加味五虎追風(fēng)散灌胃對(duì)帕金森病大鼠腦組織多巴胺能神經(jīng)元自噬活性的影響及機(jī)制

陳煒，梁健芬，蔣凌飛，吳林，張興博

(1廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023；2廣西中醫(yī)藥大學(xué))

帕金森病(PD)是臨床常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病之一，病理基礎(chǔ)為黑質(zhì)與紋狀體多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性缺失，多巴胺合成受阻，此病發(fā)病隱匿，早期診斷相對(duì)困難，臨床治療以恢復(fù)腦內(nèi)多巴胺水平、控制病情為目標(biāo)[1]。研究[2,3]指出，線粒體代謝異常誘發(fā)的多巴胺能神經(jīng)元自噬參與了PD的發(fā)生發(fā)展，通過(guò)外源性的三磷酸腺苷(ATP)干預(yù)激活線粒體-ATP-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑，可加劇PD大鼠神經(jīng)元自噬和神經(jīng)功能損傷。就傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)而言，PD屬“震顫麻痹”范疇，病位在腦，屬“本虛標(biāo)實(shí)”之證，本虛指腎虛，標(biāo)實(shí)為內(nèi)風(fēng)、瘀血、痰濁所致心神失主。加味五虎追風(fēng)散出自《晉男史傳恩家傳方》，主要用于祛風(fēng)止痙，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其在治療PD方面也有積極作用[4,5]。文獻(xiàn)[6,7]報(bào)道，加味五虎追風(fēng)散在保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元功能方面有積極作用，但具體機(jī)制尚未明確。中藥組方具有多靶點(diǎn)的作用優(yōu)勢(shì)，加味五虎追風(fēng)散是否能夠作用于線粒體-ATP-mTOR途徑介導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元自噬尚不得知。本研究觀察了加味五虎追風(fēng)散對(duì)PD大鼠腦組織多巴胺能神經(jīng)元自噬活性的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠100只，月齡6～8個(gè)月，體質(zhì)量(200±20)g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SCXK(浙)2015-008]。

1.2 藥物、試劑及儀器 加味五虎追風(fēng)散由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供(江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司)，為新型濃縮顆粒劑(蟬蛻6 g、天南星6 g、天麻12 g、全蝎3 g、僵蠶10 g、大地棕根15 g)，每袋含原生藥材9 g；西羅莫司(華北制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20050812)，規(guī)格：1 mg/片×10片，批號(hào)：130521200001W;戊巴比妥鈉、6-羥基多巴胺、阿撲嗎啡(Sigma公司)。線粒體提取試劑盒、ECL試劑盒、BCA試劑盒(上海寶生物)，抗體(Abcam公司)。大鼠立體定向儀(北京友誠(chéng)嘉業(yè)生物科技有限公司，51600)，微量注射泵(深圳瑞沃德生物科技有限公司，KDS310)，垂直電泳和電轉(zhuǎn)印裝置(伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司，Mini-Protean)，臺(tái)式低速冷凍離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司，TDL5M)，切片機(jī)(德國(guó)萊卡，RM2126)，倒置顯微鏡(德國(guó)奧林巴斯，IX83)，透射顯微鏡(德國(guó)卡爾蔡司，LIBRA 200)，線粒體呼吸檢測(cè)儀(英國(guó)漢莎儀器有限公司，Oxytherm)，生物發(fā)光檢測(cè)儀(北京原平皓生物技術(shù)有限公司，TD20/20n)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、PD模型制備及加味五虎追風(fēng)散給予方法 100只大鼠隨機(jī)分為中藥組、西藥組、模型組、對(duì)照組各25只。各組大鼠均腦內(nèi)埋管，即以1%的戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉完全后固定于立體定向儀，常規(guī)皮膚脫毛和消毒后進(jìn)行開(kāi)顱手術(shù)。采用醫(yī)用電鉆鉆開(kāi)顱骨，將套管埋入大鼠腦內(nèi)，以螺絲固定不銹鋼套管，位置調(diào)整得當(dāng)后以牙科膠將套管和螺絲一起固定于顱骨。埋管后大鼠自由生存10 d，期間每天肌肉注射青霉素預(yù)防感染。埋管的第11 d，模型組、中藥組和西藥組通過(guò)微量注射泵予以6-羥基多巴胺溶液[將10 μg的6-羥基多巴胺溶于4 μL生理鹽水中(含0.2%維生素C)]制備PD模型，對(duì)照組僅予以4 μL生理鹽水(含0.2%維生素C)，流速均為0.5 μL/min。注射6-羥基多巴胺后休養(yǎng)1 d，第2 d進(jìn)行模型評(píng)價(jià)[行為學(xué)評(píng)價(jià)：皮下注射阿撲嗎啡0.05 mg/kg，誘導(dǎo)健側(cè)旋轉(zhuǎn)行為，記錄旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，持續(xù)30 min，平均轉(zhuǎn)數(shù)>7 r/min者定義為模型制備成功；腦組織病理評(píng)價(jià)方法：各組隨機(jī)取6只大鼠，取中腦組織制備病理切片，免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)定黑質(zhì)DA能神經(jīng)元標(biāo)志物內(nèi)酪氨酸羥化酶(TH)和α-突觸核蛋白(α-syn)表達(dá)，以TH表達(dá)下調(diào)、α-syn表達(dá)上調(diào)為模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)；剔除模型不成功者和死亡者]。制模成功后次日，中藥組大鼠灌胃加味五虎追風(fēng)散(無(wú)菌蒸餾水溶解)，給藥量為1.2 g/kg，1次/d，連續(xù)1周；西藥組灌胃西羅莫司(研為末，溶解于無(wú)菌蒸餾水)，給藥量為0.27 mg/kg，1次/d，連續(xù)1周；對(duì)照組和模型組均灌胃等體積無(wú)菌蒸餾水。

