觀察在體灌注SCL基因重組慢病毒對(duì)豚鼠糖尿病膀胱中ICC功能的影響

徐浩 ，錢彪 ，楊立 ，張思源 ，沈志遠(yuǎn) ，邵潤芃 ，王勤章 *

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子832000；2中國人民解放軍第四七四醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000）

糖尿病性膀胱病是糖尿病后期嚴(yán)重的泌尿系統(tǒng)并發(fā)癥，在糖尿病患者中會(huì)有25%～85%[1]的人發(fā)生，主要造成膀胱順應(yīng)性加強(qiáng)，逼尿肌收縮力降低，殘余尿量變多等，從而造成患者生存質(zhì)量嚴(yán)重下降[2]。目前，關(guān)于DCP發(fā)病機(jī)制和治療手段已成為探究熱點(diǎn)。近期研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，膀胱逼尿肌上具有一類與胃腸道Cajal間質(zhì)細(xì)胞相差無幾的細(xì)胞，取名為膀胱ICC（interstitial cells Cajal，ICC）。多項(xiàng)研究表明膀胱ICC有可能是逼尿肌興奮的起搏細(xì)胞[5-8]。

前期課題組研究證實(shí)酪氨酸蛋白激酶生長因子受體 （tyrosine kinase growth factor receptor，c-kit）在膀胱ICC細(xì)胞中可以特殊性表達(dá)。在體外高糖環(huán)境可以使c-kit的表達(dá)降低，從而致使ICC細(xì)胞個(gè)數(shù)減少，表型發(fā)生改變，功能也相繼受損[9-10]。

本研究采用特制導(dǎo)尿管對(duì)豚鼠膀胱灌注SCL基因，利用膀胱粘膜的吸收作用，轉(zhuǎn)染DCP膀胱，改善c-kit上游基因，從而使c-kit表達(dá)加強(qiáng)，重塑ICC細(xì)胞的功能，觀察體外分離培養(yǎng)的ICC電流幅度變化，從而探討DCP膀胱功能的改善情況，為臨床對(duì)DCP的醫(yī)治帶來新的方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用健康雄性豚鼠90只，6～8月齡，重量在250 g～350 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料

檸檬酸與檸檬酸鈉（上?；ぴ噭┕荆滊遄艟兀⊿igma公司），烏拉坦（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），血糖儀及試紙（美國強(qiáng)生公司），SCL慢病毒（上海吉?jiǎng)P公司），DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS），V 型膠原酶（Sigma公司），恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，膜片鉗操作臺(tái)。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠DCP模型的制備

購買的90只健康雄性豚鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食12 h，按照200 mg/kg體重單次腹腔注射1%的STZ（0.1 mol/L、pH 4.4的新鮮枸櫞酸緩沖液）誘導(dǎo)豚鼠建立糖尿病模型。常規(guī)全價(jià)喂養(yǎng)6周后采用剪耳法檢測(cè)隨機(jī)血糖，按照連續(xù)4周隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L為界限篩選出糖尿病豚鼠[11]。將篩選出來的的糖尿病豚鼠繼續(xù)飼養(yǎng)2周，此時(shí)為糖尿病豚鼠發(fā)生失代償期DCP的時(shí)間窗口，認(rèn)為豚鼠DCP模型建立成功[12]。

1.2.2 經(jīng)尿道灌注SCL

慢病毒轉(zhuǎn)染DCP膀胱 將制作成功的36只DCP豚鼠模型隨機(jī)平均分為3組：實(shí)驗(yàn)組、陽性對(duì)照組、空白對(duì)照組，行SCL基因慢病毒灌注前禁食水6 h，按照200 mg/kg的水合氯醛將（100 mg/mL）行腹腔麻醉，將麻醉后的豚鼠固定于操作臺(tái)上并暴露陰莖，用碘伏消毒然后鋪一次性洞巾，插入特制導(dǎo)尿管，用1 mL注射器緩慢抽出殘存尿液，抽完后再將0.2 mL生理鹽水緩慢注入膀胱內(nèi)，反復(fù)沖洗3次。

