• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    紫外線誘導(dǎo)的 p53表達(dá)狀態(tài)不同的人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中差異表達(dá)磷酸化蛋白的DNA損傷修復(fù)通路分析△

    2018-11-15 00:44:38王海娟李春曉王婷張競堯南鵬王勁松張雪燕林晨錢海利
    癌癥進(jìn)展 2018年11期
    關(guān)鍵詞:紫外線磷酸化結(jié)腸癌

    王海娟,李春曉,王婷,張競堯,南鵬,王勁松,張雪燕,林晨,錢海利

    國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京1000210

    蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要內(nèi) 容,在酶和其他重要功能分子活性的發(fā)揮、第二信使傳遞和酶的級聯(lián)反應(yīng)中起重要作用。細(xì)胞內(nèi)的許多蛋白通過磷酸化來行使DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯等功能。蛋白質(zhì)磷酸化網(wǎng)絡(luò)精細(xì)調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)對的各種應(yīng)激過程,例如,當(dāng)細(xì)胞暴露于紫外線損傷后,細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)蛋白被磷酸化激活,修復(fù)DNA;細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白被激活,細(xì)胞周期發(fā)生阻滯;如果DNA受損嚴(yán)重,有修復(fù)缺陷,細(xì)胞常通過p53依賴性凋亡發(fā)生凋亡[1-2]。p53是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)過程中最經(jīng)典的分子,多種基因毒性或非基因毒性應(yīng)激信號可以使p53的N端或C端的不同位點(diǎn)發(fā)生磷酸化,修飾后的p53形成有生物學(xué)活性的四聚體,與靶基因上的p53反應(yīng)元件結(jié)合,控制下游靶基因的表達(dá),從而引起細(xì)胞生長阻滯、凋亡,或細(xì)胞適應(yīng)DNA損傷而存活[3-4]。不同p53表達(dá)狀態(tài)的細(xì)胞在受到紫外線照射后所發(fā)生磷酸化的蛋白不同,其發(fā)生的DNA損傷修復(fù)途徑是否有差異還不甚清楚。為探討p53野生型及p53缺失型的人結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng)紫外線照射后磷酸化蛋白質(zhì)組的表達(dá)差異,本研究將紫外線照射后的人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行磷酸化蛋白質(zhì)譜檢測,將兩組樣品中重疊的差異表達(dá)磷酸化蛋白及特異的差異表達(dá)磷酸化蛋白分別進(jìn)行基因本體論(gene ontology,GO)功能富集分析,繼而用STRⅠNG數(shù)據(jù)庫軟件分析DNA損傷修復(fù)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò),最后采用Reactome軟件分別繪制HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-中DNA損傷修復(fù)通路,以期為闡明p53調(diào)控DNA損傷修復(fù)的機(jī)制提供線索。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞

    本實(shí)驗(yàn)室保存的人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-采用含10%胎牛血清(購自Uruguay的Thermo Fisher Scientific公司)、100 U/ml青霉素和100 ug/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(購自北京細(xì)工生物科技有限公司)培養(yǎng)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。

    1.2 細(xì)胞處理過程

    將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中,貼壁過夜后棄去培養(yǎng)基,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌3次,每次30 s,盡量吸干培養(yǎng)皿中殘留的PBS,將培養(yǎng)皿置于紫外線燈下64 cm處照射30 s,相當(dāng)于4.4 MJ/cm2強(qiáng)度。細(xì)胞重新加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),4 h后提取總蛋白,同時提取未經(jīng)紫外線照射的細(xì)胞總蛋白作為對照。采用磷酸化蛋白純化試劑盒PhosphoProtein Purification Ki(t購自美國QiagenⅠnc公司)分離、濃縮、純化磷酸化蛋白。

    1.3 蛋白質(zhì)譜檢測樣品信息

    樣本:a.HCT116 p53-/-0 min;b.HCT116 p53-/-4 h;c.HCT116 p53+/+0 min;d.HCT116 p53+/+4 h。將每個樣品不少于200 ug磷酸化蛋白送至上海中科新生命科技有限公司進(jìn)行結(jié)腸癌細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜分析。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