1.4 大鼠腦組織多巴胺能神經(jīng)元自噬活性指標(biāo)Beclin 1、LC3B檢測(cè) 各組隨機(jī)取大鼠(中藥組7只、西藥組8只、模型組9只、對(duì)照組13只)，斷頭取取腦，分離出中腦和紋狀體，采用總蛋白質(zhì)抽提試劑盒提取蛋白質(zhì)，采用免疫蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Beclin 1、LC3B蛋白。主要步驟：①組裝電泳槽，配置SDS-聚丙烯酰胺凝膠和電泳液，凝膠固定后進(jìn)行上樣，控制每個(gè)上樣通道的樣品蛋白含量為10 μg，先40 V預(yù)電泳30 min清除膠內(nèi)雜質(zhì)，再90 V電泳1 h，此時(shí)不同分子量的蛋白依次分開(kāi)并排列于膠體中；②組裝電轉(zhuǎn)印的“三明治”結(jié)構(gòu)進(jìn)行轉(zhuǎn)印，將SDS-聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，以便抗體孵育；③4%脫脂牛奶封閉60 min，3%的脫脂牛奶配置抗體稀釋液，PBST液清洗后一抗孵育，Beclin 1、LC3B、β-actin抗體濃度分別為1∶1 500、1∶2 000、1∶2 500，4 ℃過(guò)夜；PBST液清洗后二抗孵育，二抗?jié)舛染鶠?∶2 000，37 ℃、90 min；④ECL試劑盒熒光顯色，顯色良好者暗室顯影，并保留膠片，采用影像學(xué)分析軟件Image J分析灰度值。

1.5 大鼠腦組織線粒體活性、ATP合成酶活力、p-mTOR檢測(cè) 各組隨機(jī)取6只大鼠(用于線粒體活性、ATP合成酶活力檢測(cè))，斷頭取腦，分離出中腦和紋狀體，電動(dòng)勻漿，用線粒體提取試劑盒提取線粒體。①線粒體活性：采用線粒體呼吸檢測(cè)儀檢測(cè)state3的呼吸速率、state4的呼吸速率，并計(jì)算線粒體呼吸控制比(RCR)，RCR=state3的呼吸速率/state4的呼吸速率，以此評(píng)價(jià)線粒體活性。②ATP合成酶活力：采用生物發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)線粒體ATP合成酶活力，檢測(cè)方法為熒光素-熒光素酶發(fā)光法。

