納米化阿苯達唑?qū)毩＜蝌试^節(jié)生長的影響

郭峰，董丹，陳聰哲，楊琨，侯雋，王仙，吳向未，陳雪玲*

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，石河子 832000）

包蟲?。╤ydatidosis，hydatid disease）又稱為棘球蚴病，是細粒棘球絳蟲（Echinococcus granulosus）的原頭節(jié)感染人體及牛、綿羊等家畜所引起。包蟲病是一種嚴(yán)重危害人體健康和畜牧業(yè)發(fā)展的人畜共患疾病，主要分布于牧區(qū)和半農(nóng)牧區(qū)，是全球性的公共衛(wèi)生問題，我國西部各省是該病高發(fā)區(qū)之一[1-2]。根治性手術(shù)仍然是包蟲病的主要治療手段，術(shù)前及術(shù)后均需化學(xué)藥物輔助治療。且因手術(shù)并發(fā)癥常見、術(shù)后易復(fù)發(fā)及部分患者無法接受手術(shù)治療等問題，藥物治療是一種較有效治療方式。目前脂溶性苯并咪唑類中的阿苯達唑（ABZ）為棘球蚴病首選治療藥物之一，經(jīng)長期藥物治療可顯著延長術(shù)后病人壽命[3-4]。

阿苯達唑存在胃腸道吸收差，肝臟血藥濃度低等缺點，使其藥效受到限制。因此，提高阿苯達唑的臨床療效需增加藥物的溶解度和生物利用率。納米技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域不斷發(fā)展和滲透，納米材料的運載體為棘球蚴病的藥物治療開辟了新的思路。納米藥物載體將藥物包封于亞微粒中或吸附于亞微粒表面，增加難溶藥物的溶解度和生物利用率[5]、改變藥物體內(nèi)分布、提高藥物安全性和臨床療效[6]。納米藥物載體技術(shù)將促進抗寄生蟲藥物加速發(fā)展，現(xiàn)研究尚處于初級階段，具有廣闊的發(fā)展前景[7-9]。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清購自 Hyclone公司。DMSO，高效RIPA組織裂解液。NQO-1檢測試劑盒購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司。藥物由澳大利亞昆士蘭大學(xué)顧文藝教授饋贈。

1.2 方法

1.2.1 細粒棘球蚴原頭節(jié)的采集和培養(yǎng)

從新疆昌吉市屠宰場采集新鮮自然感染細粒棘球蚴病的綿羊肝臟，流水清洗干凈肝臟，肝臟及包囊表面經(jīng)75%酒精消毒，抽取無污染含有原頭節(jié)囊液置于廣口瓶中。靜置5 min原頭節(jié)自然沉淀后棄去多余囊液及較大殘余囊皮，用含有100 IU/mL青霉素和100 IU/mL鏈霉素的 PBS漂洗原頭節(jié)至澄清，用 0.1%伊紅染色做染液排斥試驗，檢測活力（活力≥90%）。收集活性良好的原頭節(jié)，加入適量含有10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素混合液的RPMI 1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，待用。

1.2.2 藥物試驗

實驗分為 9組，空白對照組，3.13、6.25、12.5、25 μg/mL的納米化阿苯達唑藥物干預(yù)組及相同濃度阿苯達唑粉劑藥物干預(yù)組。培養(yǎng)3 d后，PBS漂洗細粒棘球蚴原頭節(jié)3次，每次3 min，各藥物處理組培養(yǎng)板孔內(nèi)分別加入相應(yīng)藥物及培養(yǎng)液，每處理組分別加入約3500個原頭節(jié)樣本。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每3 d更換1次藥物及培養(yǎng)液。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察原頭節(jié)活力變化

移液器混勻各藥物處理組樣本，“十”字形抽取各處理組100 μL樣本（約含原頭節(jié)100個），離心后吸出多余培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移原頭節(jié)至載玻片，在倒置顯微鏡下觀察經(jīng)0.1%伊紅染色后原頭節(jié)形態(tài)及活力?；盍α己玫脑^節(jié)拒染且結(jié)構(gòu)較為飽滿正常，死亡或活性較差的的原頭節(jié)被伊紅染液不同程度紅染并可能觀察到伴有結(jié)構(gòu)破壞，計算各組死亡率，繪制活力曲線圖。

1.2.4 原頭節(jié)抗氧化酶活性檢測

取取空白對照組、DMSO對照組、阿苯達唑粉劑處理組和納米化阿苯達唑處理組（3.13、6.25、12.5、25 μg/mL）作用 3、6 d組的原頭節(jié)，用 PBS漂洗 3次，每次3 min，加入RIPA裂解液，裂解原頭節(jié)提取蛋白，4℃12000 g離心，轉(zhuǎn)移上清液至EP管內(nèi)，測定各處理組蛋白濃度并將各組所提蛋白的濃度配平。按照NQO-1檢測試劑盒說明書方法檢測各組原頭節(jié)抗氧化酶活性。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，均數(shù)間比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物作用對細粒棘球蚴原頭節(jié)形態(tài)變化的影響