    首先對質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)的蛋白ⅠD進(jìn)行轉(zhuǎn)換,并將樣本間的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化,然后分別比較樣品a、b之間及樣品c、d之間的差異表達(dá)蛋白,并對兩組結(jié)果進(jìn)行一致性分析。將兩組共同的差異表達(dá)磷酸化蛋白與不同的差異表達(dá)磷酸化蛋白分別進(jìn)行GO富集分析,然后用STRⅠNG數(shù)據(jù)庫軟件分析DNA損傷修復(fù)相關(guān)的差異表達(dá)磷酸化蛋白的互作網(wǎng)絡(luò),最后采用Reactome軟件分別繪制HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-細(xì)胞中DNA損傷修復(fù)通路。

    2 結(jié)果

    2.1 紫外線照射前后HCT116 p53+/+和HCT116 p 53-/-細(xì)胞中差異表達(dá)的磷酸化蛋白

    在所檢測到的301個磷酸化蛋白中,HCT116p53-/-在紫外線照射前后差異表達(dá)的磷酸化蛋白有210個,HCT116 p53+/+在紫外線照射前后差異表達(dá)的磷酸化蛋白有148個,僅在HCT116 p53+/+中發(fā)生差異表達(dá)的磷酸化蛋白有91個,僅在HCT116 p53-/-中發(fā)生差異表達(dá)的磷酸化蛋白有153個。HCT116 p53-/-與HCT116 p53+/+差異表達(dá)的磷酸化蛋白中有57個重疊,其中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)趨勢一致的磷酸化蛋白有39個,這些共同的差異磷酸化蛋白分別是AKAP12、ATF2、HCFC1、HN1、TJP3、KⅠ-AA1429、NUP153、PGRMC1、SEC22B、STMN1、C11orf84、CD44、EPHA2、FOXK2、HSF1、HSPB1、MED12、MKⅠ67ⅠP、RBM25、RRP1B、SMARCD2、TPR、TMPO、C17orf85、DKC1、CDC2L2、MTA1、MYH9、 SRRM2、 MDC1、 MED13L、 SRRM1、NOP56、NCOR2、NUP210、RPS3、SGPP1、NUMA1和RBM39。

    2.2 紫外線照射后 p53表達(dá)狀態(tài)不同的HCT116細(xì)胞中的磷酸化蛋白的功能富集

    為闡明紫外線照射后依賴p53及不依賴p53的磷酸化蛋白的功能,本研究首先對HCT116 p53-/-與HCT116 p53+/+兩組差異表達(dá)的磷酸化蛋白中交叉的表達(dá)趨勢一致的39個蛋白進(jìn)行了GO功能富集分析,發(fā)現(xiàn)無論p53野生型還是p53缺失型HCT116細(xì)胞,在紫外線照射后,表達(dá)明顯改變的磷酸化蛋白功能均富集在非編碼RNA加工、大分子加工、mRNA加工、細(xì)胞周期調(diào)控等方面(圖1)。

    在p53表達(dá)缺失的HCT116細(xì)胞中,紫外線照射后特異的差異表達(dá)的磷酸化蛋白功能主要富集在mRNA加工、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞黏附、DNA解螺旋等方面;而在p53野生型的HCT116細(xì)胞中,紫外線照射后特異的差異表達(dá)的磷酸化蛋白功能主要富集在染色質(zhì)修復(fù)與組蛋白修飾、DNA損傷修復(fù)、蛋白質(zhì)泛素化修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面(圖2)。

    圖1 紫外線照射后 p53表達(dá)狀態(tài)不同的HCT116細(xì)胞中共同的差異表達(dá)的磷酸化蛋白功能富集分析

    2.3 紫外線照射后 p53表達(dá)狀態(tài)不同的HCT116細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的通路網(wǎng)絡(luò)