配置5 mL反應(yīng)體系(0.5 mmol EDTA、10 mmol 4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液、5 mmol磷酸鹽緩沖液、2.5 mmol MgCl2、0.5 mol蘋(píng)果酸、0.25 mol谷氨酸、100 μL熒光素-熒光素酶、50 μg線粒體)，所有試劑現(xiàn)用現(xiàn)配，并以該體系的發(fā)光強(qiáng)度作為底物強(qiáng)度。ADP啟動(dòng)反應(yīng)，記錄發(fā)光強(qiáng)度在不加線粒體和ADP的平行實(shí)驗(yàn)中，加入1 nmol ATP，記錄發(fā)光強(qiáng)度，標(biāo)定ATP合成量。③p-mTOR：所取大鼠及p-mTOR檢測(cè)步驟均與“1.4”相同，其中p-mTOR抗體濃度為1∶2 000。

2 結(jié)果

2.1 各組腦組織Beclin 1、LC3B蛋白表達(dá)比較 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組腦組織Beclin 1、LC3B蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與西藥組比較，△P<0.05。

2.2 各組腦組織線粒體活性、ATP合成酶活力、p-mTOR表達(dá)比較 結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組腦組織線粒體活性、ATP合成酶活力、p-mTOR比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

PD是臨床常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病之一，發(fā)病率隨年齡的增長(zhǎng)而遞增，主要表現(xiàn)為靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩和肌肉強(qiáng)直等運(yùn)動(dòng)缺陷，部分患者伴有認(rèn)知功能損害和神經(jīng)精神功能異常。PD的病理基礎(chǔ)為黑質(zhì)與紋狀體多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性缺失，多巴胺合成受阻，據(jù)悉只有多巴胺能神經(jīng)元缺失達(dá)到50%以上時(shí)才會(huì)表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，因此PD發(fā)病隱匿，早期診斷相對(duì)困難。目前，臨床上應(yīng)對(duì)PD的主要策略仍是對(duì)癥支持治療，以恢復(fù)腦內(nèi)多巴胺的水平、控制病情為目標(biāo)。左旋多巴仍是治療PD的最有效藥物，其起效快、療效確切，但也存在較大不良反應(yīng)，可影響患者的精神狀態(tài)，且長(zhǎng)期應(yīng)用藥效減弱。西羅莫司是一種新型大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，目前臨床多用于預(yù)防器官排斥和免疫調(diào)節(jié)，隨著mTOR在神經(jīng)性疾病中，如癲癇、PD、神經(jīng)紊亂等介導(dǎo)的重要機(jī)制被逐漸揭示，西羅莫司在諸多疾病的基礎(chǔ)研究中取得了進(jìn)展[8]。動(dòng)物研究[9]已證實(shí)，西羅莫司PD大鼠的多巴胺能神經(jīng)元具有保護(hù)作用。研究者相繼開(kāi)發(fā)了多巴胺受體激動(dòng)劑(溴隱亭、吡貝地爾、普拉克索)、多巴胺釋放劑(金剛烷胺)和單胺氧化酶B抑制劑(司來(lái)吉蘭)等，均有其應(yīng)用瓶頸，或單獨(dú)使用效果差，需佐助左旋多巴，或不良反應(yīng)大，或適用人群有限[10]。因此，毒副作用小、適用人群廣的新的抗PD藥物仍需要繼續(xù)摸索。

