中心組合設(shè)計(jì)—響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)方當(dāng)歸補(bǔ)血湯提取工藝

馬肖 金永新 陳煜娟

摘要：目的 優(yōu)化復(fù)方當(dāng)歸補(bǔ)血湯的提取工藝。方法 在單因素試驗(yàn)、析因設(shè)計(jì)、最速上升試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以浸膏得率及阿魏酸、芍藥苷、藁本內(nèi)酯提取率的權(quán)重和為響應(yīng)值，采用中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)方當(dāng)歸補(bǔ)血湯的提取工藝。結(jié)果 最佳條件為超聲提取60 min，提取溶劑為36%乙醇，料液比為1∶94。結(jié)論 該方法提取效率較高，操作簡(jiǎn)便，預(yù)測(cè)性良好。

關(guān)鍵詞：復(fù)方當(dāng)歸補(bǔ)血湯；析因設(shè)計(jì)；中心復(fù)合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法；提取工藝

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.016

中圖分類(lèi)號(hào)：R283.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）09-0066-05

Abstract： Objective To optimize extraction technology of Compound Danggui Buxue Decoction. Methods On the basis of single factor test， factorial design， and fastest rise test， yield and weight sum of extraction efficiency of ferulic acid， paeoniflorin and ligustilide were set as response， and central composite design-response surface method was used to optimize the extraction technology of Danggui Buxue Decoction. Results The optimum conditions consisted of ultrasonic-wave extraction for 60 min， ethyl alcohol concentration 36% and the ratio of material to solvent = 1：94. Conclusion This method has high extraction efficiency， easy operation and good predictability.

Keywords： Compound Danggui Buxue Decoction； factorial design； central composite design-response surface method； extraction technology

當(dāng)歸補(bǔ)血湯出自李東垣《內(nèi)外傷辨惑論》，由黃芪、當(dāng)歸按5∶1比例組成，具有補(bǔ)氣生血功效。方中黃芪為君藥，大補(bǔ)脾肺之氣，以資生血之源，配以當(dāng)歸益血和營(yíng)，兩藥相伍，陽(yáng)生陰長(zhǎng)，氣旺血生，主治勞倦內(nèi)傷、氣弱血虛、陽(yáng)浮外越，婦人經(jīng)行、產(chǎn)后血虛發(fā)熱頭痛，以及瘡痍潰后久不愈合等。在臨床中，將中藥復(fù)方隨癥加減，可加強(qiáng)、削弱或改變?cè)降淖饔?，以適應(yīng)不同病情的需要[1-4]。甘肅省第二人民醫(yī)院中醫(yī)科吳華主任醫(yī)師根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，將當(dāng)歸補(bǔ)血湯與桃紅四物湯合方加減，組成復(fù)方當(dāng)歸補(bǔ)血湯，在益氣生血基礎(chǔ)上兼能行血通瘀，因其良好的效果而在臨床得到廣泛使用?，F(xiàn)擬將復(fù)方當(dāng)歸補(bǔ)血湯開(kāi)發(fā)成為院內(nèi)制劑，優(yōu)化提取方法對(duì)該方的開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。當(dāng)歸、桃仁及川芎在復(fù)方當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量較大，且對(duì)全方功效起主導(dǎo)作用。因此，本試驗(yàn)選擇當(dāng)歸、川芎共有的有效成分阿魏酸、藁本內(nèi)酯[5]，以及白芍的質(zhì)量控制指標(biāo)芍藥苷，作為優(yōu)化考察指標(biāo)[6]，以其提取率與全方藥物浸膏得率的權(quán)重和為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用基于單因素試驗(yàn)、析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)及最速上升試驗(yàn)的中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法，對(duì)復(fù)方當(dāng)歸補(bǔ)血湯的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為該方的深度開(kāi)發(fā)及綜合利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

美國(guó)Agilent 1100 LC/DAD系統(tǒng)，Thermo ODS HYPERSIL C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），KH-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司），BT125D電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司），HH-S28s數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市大地自動(dòng)化儀器廠）。

阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)0829-9702）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)0829-9702），中國(guó)食品藥品檢定研究院；藁本內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)CHB160428，純度95%），成都曼思特股份有限公司。黃芪（批號(hào)20170210）、白芍（批號(hào)20170510）、熟地黃（批號(hào)20170703），甘肅·隴西百寶藥業(yè)有限責(zé)任公司；當(dāng)歸（批號(hào)20171201）、桃仁（批號(hào)20160901），河北祁新中藥顆粒飲片有限公司；紅花（批號(hào)17103004），甘肅省國(guó)草藥業(yè)有限公司；川芎（批號(hào)170801），成都濟(jì)宏藥業(yè)有限公司。水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取復(fù)方藥物，精密加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，超聲提?。l率40 kHz，功率80%）60 min，放至室溫，補(bǔ)足質(zhì)量，抽濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2 浸膏得率的測(cè)定