    為進(jìn)一步分析紫外線照射后p53表達(dá)狀態(tài)不同的HCT116細(xì)胞DNA損傷修復(fù)通路的差異,本研究將兩種細(xì)胞中紫外線照射前后差異表達(dá)的DNA損傷修復(fù)相關(guān)的磷酸化蛋白錄入STRⅠNG數(shù)據(jù)庫中,對兩組中重復(fù)出現(xiàn)的磷酸化蛋白進(jìn)行去重處理,繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖,最后采用Reactome軟件分別繪制HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-細(xì)胞中DNA損傷修復(fù)通路。HCT116 p53+/+細(xì)胞在紫外線照射后特異磷酸化的DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白主要有DDB2、YY1和SMARCA5,主要參與全基因組核苷酸切除修復(fù)的DNA損傷識別(DNA damage recognition in GG-NER)。HCT116 p53-/-細(xì)胞在紫外線照射后特異磷酸化的DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白為NBN、TP53BP1、MDC1,主要參與非同源末端連接(non-homologous end joining,NHEJ)。兩種細(xì)胞中共同表達(dá)的差異磷酸化蛋白有CD44、RPS3、EPHA2、ATF2和TPR(圖3)。由此可見,在p53表達(dá)正常的情況下,紫外線導(dǎo)致的胸腺嘧啶二聚體會立即磷酸化DDB2、YY1等蛋白,識別DNA損傷位點(diǎn),細(xì)胞進(jìn)行全基因組核苷酸切除修復(fù)。而在p53表達(dá)缺失的情況下,紫外線照射有可能導(dǎo)致更嚴(yán)重的DNA損傷,細(xì)胞中NBN、TP53BP1、MDC1蛋白磷酸化,參與的DNA損傷修復(fù)通路主要為NHEJ。這個過程有可能造成基因組的片段缺失,導(dǎo)致細(xì)胞的基因組不穩(wěn)定(圖4)。

    圖2 紫外線照射后 p53表達(dá)狀態(tài)不同的HCT116細(xì)胞中特異的差異表達(dá)的磷酸化蛋白功能富集分析

    圖3 DNA損傷修復(fù)相關(guān)磷酸化蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)

    圖4 p53表達(dá)狀態(tài)不同的HCT116細(xì)胞中磷酸化蛋白參與的DNA損傷修復(fù)通路

    3 討論

    蛋白磷酸化/去磷酸化普遍存在于各種細(xì)胞活動過程中,調(diào)節(jié)蛋白的活性或生物學(xué)功能。磷酸化激酶包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和酪氨酸蛋白激酶兩大類,它不僅通過影響許多生化酶的活性而參與糖、脂肪和蛋白質(zhì)等物質(zhì)代謝,而且參與各種信號傳遞,影響轉(zhuǎn)錄因子活性及其核轉(zhuǎn)位,調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。本研究結(jié)果表明p53野生型的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116在紫外線照射前后有148個磷酸化蛋白的表達(dá)水平發(fā)生明顯改變,而p53表達(dá)缺失的細(xì)胞中有210個差異表達(dá)的磷酸化蛋白。這提示在野生型p53存在的情況下細(xì)胞受到紫外線照射后磷酸化狀態(tài)的改變更有秩序,顯著改變的磷酸化蛋白數(shù)目少,組蛋白和其他蛋白有組織地出現(xiàn)泛素化等修飾。

    多種因素導(dǎo)致的DNA損傷在修復(fù)過程中也離不開蛋白質(zhì)的磷酸化,DNA修復(fù)是細(xì)胞保護(hù)基因組完整性的一個重要功能系統(tǒng),機(jī)體DNA修復(fù)能力的降低與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)在p53野生型的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中,紫外線照射后細(xì)胞產(chǎn)生快速的應(yīng)激調(diào)控,DDB2、YY1及SMARCA5磷酸化水平明顯改變。有研究表明,內(nèi)源性YY1的失活增強(qiáng)了p53的積累以及p53靶基因在DNA損傷中的表達(dá),并且YY1的失活使細(xì)胞對DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更敏感。YY1可能是p53對基因毒性應(yīng)激反應(yīng)的重要負(fù)調(diào)節(jié)因子[5]。DDB2最初被鑒定為核苷酸切除修復(fù)中的DNA損傷識別因子,其參與紫外線誘導(dǎo)的DNA損傷的修復(fù)[6]。在全基因組核苷酸切除修復(fù)(global genome nucleotide excision repair,GG-NER)過程中,DDB2對基因組轉(zhuǎn)錄失活區(qū)域以及非轉(zhuǎn)錄鏈的修復(fù)應(yīng)答發(fā)揮重要的功能。有研究表明,DDB2通過阻滯Wnt信號通路從而抑制結(jié)腸癌的發(fā)展[7],而且其在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)可以作為預(yù)測患者放射敏感性的生物標(biāo)志物[8]。SMARCA5不僅是SMARC基因亞家族的一員,而且還是染色質(zhì)重塑的ATPase亞單位。在DNA發(fā)生損傷時,SMARCA5被募集到DNA損傷位點(diǎn),促進(jìn)DNA損傷修復(fù)[9]。