五虎追風(fēng)散出自《晉男史傳恩家傳方》，主要用于祛風(fēng)止痙，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其在治療PD方面也有積極作用[11,12]。原方五虎追風(fēng)散由蟬蛻、天南星、天麻、全蝎、僵蠶、朱砂組成，具有祛瘀化痰、熄風(fēng)止痙的功效，主治破傷風(fēng)、中風(fēng)恢復(fù)期等神經(jīng)系統(tǒng)病變。既往臨床研究已證實(shí)，五虎追風(fēng)散在PD、神經(jīng)痛、各種中風(fēng)后遺癥及小兒痙癥中均取得了良好的應(yīng)用效果。也有研究指出，五虎追風(fēng)散能夠緩解左旋多巴誘發(fā)的異動(dòng)癥，佐助左旋多巴用藥可降低藥物不良反應(yīng)發(fā)生率。我們認(rèn)為五虎追風(fēng)散雖重治其標(biāo)，但對(duì)其發(fā)病之本不能兼顧，所以在五虎追風(fēng)散的基礎(chǔ)上去有毒性的朱砂而加入壯藥大地棕根成為加味五虎追風(fēng)散。方中蟬蛻既能祛外風(fēng)，又能熄內(nèi)風(fēng)，而解痙止顫；天南星苦溫辛烈，善能開(kāi)泄以祛風(fēng)解痙，為專治經(jīng)絡(luò)風(fēng)痰的要藥；全蝎、天麻、僵蠶活血化瘀、平熄內(nèi)風(fēng)而止顫；壯藥大地棕根補(bǔ)腎祛風(fēng)行血，全方配伍精煉全面，標(biāo)本兼治，共奏補(bǔ)腎活血、化痰通絡(luò)熄風(fēng)之效。

在自噬相關(guān)分子中，Beclin 1是形成自噬體的必需分子，也是自噬體成熟的重要標(biāo)志物[13]。LC3B有LC3Ⅰ和LC3Ⅱ兩種形式，靜息狀態(tài)下以LC3Ⅰ的形式存在，當(dāng)自噬啟動(dòng)后，LC3Ⅰ在自噬相關(guān)蛋白ATG7、ATG12等的作用下與磷脂酰乙醇胺共價(jià)結(jié)合，形成LC3Ⅱ，并結(jié)合在自噬體膜上，因此LC3ⅡI/LC3Ⅰ可以作為衡量自噬活性的指標(biāo)[14]。本研究顯示，與對(duì)照組比較，模型組Beclin 1、LC3B蛋白表達(dá)升高，說(shuō)明PD大鼠啟動(dòng)了細(xì)胞自噬作用來(lái)緩解黑質(zhì)神經(jīng)元和線粒體損傷；與模型組比較，中藥組和西藥組均能夠提高細(xì)胞自噬活性，協(xié)助機(jī)體發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用；另外本研究還發(fā)現(xiàn)，加味五虎追風(fēng)散對(duì)自噬的調(diào)控強(qiáng)度不如西羅莫司，但對(duì)癲癇病理和線粒體活性的改善效果卻與西羅莫司相仿，說(shuō)明加味五虎追風(fēng)散還能夠通過(guò)自噬以外的機(jī)制來(lái)發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。

既往有研究證實(shí)，線粒體損傷是PD的重要原因，腦組織約占全身體重的2%，耗氧量卻占人體的20%左右。線粒體是細(xì)胞能量代謝和活性氧產(chǎn)生的中心，負(fù)責(zé)機(jī)體細(xì)胞和組織的ATP供應(yīng)。PD患者黑質(zhì)和杏仁核區(qū)域存在大量水腫和壞死的線粒體，這些線粒體的堆積導(dǎo)致能量代謝異常和活性氧供應(yīng)障礙，從而促進(jìn)了多巴胺能神經(jīng)元的損傷與死亡。及時(shí)清除缺損線粒體是保護(hù)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元和抑制PD病情發(fā)展的一條重要途徑，而細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞降解自身老化、受損細(xì)胞器，并將其用于重新供能的關(guān)鍵生物學(xué)行為。mTOR是自噬的一個(gè)抑制因子，西羅莫司相當(dāng)于自噬啟動(dòng)劑。在缺血缺氧狀態(tài)下，mTOR對(duì)ATP極為敏感，一旦ATP水平出現(xiàn)較大幅度的下降，mTOR便會(huì)受到抑制，引起自噬增強(qiáng)，以滿足機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下的能量和活性氧供應(yīng)。本研究顯示，與對(duì)照組比較，模型組RCR和ATP酶合成能力均降低；與模型組比較，加味五虎追風(fēng)散和西羅莫司的干預(yù)均能夠改善線粒體功能和ATP合成酶活力。

總之，加味五虎追風(fēng)散能夠通過(guò)線粒體-ATP-mTOR途徑促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元自噬，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)加味五虎追風(fēng)散還能夠通過(guò)自噬以外的途徑來(lái)發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用，其藥理機(jī)制還具有較大的挖掘空間。