實(shí)驗(yàn)組經(jīng)尿道灌注最佳MOI為2×107TU的SCL基因重組慢病毒液[13]0.2 mL；陽性對(duì)照組灌注不攜帶SCL基因的載體液0.2 mL；空白組灌注PBS液0.2 mL。灌注后夾閉尿管，使膀胱中灌注液保存2 h。待轉(zhuǎn)染2 h后，將豚鼠繼續(xù)放回籠中飼養(yǎng)。

1.2.3 體外ICC細(xì)胞的分離培養(yǎng)

分別于灌注結(jié)束后第 2、7、15、28 d，每次每組麻醉處死豚鼠3只，立即剖腹，迅速剪取膀胱，排除殘余尿液，用含雙抗（100 U/mL青霉素、100 g/mL鏈霉素）0.01 mol/L的PBS溶液沖洗3遍后，無菌操作臺(tái)上在新更換的PBS溶液中將膀胱剪為 1 mm3大小碎塊；將剪碎的膀胱放入到10 mL離心管中用胰蛋白酶消融30 min后，再加入膠原酶V繼續(xù)消融40 min；觀察膀胱組織已不再是團(tuán)塊狀，加入等計(jì)量FBS終止消融；用1000 r/min的離心機(jī)分離2 min后，過濾收取濾液，繼續(xù)以 1500 r/min離心5 min；離心后緩慢倒去上層懸液，留取下層白色團(tuán)液，再添加含有10%FBS、1%雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)基，吹打單細(xì)胞懸液，并分別接種于膜片鉗專用培養(yǎng)皿中；置入溫度為37℃ 含有5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培育24 h后，使用倒置顯微鏡察看細(xì)胞，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，更換培養(yǎng)基，將未貼壁的平滑肌細(xì)胞吸出，用 0.01 mol/L PBS液輕輕沖涮培養(yǎng)皿3次，再加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至 72 h后即可得到ICC[14]。

1.2.4 膜片鉗檢測(cè)ICC內(nèi)向電流

細(xì)胞外液(mmol/L)：KCl 5，NaCl 150，CaCl22.6，MgCl21.1，HEPES 10，D-gluocse 10，細(xì)胞外液用 1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH 至7.4。電極內(nèi)液(mmol/L)：KCl 65，KOH 5，KF 80，MgCl22，HEPES 10，EGAT 10，Na2ATP 2，電極內(nèi)液用1 mol/L的 KOH調(diào)節(jié)pH至7.3。

自培養(yǎng)72 h的培養(yǎng)箱中取出負(fù)載有ICC的專用培養(yǎng)皿，置于倒置顯微鏡鏡臺(tái)上37℃恒溫灌流槽底部持續(xù)灌流。然后用電阻為 2～4 MΩ的玻璃電極進(jìn)行 5～10 GΩ的G歐封接，負(fù)壓破膜，使電極內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)液相通。

形成全細(xì)胞狀態(tài)后，膜電位鉗制在-60毫伏，首先通過膜片鉗放大器進(jìn)行正常生理?xiàng)l件下記錄、分析全細(xì)胞電流，記錄實(shí)驗(yàn)組、陽性對(duì)照組、空白對(duì)照組豚鼠DCP膀胱中ICC自發(fā)及ATP誘發(fā)的內(nèi)向電流變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

記錄DCP及SCL基因轉(zhuǎn)染后DCP膀胱ICC自發(fā)及ATP誘發(fā)的電生理學(xué)變化，多組間均數(shù)比較，采用單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病膀胱病變模型建立

經(jīng)腹腔注射1%的鏈脲佐菌素 6周后，豚鼠有3只可能由于STZ的毒性作用發(fā)生死亡，87只存活，多出現(xiàn)糖尿病典型臨床表現(xiàn)—多飲、多食、多尿，體重減輕等。