    在p53表達(dá)缺失的情況下,紫外線照射不僅導(dǎo)致嘧啶二聚體產(chǎn)生,細(xì)胞還可能發(fā)生更嚴(yán)重的DNA損傷。本研究表明,在p53表達(dá)缺失的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中,紫外線照射后TP53BP1、MDC1和NBN的磷酸化水平明顯改變,這些差異表達(dá)的磷酸化蛋白參與的DNA損傷修復(fù)通路主要為NHEJ。NHEJ是真核生物細(xì)胞在不依賴DNA同源性的情況下,為了避免DNA或染色體斷裂導(dǎo)致的DNA降解或?qū)?xì)胞存活的影響,將兩個DNA斷端強(qiáng)行連接在一起的DNA雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制。TP53BP1被稱為DNA損傷反應(yīng)的介質(zhì)和DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand break,DSB)修復(fù)的調(diào)節(jié)劑[10]。MDC1蛋白是DNA損傷后檢查點(diǎn)激活和后續(xù)DNA修復(fù)的核心參與者。磷酸化MDC1在不依賴于DNA損傷應(yīng)答途徑的基因組穩(wěn)定的維持性中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[11]。組蛋白伴侶抗沉默 因 子1a(anti-silencing function 1a,ASF1a)與MDC1相互作用并被募集到DNA雙鏈斷裂位點(diǎn)以促進(jìn)磷酸化的ATM與MDC1的相互作用以及MDC1的磷酸化,促進(jìn)NHEJ,使細(xì)胞對DNA雙鏈斷裂更耐受[12]。ATM蛋白激酶是哺乳動物細(xì)胞中DNA雙鏈斷裂反應(yīng)的核心。細(xì)胞經(jīng)射線照射后,二聚體ATM在Ser 1981處經(jīng)歷自磷酸化并解離成活性單體。有研究表明nibrin通過與ATM相互作用促使ATM活化[13]。

    p53在DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用,但有一些DNA損傷修復(fù)蛋白的磷酸化不依賴于p53,本研究發(fā)現(xiàn)RPS3、EPHA2、TPR、ATF2和CD44的磷酸化水平在紫外線照射HCT116 p53-/-與HCT116 p53+/+兩組細(xì)胞后均發(fā)生明顯改變,提示這些蛋白的磷酸化廣泛參與DNA損傷修復(fù),且不受p53影響。RPS3作為40S核糖體亞基的組分參與翻譯過程及DNA損傷的加工,起到損傷DNA核酸內(nèi)切酶的作用。有研究表明,RPS3的核積累導(dǎo)致DNA修復(fù)活性在一定程度上增加,從而維持神經(jīng)元的存活狀態(tài)。減弱AKT介導(dǎo)的RPS3磷酸化可加速凋亡細(xì)胞的死亡并嚴(yán)重?fù)p害RPS3的核轉(zhuǎn)位[14]。EPHA2在野生型和突變型p53的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)中均可激活細(xì)胞凋亡程序,并且可被caspase 8抑制劑阻斷[15]。在黑色素瘤細(xì)胞中敲降A(chǔ)TR可顯著降低活性轉(zhuǎn)錄因子-2(ATF2)的磷酸化水平,并提高存活基因Sox10的表達(dá),導(dǎo)致黑色素瘤細(xì)胞死亡所需的DNA損傷應(yīng)答閾值顯著提高[16]。CD44是一種糖蛋白,當(dāng)細(xì)胞DNA損傷時,CD44可以穩(wěn)定ERBB2并共激活p-p38表達(dá),然后通過同源重組(homologous recombination,HR)途徑促進(jìn)DNA損傷修復(fù),最終有助于提高細(xì)胞對放射治療的抗性[17]。