按“2.1”項(xiàng)下方法，精密量取續(xù)濾液，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃干燥3 h，干燥器中放置1 h冷卻至室溫，精密稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算浸膏得率。

2.3 阿魏酸、藁本內(nèi)酯和芍藥苷含量測(cè)定

采用內(nèi)標(biāo)校正法同步測(cè)定阿魏酸和藁本內(nèi)酯的含量，以阿魏酸為內(nèi)標(biāo)物，通過(guò)相對(duì)校正因子（f=0.223 1）計(jì)算藁本內(nèi)酯的含量，此方法準(zhǔn)確、有效，并且能降低檢測(cè)成本和時(shí)間[7]。采用外標(biāo)法測(cè)定芍藥苷的含量。

2.3.1 色譜條件

Thermo ODS HYPERSIL C18色譜柱（250 mm×4. 6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，5%～10%B；5～15 min，10%～15%B；15～20 min，15%B；20～30 min，15%～25%B；30～50 min，25%～60%B）；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；阿魏酸檢測(cè)波長(zhǎng)為323 nm，芍藥苷檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，進(jìn)樣量10 ?L。在上述色譜條件下，供試品溶液中各組分分離度良好，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱(chēng)取對(duì)照品阿魏酸、芍藥苷及藁本內(nèi)酯0.596、2.276、3.24 mg，分別置于10 mL量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，得到濃度分別為0.059 6、0.227 6、0.324 mg/mL的阿魏酸、芍藥苷及藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液，置于4 ℃冰箱保存，備用。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液2 mL定容于同一5 mL容量瓶中，得混合對(duì)照品溶液。按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，混合對(duì)照品溶液色譜圖見(jiàn)圖2。

2.3.3 線性關(guān)系考察

精密吸取上述阿魏酸對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別定容至5 mL容量瓶，精密吸取上述芍藥苷對(duì)照品溶液0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL分別定容至5 mL容量瓶，進(jìn)樣10 ?L，每個(gè)濃度平行進(jìn)樣3次，取峰面積平均值，以濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，平均峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸處理，回歸方程及線性范圍見(jiàn)表1。

2.3.4 精密度試驗(yàn)

取“2.3.3”項(xiàng)下高、中、低3個(gè)濃度的對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣3針，計(jì)算峰面積的RSD，結(jié)果阿魏酸峰面積RSD=2.23%，芍藥苷峰面積RSD=1.56%，表明儀器的精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取復(fù)方藥物6份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，計(jì)算浸膏得率，阿魏酸、芍藥苷提取率及其權(quán)重和。權(quán)重和=阿魏酸提取率×25%+芍藥苷提取率×25%+藁本內(nèi)酯提取率×25%+浸膏得率×25%。結(jié)果RSD=1.83%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別放置0、3、6、12、24 h后進(jìn)樣分析，每次進(jìn)樣10 ?L，記錄峰面積，結(jié)果阿魏酸、芍藥苷峰面積的RSD分別為0.538%、1.428%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取復(fù)方藥物9份，隨機(jī)分為3組，每組分別精密加入低、中、高濃度的對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定阿魏酸、芍藥苷及藁本內(nèi)酯的含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果阿魏酸平均回收率為100.06%，RSD=1.986 7%；芍藥苷平均回收率為99.75%，RSD=1.586 7%。

2.4 提取工藝優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗(yàn)

固定料液比、提取時(shí)間及提取溶劑，對(duì)比超聲波提取法及回流提取法對(duì)復(fù)方當(dāng)歸補(bǔ)血湯的提取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)回流提取法的提取效率略高于超聲提取法，但超聲提取法操作簡(jiǎn)便，效率較高，因此選擇超聲提取法。在此基礎(chǔ)上，對(duì)提取溶劑、料液比及提取時(shí)間進(jìn)行考察。結(jié)果見(jiàn)圖3。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇濃度30%～70%、料液比1∶50～1∶100、提取時(shí)間30～60 min為考察區(qū)間，進(jìn)一步采用析因設(shè)計(jì)對(duì)上述因素進(jìn)行分析。

2.4.2 二級(jí)全析因設(shè)計(jì)

