血清miR-1、miR-21在冠心病患者PCI術(shù)后病變冠狀動(dòng)脈再狹窄預(yù)測(cè)中的應(yīng)用

王紅，任明，樊世明，沈有錄，趙瓊瓊

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院，西寧 810001)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(簡(jiǎn)稱冠心病)是指冠狀動(dòng)脈血管粥樣硬化病變致血管腔狹窄或阻塞，導(dǎo)致心肌缺血缺氧、甚至壞死而引起的心臟病[1]。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(PCI)是目前臨床治療冠心病的重要手段，但術(shù)后再狹窄發(fā)生率為10% ～20%，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[2]。PCI術(shù)后冠狀動(dòng)脈造影檢查或血管內(nèi)超聲檢查是確診冠狀動(dòng)脈再狹窄的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是此時(shí)確診再狹窄已經(jīng)延誤治療最佳時(shí)機(jī)，也可能因二次手術(shù)而造成重大疾病負(fù)擔(dān)。尋找靈敏度高、特異度好的標(biāo)志物早期預(yù)測(cè)PCI術(shù)后冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張部位再狹窄，對(duì)降低再狹窄發(fā)生率及提高患者預(yù)后有重要意義。微小RNA(miRNA)是主要在真核生物中表達(dá)的單鏈小分子RNA，不編碼蛋白質(zhì)，主要介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等病理生理過程[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，miRNA異常表達(dá)可能介導(dǎo)了缺血性心臟病發(fā)病過程。miR-1和miR-21屬miRNA家族成員，兩者與惡性腫瘤[5,6]發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而關(guān)于其與冠心病PCI術(shù)后冠脈再狹窄的關(guān)系目前鮮有研究。本研究通過檢測(cè)冠心病患者PCI術(shù)后血清miR-1、miR-21，并探討其在術(shù)后病變冠狀動(dòng)脈再狹窄預(yù)測(cè)中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年1月～2017年12月青海大學(xué)附屬醫(yī)院收治的103例行PCI治療后6個(gè)月內(nèi)的冠心病患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床癥狀、超聲心動(dòng)圖結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢查等確診為冠心病，并符合冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；②PCI術(shù)后再狹窄的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：經(jīng)血管內(nèi)超聲檢查提示患者原擴(kuò)張部位支架內(nèi)以及節(jié)段內(nèi)的血管腔直徑縮小超過50%。排除標(biāo)準(zhǔn)：①孕產(chǎn)婦以及哺乳期的婦女；②肝、腎功能障礙者；③急、慢性炎癥性疾??；④自身免疫性疾病；⑤冠狀動(dòng)脈多支病變、血管慢性堵塞再通患者；⑥泵衰竭Killip Ⅲ級(jí)以及Ⅲ級(jí)以上的患者；⑦惡性腫瘤患者。根據(jù)PCI術(shù)后6個(gè)月患者血管內(nèi)超聲結(jié)果提示是否存在再狹窄將所有患者分為兩組，再狹窄組42例，男25例，女17例；年齡37～79(56.23±8.91)歲；病變部位在前降支17例，右冠脈20例，回旋支5例。未狹窄組61例，男38例，女23例；年齡41～75(58.12±8.25)歲；病變部位在前降支20例，右冠脈29例，回旋支12例。另選30例同期健康體檢者作為對(duì)照組，男19例，女11例；年齡35～81(56.98±9.05)歲。兩組一般資料無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性。本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，研究對(duì)象及家屬均在知情同意書上簽字。