    綜上所述,p53在紫外線照射誘導(dǎo)的蛋白磷酸化中發(fā)揮重要作用,p53狀態(tài)不同的HCT116細(xì)胞經(jīng)紫外線照射后發(fā)生的DNA損傷修復(fù)途徑有可能不同。

    猜你喜歡
    紫外線磷酸化結(jié)腸癌
    紫外線指數(shù),提醒你保護(hù)皮膚
    看不見的光——紅外線與紫外線
    讓人又愛又恨的紫外線
    ITSN1蛋白磷酸化的研究進(jìn)展
    跟蹤導(dǎo)練(五)6
    MicroRNA-381的表達(dá)下降促進(jìn)結(jié)腸癌的增殖與侵襲
    結(jié)腸癌切除術(shù)術(shù)后護(hù)理
    MAPK抑制因子對HSC中Smad2/3磷酸化及Smad4核轉(zhuǎn)位的影響
    組蛋白磷酸化修飾與精子發(fā)生
    遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:59:01
    中西醫(yī)結(jié)合治療晚期結(jié)腸癌78例臨床觀察
    欧美在线一区亚洲| 男男h啪啪无遮挡| 欧美在线黄色| 成人精品一区二区免费| 亚洲色图综合在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 岛国毛片在线播放| 国产精品香港三级国产av潘金莲| aaaaa片日本免费| 女人久久www免费人成看片| 激情在线观看视频在线高清 | 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 69精品国产乱码久久久| 另类亚洲欧美激情| 老司机在亚洲福利影院| 极品人妻少妇av视频| 日韩三级视频一区二区三区| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 亚洲成av片中文字幕在线观看| 三上悠亚av全集在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 黄色丝袜av网址大全| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产免费现黄频在线看| 欧美在线黄色| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 人妻久久中文字幕网| 午夜精品在线福利| 亚洲中文av在线| 国产xxxxx性猛交| 999久久久精品免费观看国产| 精品久久久精品久久久| 中文字幕最新亚洲高清| 国产国语露脸激情在线看| 满18在线观看网站| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 少妇 在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 成熟少妇高潮喷水视频| 69精品国产乱码久久久| 久久久久久久精品吃奶| 国产精品免费一区二区三区在线 | 老汉色∧v一级毛片| 高清欧美精品videossex| 欧美大码av| 女警被强在线播放| 夜夜爽天天搞| 91成年电影在线观看| 精品国产美女av久久久久小说| 日韩免费av在线播放| 激情在线观看视频在线高清 | 夫妻午夜视频| 午夜精品在线福利| 亚洲av熟女| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产精品一区二区精品视频观看| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 老司机午夜十八禁免费视频| 中国美女看黄片| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 高清欧美精品videossex| 看免费av毛片| 欧美中文综合在线视频| 日本wwww免费看| 国产成人精品无人区| 视频区欧美日本亚洲| 在线免费观看的www视频| 亚洲第一av免费看| 少妇粗大呻吟视频| 成年版毛片免费区| 精品高清国产在线一区| 一本综合久久免费| √禁漫天堂资源中文www| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产精品国产高清国产av | 亚洲男人天堂网一区| 久久狼人影院| 国产精品影院久久| 国产一区二区三区视频了| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 国产精品久久视频播放| 十八禁人妻一区二区| 99久久国产精品久久久| 91国产中文字幕| 欧美日韩乱码在线| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 国产在线一区二区三区精| 757午夜福利合集在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人 | 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 欧美精品av麻豆av| 女人被狂操c到高潮| 欧美日韩福利视频一区二区| 1024视频免费在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 一区二区日韩欧美中文字幕| 久久精品国产a三级三级三级| ponron亚洲| 成人永久免费在线观看视频| 成人三级做爰电影| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产免费av片在线观看野外av| 中文字幕制服av| 国产精品久久久久成人av| 老司机午夜福利在线观看视频| 超色免费av| 国产精华一区二区三区| 99香蕉大伊视频| cao死你这个sao货| 成人亚洲精品一区在线观看| 中文字幕制服av| 婷婷成人精品国产| 国产精品免费视频内射| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 女人精品久久久久毛片| 人人妻人人澡人人看| 国产欧美日韩一区二区精品| 视频在线观看一区二区三区| 久久久久久久精品吃奶| 大型av网站在线播放| 黄频高清免费视频| 黑丝袜美女国产一区| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 新久久久久国产一级毛片| 一边摸一边做爽爽视频免费| 日韩免费高清中文字幕av| 久久ye,这里只有精品| 午夜免费观看网址| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久精品国产综合久久久| 色综合婷婷激情| 