繼續(xù)監(jiān)測(cè)4周隨機(jī)血糖，若隨機(jī)血糖連續(xù)≥16.7 mmol/L則為豚鼠糖尿病誘發(fā)成功。本次實(shí)驗(yàn)最終共有40只豚鼠滿足條件納入實(shí)驗(yàn)。繼續(xù)喂養(yǎng)兩周，豚鼠膀胱將會(huì)進(jìn)入失代償期，此時(shí)豚鼠DCP模型建立成功。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

體外分離的膀胱組織采用酶消融法培養(yǎng) 72 h后，倒置顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)生長狀態(tài)良好的ICC細(xì)胞，細(xì)胞成梭型狀態(tài)，核大，兩端發(fā)出2～4條軸絲，視野下可見單聚體與二聚體兩種形態(tài)的ICC細(xì)胞，前期課題組證實(shí)逼尿肌的起搏細(xì)胞可能是高興奮性的二聚體ICC，本次實(shí)驗(yàn)主要研究觀察二聚體ICC（圖 1）。

圖1 培養(yǎng)72 h后倒置顯微鏡下觀察到的ICC細(xì)胞Fig.1 Incubation of ICC cells observed under an inverted microscope after 72 h

2.3 膜片鉗檢測(cè)二聚體ICC電流特點(diǎn)

將膜電位保持在－60 mV時(shí)，二聚體ICC自發(fā)的內(nèi)向電流未檢測(cè)到，而在ATP(100μmol/L)刺激下可檢測(cè)到明顯內(nèi)向電流，與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[15]（圖 2）。

在2 d檢測(cè)時(shí)，空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組在ATP刺激下產(chǎn)生的內(nèi)向電流變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在 7、14、28 d 時(shí)，相同 ATP 刺激下，實(shí)驗(yàn)組由于持續(xù)的轉(zhuǎn)染，ICC電流幅度逐漸增高（P＜0.05），14 d達(dá)到峰值，3次檢測(cè)到的內(nèi)向電流值均高于陽性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P＜0.05）；陽性對(duì)照組和空白對(duì)照組ICC電流幅度逐漸降低（P＜0.05）；陽性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間內(nèi)向電流變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)膜片鉗檢測(cè)ICC內(nèi)向電流變化Fig.2 Patch clamp detects ICC inward current changes at different time points

表1 不同時(shí)間點(diǎn)ATP刺激條件下的電流比較 ± STab.1 Current comparison of ATP stimulus at different time points ± S

表1 不同時(shí)間點(diǎn)ATP刺激條件下的電流比較 ± STab.1 Current comparison of ATP stimulus at different time points ± S

注：α=0.05，▲▲： P＜0.05 同一時(shí)間不同分組比較；★★： P＜0.05，同一分組不同時(shí)間比較。

空白對(duì)照組 陽性對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組 F 2 d 221.6±26.0 229.8±20.6 223.4±27.1 0.27

3 討論

豚鼠在腹腔注入STZ 6周后，連續(xù)監(jiān)測(cè)隨機(jī)血糖，以連續(xù)四周血糖≥16.7 mmol/L為標(biāo)準(zhǔn)，挑選出糖尿病豚鼠模型。繼續(xù)飼養(yǎng)2周，不對(duì)糖尿病豚鼠進(jìn)行干預(yù)，12周后糖尿病豚鼠將會(huì)引發(fā)失代償期糖尿病性膀胱病，據(jù)報(bào)道12周后將會(huì)有88.89%模型建立成功。課題組成員通過行尿動(dòng)力學(xué)研究證實(shí)12周時(shí)豚鼠膀胱膀胱容量、殘余尿量明顯增多，最大逼尿肌壓、膀胱順應(yīng)性減低，確定此時(shí)即為豚鼠DCP膀胱模型建立成功的時(shí)間窗口[16]。本次實(shí)驗(yàn)最終選出的36只豚鼠中，預(yù)計(jì)可能會(huì)有3只對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，但由于后續(xù)分離培養(yǎng)單個(gè)ICC細(xì)胞，樣本量增多，可減少誤差。