倒置顯微鏡下觀察空白對照組原頭節(jié)活動正常，伊紅染色拒染不著色，蟲體結(jié)構(gòu)清晰完整。各用藥組原頭節(jié)活動減弱至死亡，蟲體紅染體積變小，發(fā)生皺縮，蟲體外翻型增多，結(jié)構(gòu)破壞。納米化阿苯達唑組原頭節(jié)的死亡率高于阿苯達唑粉劑組，且高濃度組形態(tài)改變較低濃度組蟲體更明顯。顯微鏡下原頭節(jié)形態(tài)見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下細粒棘球蚴原頭節(jié)的形態(tài) (100×)Fig.1 E.granulosus protoscoleces cultured with nano ABZ observed by inverted microscope(100×)

2.2 藥物作用對細粒棘球蚴原頭節(jié)活力的影響

空白對照組原頭節(jié)活力在觀察期內(nèi)無明顯變化。各濃度阿苯達唑粉劑和納米化阿苯達唑處理組原頭節(jié)活力與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。根據(jù)活力曲線，納米化阿苯達唑及阿苯達唑粉劑對原頭節(jié)活性抑制作用呈現(xiàn)劑量及時間依賴性。各用藥組原頭節(jié)培養(yǎng)不同天數(shù)后活力曲線（圖2）。

圖2 不同濃度阿苯達唑作用后原頭節(jié)的活力值Fig.2 Loss of viability of E.granulosus protoscolices during in vitro ABZ powder and nano ABZ treatment

2.3 阿苯達唑?qū)毩＜蝌试^節(jié)氧化酶酶活性的影響

不同濃度納米阿苯達唑處理原頭節(jié)NQO-1酶活性檢測結(jié)果見圖3，酶活性呈現(xiàn)下降趨勢，藥物作用的原頭節(jié)與空白組相比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 納米阿苯達唑在作用3d和6d后原頭節(jié)NQO-1酶活性變化Fig.3 Effects of nano ABZ on NQO-1 activity in protoscoleces at 3 days and 6 days

3 討論

細粒棘球蚴病是由細粒棘球蚴原頭節(jié)引起的一種危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病，呈全球性分布，牧區(qū)高發(fā)，治療方式主要包括外科手術(shù)切除和化學(xué)藥物治療。目前，手術(shù)仍然是治療棘球蚴病的最主要方式，但由于手術(shù)過程中原頭節(jié)外溢難以避免、小部分外囊壁易殘留等問題，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高[10-12]。所以輔以術(shù)前術(shù)后藥物治療，對細粒棘球蚴病治療具有重要意義。阿苯達唑又名丙硫苯咪唑，1975年研制合成，是臨床上常用的治療棘球蚴病的輔助藥物[13]。

本研究觀察了不同濃度納米化阿苯達唑和普通阿苯達唑在體外對細粒棘球蚴原頭節(jié)的作用。不同劑量組阿苯達唑在體外均對細粒棘球蚴原頭節(jié)活力有抑制作用，細粒棘球蚴原頭節(jié)的活力隨著阿苯達唑濃度的增加呈現(xiàn)下降趨勢，抑制作用呈劑量、時間依賴性，其中以25 μg/mL納米化阿苯達唑組對原頭節(jié)的殺傷作用更顯著。藥物作用與對照組的差別均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，進一步證實了該藥在體外有一定的抗原頭節(jié)作用。

普通阿苯達唑片劑、粉劑由于不溶于水和大部分有機溶劑，存在著溶解度低，腸道吸收差，血藥濃度低等缺點[14]，阿苯達唑溶解性如有輕微的提高對于它的腸道吸收性以及肝血藥濃度至關(guān)重要[15]。而納米化阿苯達唑解決了阿苯達唑的難溶性缺陷，提高了阿苯達唑的溶解度，因此治療棘球蚴病的效果更具優(yōu)越性。本實驗初步證實了納米化阿苯達唑?qū)υ^節(jié)抑制作用優(yōu)于阿苯達唑粉劑，有望成為理想的抗棘球蚴病藥物。

體外試驗具有簡單易行、耗時短、易觀察等優(yōu)點，是初步觀察抗棘球蚴病新藥物治療效果的有效手段，穩(wěn)定、簡便、有效的體外培養(yǎng)方法作為常規(guī)抗棘球蚴病藥效學(xué)實驗具有重要意義[16-17]。但因阿苯達唑在體內(nèi)代謝過程較為復(fù)雜，納米化阿苯達唑治療效果還需疾病動物模型試驗進一步驗證。