99久久99久久久精品蜜桃| 一级毛片高清免费大全| 看片在线看免费视频| 国产1区2区3区精品| 一级毛片女人18水好多| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲情色 制服丝袜| 国产aⅴ精品一区二区三区波| √禁漫天堂资源中文www| 黑人猛操日本美女一级片| 成人18禁在线播放| 国产片内射在线| 国产片内射在线| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 色综合欧美亚洲国产小说| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 热99re8久久精品国产| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 在线观看免费午夜福利视频| 免费在线观看黄色视频的| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 久久这里只有精品19| 国产区一区二久久| 国产成人欧美在线观看 | 欧美+亚洲+日韩+国产| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久久久精品免费免费高清| 人妻 亚洲 视频| 精品一品国产午夜福利视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久中文看片网| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 精品乱码久久久久久99久播| 深夜精品福利| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲男人天堂网一区| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲,欧美精品.| 欧美黄色片欧美黄色片| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美激情极品国产一区二区三区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 一区福利在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧美丝袜亚洲另类 | 天堂中文最新版在线下载| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久香蕉激情| 亚洲精品乱久久久久久| 久久午夜综合久久蜜桃| 午夜91福利影院| 久久久久久久久免费视频了| 窝窝影院91人妻| 成人永久免费在线观看视频| 91精品国产国语对白视频| 老司机亚洲免费影院| 丰满饥渴人妻一区二区三| 大型黄色视频在线免费观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 波多野结衣av一区二区av| 精品人妻1区二区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 一二三四社区在线视频社区8| 黄片小视频在线播放| 90打野战视频偷拍视频| av网站免费在线观看视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 婷婷丁香在线五月| 久久国产精品人妻蜜桃| 中文字幕高清在线视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 高清黄色对白视频在线免费看| 国产精品成人在线| 免费不卡黄色视频| √禁漫天堂资源中文www| 啦啦啦在线免费观看视频4| 男男h啪啪无遮挡| 九色亚洲精品在线播放| 好男人电影高清在线观看| 老司机靠b影院| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久99久视频精品免费| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲色图综合在线观看| 欧美乱色亚洲激情| 999精品在线视频| videos熟女内射| 99re6热这里在线精品视频| 91成人精品电影| 精品人妻在线不人妻| 老汉色av国产亚洲站长工具| 在线看a的网站| 操出白浆在线播放| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产激情欧美一区二区| 欧美激情久久久久久爽电影 | 夜夜爽天天搞| 午夜老司机福利片| 欧美精品av麻豆av| 无限看片的www在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 交换朋友夫妻互换小说| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 母亲3免费完整高清在线观看| 99热国产这里只有精品6| 国产在线精品亚洲第一网站| 热re99久久国产66热| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日本精品一区二区三区蜜桃| 啪啪无遮挡十八禁网站| 久久久国产成人精品二区 | 国产高清国产精品国产三级| 激情在线观看视频在线高清 | 日本wwww免费看| 两个人看的免费小视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产91精品成人一区二区三区| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美日韩一级在线毛片| 精品一区二区三区av网在线观看| 色综合婷婷激情| 午夜福利视频在线观看免费| 99re6热这里在线精品视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 在线观看午夜福利视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 精品久久久精品久久久| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 久久中文看片网| 麻豆av在线久日| 大片电影免费在线观看免费| 欧美日韩精品网址| 精品久久久久久,| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲国产看品久久| 午夜亚洲福利在线播放| 极品人妻少妇av视频| 久久 成人 亚洲| 亚洲精品国产区一区二| 18禁国产床啪视频网站| 色精品久久人妻99蜜桃| 