋白的表達有促進作用，CDH1-1018位點突變質(zhì)?；匮a后，BRCA1蛋白的表達量有所降低。

有研究顯示［9］，CDH1基因與細胞間黏附性相關，我們推測，CDH1基因1018位A＞G位點突變后，會使得細胞浸潤能力減弱，DNA修復過程中蛋白招募過程變慢，從而使得細胞的整體損傷修復效率降低，在乳腺癌易感基因群體中，該基因1018位點的突變，很可能是與其他基因突變共同作用造成細胞損傷，最終使重要位點分子受到影響而導致癌癥的發(fā)生。