1.2 血清miR-1、miR-21檢測(cè) 收集各組清晨空腹肘靜脈血5 mL，以3 000 r/min的速度離心10 min，棄去血漿溶液后再以3 000 r/min的速度離心10 min，留取上清液裝于未含RNA酶的試管中，置于-80 ℃環(huán)境下保存。根據(jù)RNAisoTMPlus試劑盒說(shuō)明提取總RNA，以異丙醇沉淀法濃縮RNA后采用NanoDrop?ND-1000對(duì)RNA的濃度進(jìn)行檢測(cè)，并評(píng)估其純度。RT-PCR法檢測(cè)miR-1、miR-21，嚴(yán)格按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行相關(guān)操作，反應(yīng)體系20 μL，包括2×Taqman通用的PCR預(yù)混物10 μL，20×miRNA特異度引物1 μL，cDNA 1.33 μL，蒸餾水7.67 μL。反應(yīng)條件：95 ℃變性、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共循環(huán)50次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物序列，miR-1：5′-AGCG-GCAGAATCAGGAGTA-3′，5′-GAGGACCTTGGAGGCAG-AC-3′，350 bp；miR-21：5′-GCCCATCCTCAAATACAAAG-C-3′，5′-GGTCCYGAACACAAAATG AGC-3′，335 bp；β-actin：5′-CTCATTGACAATGGTGAT-3′，5′-ACCGAGCGC-GGCTACAGC-3′，650 bp。采用2-ΔΔCt表示miR-1、miR-21的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 血管內(nèi)超聲檢查 PCI術(shù)后定期門診隨訪，并在PCI術(shù)后6個(gè)月對(duì)所有患者行血管內(nèi)超聲檢查，檢測(cè)儀器為Boston Scientific Clearview血管內(nèi)超聲儀。具體步驟：肝素抗凝后將硝酸甘油注入冠狀動(dòng)脈內(nèi)，超聲探頭為2.5 F，頻率為40 MHz，到達(dá)動(dòng)脈狹窄病變處遠(yuǎn)段后將探頭導(dǎo)管以0.5 mm/s的速度回撤，分別測(cè)量支架內(nèi)病變、病變近端和遠(yuǎn)段10 mm處各3次。根據(jù)美國(guó)心臟病學(xué)院血管內(nèi)超聲測(cè)定指南[9]測(cè)量外彈力膜內(nèi)橫截面積(EEM)、最小管腔面積(MLA)、斑塊面積(PLA)，并計(jì)算狹窄程度(RS%)。

2 結(jié)果

2.1 各組血清miR-1、miR-21表達(dá)比較 結(jié)果見表1。

表1 各組血清miR-1、miR-21表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與未狹窄組比較，△P<0.05。

2.2 兩組血管內(nèi)超聲檢查相關(guān)指標(biāo)比較 結(jié)果見表2。

表2 兩組血管內(nèi)超聲檢查相關(guān)指標(biāo)比較

注：與未狹窄組比較，*P<0.05。

2.3 血清miR-1、miR-21與血管內(nèi)超聲檢查相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性 狹窄組患者血清miR-1與miR-21表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.762，P<0.05)，miR-1與EEM、MLA呈正相關(guān)(r=0.611、0.572，P均<0.05)，miR-1與PLA、RS呈負(fù)相關(guān)(r=-0.538、-0.615，P<0.05)；血清miR-21表達(dá)與EEM、MLA呈負(fù)相關(guān)(r=-0.593、-0.624，P均<0.05)，與PLA、RS呈正相關(guān)(r=0.509、0.637，P均<0.05)。未狹窄組患者血清miR-1與miR-21表達(dá)無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05)，miR-1、miR-21與EEM、MLA、PLA、RS無(wú)相關(guān)(P均>0.05)。

2.4 血清miR-1、miR-21預(yù)測(cè)冠心病患者PCI術(shù)后再狹窄的價(jià)值 當(dāng)miR-1的AUC為0.770(95%CI0.676～0.864)，此時(shí)最佳截?cái)嘀禐?.36，診斷再狹窄的靈敏度、特異度分別為0.82、0.87，準(zhǔn)確性為0.83；當(dāng)miR-21的AUC為0.750(95%CI0.648～0.852)，此時(shí)最佳截?cái)嘀禐?.79，診斷再狹窄的靈敏度、特異度分別為0.79、0.85，準(zhǔn)確性為0.80；miR-1聯(lián)合miR-21的AUC為0.928(95%CI0.877～0.980)，診斷再狹窄的靈敏度、特異度分別為0.89、0.93，準(zhǔn)確性為0.87。詳見圖1。