前期研究證實(shí)豚鼠膀胱中存在單體和二聚體2種不同形態(tài)類型的ICC[17]，而主要存在于豚鼠膀胱頂部黏膜下層的二聚體 ICC具有引發(fā)高興奮起搏電流的特殊結(jié)構(gòu)，是逼尿肌的起搏細(xì)胞。ICC樣細(xì)胞與逼尿肌細(xì)胞之間存在有一種特殊單位稱之為縫隙連接，它提供了相鄰細(xì)胞膜之間的直接連接和離子交換的低電阻通道，從而完成了電信號(hào)的興奮傳遞[18-19]。前期通過制作的豚鼠DCP標(biāo)本及體外高糖條件下培養(yǎng)膀胱中ICC發(fā)現(xiàn)，高糖條件可引起ICC數(shù)目減少、表型及電活動(dòng)改變的最主要原因就是c-kit mRNA以及c-kit蛋白表達(dá)的下降[9，20]。因此我們推測(cè)，能否通過增強(qiáng)或者恢復(fù)ICC細(xì)胞膜表面特異性標(biāo)志c-kit的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)ICC數(shù)量增加、表型恢復(fù)、功能得到改善，從而促進(jìn)膀胱整體性能得以提高。由于SCL基因可以與c-kit基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，從而上調(diào)ICC中c-kit的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)或者恢復(fù)形態(tài)和功能受損的ICC，為DCP基因治療提供了新的方向。

本次實(shí)驗(yàn)所使用的SCL基因重組慢病毒是以人類免疫缺陷I型病毒（HIV-1）為載體，將外源基因經(jīng)過尿道有效地轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞染色體上，既減輕了實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)組織造成的損傷，又降低了慢病毒對(duì)肝、腎等臟器的毒性反應(yīng)[13]，使基因治療實(shí)現(xiàn)了周期長、特性穩(wěn)定、持久表達(dá)等特點(diǎn)。另外，前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明慢病毒滴度為2×107TU／mL，可滿足大多數(shù)轉(zhuǎn)染相關(guān)實(shí)驗(yàn)需求[21]，從而更加可靠地為本實(shí)驗(yàn)提供了轉(zhuǎn)染依據(jù)。課題組成員通過qRT-PCR和Western blot方法檢測(cè)證實(shí)DCP膀胱在SCL慢病毒轉(zhuǎn)染后c-kit mRNA和蛋白能夠顯著得到上調(diào)[22]，從基因與蛋白水平說明了SCL慢病毒在豚鼠DCP膀胱中可以持久、安全、有效的表達(dá)。此次試驗(yàn)，運(yùn)用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組在ATP刺激下所測(cè)得的內(nèi)向電流幅度不斷在增高，說明ICC功能可能得到恢復(fù)，膀胱功能得以改善，28 d時(shí)所檢測(cè)的數(shù)值有所下降，低于14 d的電流幅度，但高于其它對(duì)照組，提示轉(zhuǎn)染效果有所減弱。陽性對(duì)照組、空白對(duì)照組兩組的電流幅度不斷在降低，可能由于豚鼠糖尿病病情加重，DCP持續(xù)損害，ICC功能不斷降低。另外陽性對(duì)照組、空白對(duì)照組的豚鼠隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長出現(xiàn)體重明顯減輕、脫毛、眼角潰爛等糖尿病并發(fā)癥。

綜上所述，SCL基因重組慢病毒經(jīng)過尿道灌注可很好的轉(zhuǎn)染豚鼠DCP膀胱。使可能為起搏細(xì)胞的二聚體ICC內(nèi)向電流逐步提高，從而使膀胱逼尿肌自發(fā)興奮性增強(qiáng)，膀胱功能得到恢復(fù)，這也為DCP的臨床醫(yī)治帶來了一個(gè)全新的方向。本次實(shí)驗(yàn)也存在一定不足，理論上，離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)盡可能模擬在體情況，但由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境有限，難以達(dá)到理論要求，可能會(huì)造成一定量偏差。