析因設(shè)計(jì)可以有效控制或消除其他混雜因素對(duì)反應(yīng)變量的干擾，分析更準(zhǔn)確，能同時(shí)研究幾個(gè)因素之間的交互作用，使分析結(jié)果更可靠和穩(wěn)定，為選擇最優(yōu)處理組合提供依據(jù)[8]。因此，本試驗(yàn)以權(quán)重和為考察指標(biāo)，篩選對(duì)復(fù)方藥物提取率有顯著影響的因素，試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

由表3可知，乙醇濃度與料液比對(duì)浸膏得率有顯著影響（P<0.05），而提取時(shí)間為非顯著性影響因素（P>0.05），故將提取時(shí)間確定為提取率最高的60 min，進(jìn)一步采用最速上升試驗(yàn)對(duì)乙醇濃度和料液比進(jìn)行優(yōu)化。

2.4.3 最速上升試驗(yàn)

最速上升試驗(yàn)是沿著最速上升路徑及響應(yīng)有最大增量的方向逐步移動(dòng)的方法。根據(jù)二級(jí)全析因設(shè)計(jì)結(jié)果，選擇乙醇濃度（A）與料液比（B）為考察因素，以權(quán)重和為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定兩者的基本步長(zhǎng)分別為10%與1∶10，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表4，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4?？梢钥闯?，權(quán)重和的最高值在第3組，即乙醇濃度為50%、料液比為1∶80，故將其作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心試驗(yàn)點(diǎn)。

2.4.4 中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)最速上升試驗(yàn)確定的響應(yīng)面試驗(yàn)中心點(diǎn)，以權(quán)重和為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行設(shè)計(jì)，采用Design Expert8.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析處理，因素和水平見(jiàn)表5，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表6。

對(duì)表6試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，得回歸方程Y=0.17-7.466×10-3A+0.029B-0.033AB（r=0.914 9，P<0.000 1）。根據(jù)確立的多項(xiàng)式模型，繪制乙醇濃度和料液比對(duì)權(quán)重和的二維等高線圖和三維效應(yīng)曲面圖，并優(yōu)選2個(gè)因素的最佳取值范圍，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可以看出，最佳提取條件為：超聲提取60 min，提取溶劑為36%乙醇，料液比為1∶94。對(duì)優(yōu)選的提取條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證，結(jié)果權(quán)重和為0.23，預(yù)測(cè)值為0.239 2，RSD=2.77%，表明該模型預(yù)測(cè)性良好，提取條件重復(fù)性理想。

3 討論

復(fù)方當(dāng)歸補(bǔ)血湯以黃芪、當(dāng)歸為君藥，黃芪補(bǔ)益元?dú)猓?dāng)歸補(bǔ)血活血；桃仁、紅花為臣藥，增強(qiáng)活血祛瘀功效；川芎理血中之氣，行血活血，為血中之氣藥；白芍養(yǎng)血柔肝、緩急止痛；熟地黃補(bǔ)血滋陰。全方在益氣生血的基礎(chǔ)上兼能行血通瘀，在臨床應(yīng)用過(guò)程中收到良好的效果，具有開(kāi)發(fā)成為醫(yī)院院內(nèi)制劑的良好潛力，故對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化尤為必要。

中藥復(fù)方由若干藥味組成，對(duì)其提取工藝優(yōu)化時(shí)僅針對(duì)某一藥味的單一成分進(jìn)行考察，會(huì)導(dǎo)致有效成分的損失和提取工藝的片面性。因此，本試驗(yàn)選擇方中主要藥味的主要成分阿魏酸、芍藥苷、藁本內(nèi)酯及浸出物得率為考察指標(biāo)，這些成分的藥理活性基本代表了復(fù)方的功效，計(jì)算時(shí)取其權(quán)重和，能夠較為綜合反映提取工藝的優(yōu)劣；本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)選取各因素的水平范圍，采用析因設(shè)計(jì)篩選出乙醇濃度與料液比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有顯著影響，進(jìn)而采用最速上升試驗(yàn)找到各因素的合適取值，以此為中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法的中心試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)乙醇濃度與料液比進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取條件。中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法能通過(guò)非線性模型擬合來(lái)預(yù)測(cè)最佳試驗(yàn)條件，克服了正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)等預(yù)測(cè)性較差、精確度不高的不足之處。同時(shí)，與析因設(shè)計(jì)、最速上升試驗(yàn)結(jié)合使用，能使工藝條件得到最大程度的優(yōu)化。以此模式對(duì)中藥及其復(fù)方的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，能夠較為全面地篩選出最優(yōu)提取工藝，提高其利用效率，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用和產(chǎn)品研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2017-09-19）

（修回日期：2017-10-23；編輯：陳靜）