3 討論

近年來(lái)，隨著社會(huì)節(jié)奏的加快及生活壓力的增大，冠心病發(fā)病率逐漸增加，并呈年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人們的健康和生命質(zhì)量[10]。PCI是目前臨床治療冠心病的重要手段，它能有效減少不穩(wěn)定性心絞痛患者病死率，提高非致死性心肌梗死、難治性心絞痛患者預(yù)后[11]。再狹窄是指PCI術(shù)后6個(gè)月行冠狀動(dòng)脈造影發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈血管管腔直徑縮小超過50%，其形成機(jī)制主要是血管內(nèi)膜過度增殖[12]。文獻(xiàn)[13]報(bào)道，PCI過程易損傷動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起炎癥反應(yīng)、血栓、血管內(nèi)膜異常增殖等，進(jìn)而形成血管新生內(nèi)膜、血管重塑等，最終導(dǎo)致血管再狹窄。冠心病患者PCI術(shù)后如何減少擴(kuò)張部位再狹窄，提高預(yù)后已成為臨床研究熱點(diǎn)。

圖1 血清miR-1、miR-21預(yù)測(cè)冠心病患者PCI術(shù)后再狹窄的ROC曲線

miRNA長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸，是由內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈小分子RNA，它通過互補(bǔ)配對(duì)的方式與3′端片段特異度結(jié)合而抑制mRNA的正常合成，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)[14]。研究[15]表明，miRNA參與了心血管疾病、惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。Wang等[16]認(rèn)為，miR-1、miR-208、miR-133在急性心肌梗死患者中表達(dá)異常，證實(shí)miRNA可作為心肌損傷的重要標(biāo)志物。Meder等[17]通過研究miR-145、miR-30c與肌鈣蛋白的關(guān)系證實(shí)miRNA介導(dǎo)了心臟疾病的發(fā)病過程。miR-1為肌細(xì)胞特異度miRNA，其表達(dá)上調(diào)對(duì)心室肌細(xì)胞的增殖具有抑制作用[18]。張亦等[19]發(fā)現(xiàn)，miR-1在動(dòng)脈粥樣硬化閉塞癥、行血管重建術(shù)后再狹窄患者病變的動(dòng)脈血管中表達(dá)下調(diào)，再狹窄患者尤其明顯。Jiang等[20]認(rèn)為，miR-1通過表達(dá)上調(diào)而調(diào)控主動(dòng)脈收縮型血管平滑肌細(xì)胞中血管平滑肌細(xì)胞的收縮能力和增殖水平。miR-21屬于miRNA家族成員，其在大鼠頸動(dòng)脈球囊血管成形術(shù)后表達(dá)上調(diào)，而抑制miR-21表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡增加[21]。另有研究[22]也發(fā)現(xiàn)，miR-21異常表達(dá)參與了心臟疾病的發(fā)生過程。

本研究顯示，再狹窄組、未狹窄組患者血清miR-1表達(dá)低于對(duì)照組、miR-21表達(dá)高于對(duì)照組，再狹窄組血清miR-1表達(dá)低于未狹窄組、miR-21水平高于未狹窄組，提示miR-1、miR-21與冠心病患者PCI術(shù)后再狹窄有關(guān)，可能是因?yàn)閙iR-1、miR-21異常表達(dá)促進(jìn)冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)膜細(xì)胞的異常增殖，導(dǎo)致血管新生內(nèi)膜形成和血管重塑，最終發(fā)生血管再狹窄現(xiàn)象。本研究還顯示，再狹窄組患者EEM、MLA低于未狹窄組，PLA、RS高于未狹窄組，提示EEM、MLA、PLA、RS是評(píng)估動(dòng)脈血管腔狹窄程度的重要指標(biāo)。

相關(guān)性分析顯示，狹窄組患者血清miR-1與miR-21水平呈負(fù)相關(guān)；miR-1與EEM、MLA呈正相關(guān)，與PLA、RS呈負(fù)相關(guān)；miR-21與EEM、MLA呈負(fù)相關(guān)，與PLA、RS呈正相關(guān)；提示miR-1、miR-21通過協(xié)同作用促進(jìn)冠心病患者PCI術(shù)后再狹窄的發(fā)生。AUC顯示，miR-1、miR-21對(duì)冠心病患者PCI術(shù)后再狹窄具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，且聯(lián)合檢測(cè)能明顯提高預(yù)測(cè)價(jià)值。

總之，miR-1、miR-21異常表達(dá)與冠心病患者PCI術(shù)后再狹窄密切相關(guān)，早期聯(lián)合檢測(cè)能有效預(yù)測(cè)PCI術(shù)后再狹窄，可為臨床制定針對(duì)性干預(yù)方案，提高患者預(yù)后提供重要參考。