少妇的丰满在线观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲美女黄片视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产国语露脸激情在线看| 午夜免费鲁丝| 麻豆乱淫一区二区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| a级毛片在线看网站| 国产高清videossex| 欧美精品亚洲一区二区| 一a级毛片在线观看| 久久性视频一级片| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 成人特级黄色片久久久久久久| 在线永久观看黄色视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 99热网站在线观看| 热re99久久国产66热| 亚洲全国av大片| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 欧美日韩福利视频一区二区| 啦啦啦在线免费观看视频4| ponron亚洲| 美女高潮到喷水免费观看| 日本wwww免费看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 精品亚洲成国产av| 俄罗斯特黄特色一大片| 性少妇av在线| 精品国产国语对白av| 国产在线一区二区三区精| 丝袜美腿诱惑在线| 校园春色视频在线观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 国产精品久久电影中文字幕 | 人人妻,人人澡人人爽秒播| 五月开心婷婷网| 在线观看免费午夜福利视频| 在线观看舔阴道视频| 一级a爱片免费观看的视频| 满18在线观看网站| 久久午夜综合久久蜜桃| 一级a爱视频在线免费观看| 人妻一区二区av| 视频在线观看一区二区三区| 9色porny在线观看| 精品电影一区二区在线| 久热爱精品视频在线9| 大型黄色视频在线免费观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 在线av久久热| 欧美乱色亚洲激情| 在线视频色国产色| 国产精品 国内视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 成年女人毛片免费观看观看9 | 好男人电影高清在线观看| 久久久国产精品麻豆| 99热网站在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 精品视频人人做人人爽| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲精品久久午夜乱码| 男女午夜视频在线观看| 51午夜福利影视在线观看| svipshipincom国产片| 妹子高潮喷水视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲成国产人片在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 久久久精品免费免费高清| 欧美日韩视频精品一区| 欧美最黄视频在线播放免费 | 9191精品国产免费久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 精品福利永久在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 丝袜在线中文字幕| 午夜福利免费观看在线| 亚洲成国产人片在线观看| 欧美日韩黄片免| 俄罗斯特黄特色一大片| xxx96com| 久久精品国产a三级三级三级| 99国产精品一区二区蜜桃av | 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 午夜免费成人在线视频| 男女之事视频高清在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 黄片小视频在线播放| 美女 人体艺术 gogo| 黑人操中国人逼视频| 国产一区在线观看成人免费| 一夜夜www| 国产精品 欧美亚洲| 一级a爱视频在线免费观看| 国产精品二区激情视频| 午夜老司机福利片| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 最新的欧美精品一区二区| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产精品综合久久久久久久免费 | 热99re8久久精品国产| 又黄又粗又硬又大视频| 成年动漫av网址| 欧美乱妇无乱码| 成人精品一区二区免费| 欧美av亚洲av综合av国产av| 最近最新免费中文字幕在线| 国产成人av激情在线播放| 成人av一区二区三区在线看| 极品教师在线免费播放| 午夜成年电影在线免费观看| 动漫黄色视频在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产成人欧美在线观看 | 久久人妻熟女aⅴ| 男女高潮啪啪啪动态图| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 波多野结衣av一区二区av| 母亲3免费完整高清在线观看| 91老司机精品| av天堂在线播放| 男女下面插进去视频免费观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 好男人电影高清在线观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 欧美国产精品一级二级三级| 欧美 日韩 精品 国产| 欧美激情高清一区二区三区| 欧美国产精品一级二级三级| 成人av一区二区三区在线看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲成国产人片在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 大香蕉久久网| 校园春色视频在线观看| 国产99白浆流出| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 成人国产一区最新在线观看| 18禁美女被吸乳视频| xxx96com| 涩涩av久久男人的天堂| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 免费观看精品视频网站| 久久人妻熟女aⅴ| 狂野欧美激情性xxxx| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲全国av大片| 亚洲精华国产精华精| 丁香六月欧美| av在线播放免费不卡| 日韩有码中文字幕| 下体分泌物呈黄色| 五月开心婷婷网| 亚洲情色 制服丝袜| 涩涩av久久男人的天堂| 桃红色精品国产亚洲av| 咕卡用的链子| 亚洲第一青青草原| 国产97色在线日韩免费| 亚洲中文字幕日韩| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 黑人操中国人逼视频| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲免费av在线视频| 精品国产亚洲在线| 日本a在线网址| 欧美最黄视频在线播放免费 | 欧美乱码精品一区二区三区| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 亚洲精品国产区一区二| 天天操日日干夜夜撸| 一级毛片高清免费大全| 在线永久观看黄色视频| 免费不卡黄色视频| 国产亚洲一区二区精品| 久久人妻熟女aⅴ| 黑人操中国人逼视频| 亚洲精品美女久久av网站| 欧美大码av| 国产野战对白在线观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲成人手机| 一进一出好大好爽视频| 最新在线观看一区二区三区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 精品免费久久久久久久清纯 | 国产一卡二卡三卡精品| 欧美黄色淫秽网站| 12—13女人毛片做爰片一| 国产黄色免费在线视频| 亚洲专区字幕在线| 天天添夜夜摸| 怎么达到女性高潮| 热99久久久久精品小说推荐| 精品久久久久久电影网| 丰满饥渴人妻一区二区三| 桃红色精品国产亚洲av| 国产亚洲一区二区精品| 免费看十八禁软件| 国产精品免费视频内射| 久久久久精品人妻al黑| 精品少妇久久久久久888优播| 一进一出好大好爽视频| 午夜成年电影在线免费观看| 国产真人三级小视频在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 天天操日日干夜夜撸| 免费日韩欧美在线观看| 老司机影院毛片| 美女福利国产在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 伦理电影免费视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 中出人妻视频一区二区| 99国产极品粉嫩在线观看| 99热国产这里只有精品6| 丝袜在线中文字幕| 午夜精品在线福利| 亚洲欧美激情在线| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产成人免费无遮挡视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 在线播放国产精品三级| 天天影视国产精品| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲全国av大片| 一进一出抽搐动态| 精品电影一区二区在线| 国产极品粉嫩免费观看在线| 12—13女人毛片做爰片一| 99精品久久久久人妻精品| 丝袜在线中文字幕| 久久香蕉激情| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 超碰97精品在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 精品国产亚洲在线| 国产精华一区二区三区| 一区二区三区激情视频| 国产色视频综合| 婷婷成人精品国产| 久久九九热精品免费| 在线观看www视频免费| 国产色视频综合| 动漫黄色视频在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 日本黄色视频三级网站网址 | 手机成人av网站| 母亲3免费完整高清在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲五月天丁香| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| av超薄肉色丝袜交足视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 超碰97精品在线观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 成人av一区二区三区在线看| bbb黄色大片| www.自偷自拍.com| 亚洲人成伊人成综合网2020| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久国产乱子伦精品免费另类| 女人被狂操c到高潮| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 老司机午夜福利在线观看视频| 一区福利在线观看| 黑人猛操日本美女一级片| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 18禁国产床啪视频网站| 久久影院123| 亚洲熟妇熟女久久| 丝袜美足系列| 亚洲九九香蕉| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 精品国产亚洲在线| 亚洲人成电影免费在线| 乱人伦中国视频| 十分钟在线观看高清视频www| 国产不卡一卡二| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品久久久人人做人人爽| 中文字幕最新亚洲高清| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲精品av麻豆狂野| 天天添夜夜摸| 日本熟妇午夜| 18美女黄网站色大片免费观看| 精品国产亚洲在线| 在线观看免费午夜福利视频| 好男人电影高清在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 国产成人系列免费观看| 国产精品久久电影中文字幕| 高清日韩中文字幕在线| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 一级毛片高清免费大全| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美日韩精品网址| 欧美乱妇无乱码| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂|