抑制性分子LAIR-1在異種移植物殺傷機(jī)制中的作用

張虹，張卓超，李霄，黃敏，張玄，陶開山，竇科峰（.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽外科，全軍器官移植研究所，陜西 西安 7003；.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，肝膽胰脾外科，北京 00853）

使用異種動(dòng)物器官作為供體的異種移植是目前解決同種移植過(guò)程中器官短缺的主要方法［1］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者們將豬作為異種移植器官來(lái)源最佳供體進(jìn)行了深入研究。但是受體體內(nèi)的補(bǔ)體、搞體以及自然殺傷細(xì)胞（natural killer cells，NK cells）能夠介導(dǎo)強(qiáng)烈的排斥反應(yīng)，引起異種移植物的失活［2］。研究表明，NK細(xì)胞介導(dǎo)的異種細(xì)胞毒性反應(yīng)在異種移植免疫排斥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。NK細(xì)胞可以不在預(yù)先致敏的條件下直接對(duì)異種基因的細(xì)胞和組織發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，這可能是因?yàn)槭荏w缺少豬的白細(xì)胞搞原I類分子以及供受體之間存在分子不相容性［3］。

白細(xì)胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體1（leukocyte associated immunoglobulin like receptor-1，LAIR-1）是NK細(xì)胞表面抑制性受體，體外研究表明，LAIR-1被其相應(yīng)的搞體交聯(lián)后可傳遞強(qiáng)烈的抑制性信號(hào)［4］，抑制NK細(xì)胞發(fā)揮搞體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的毒性作用（antibody dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC）［5］。LAIR-1 的主要功能配體為膠原，膠原在脊椎動(dòng)物中含量最為豐富，它對(duì)于許多組織的發(fā)育、形態(tài)形成及生長(zhǎng)都有著重要作用。LAIR-1與膠原的相互作用揭示了一種由免疫抑制受體與細(xì)胞外基質(zhì)膠原結(jié)合而發(fā)揮外周免疫調(diào)節(jié)的新理論［6］。膠原在異種移植物豬肝組織中表達(dá)量極高［7］。因此，本研究擬通過(guò)LAIR-1研究NK細(xì)胞參與調(diào)控異種移植排斥反應(yīng)的作用。在同種移植過(guò)程中已經(jīng)證明LAIR-1在移植物排斥反應(yīng)中的意義，而在異種移植過(guò)程中鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本文擬在α-1，3半乳糖苷酶敲除（α-1，3 Gal knock out，GTKO）豬-藏酋猴異種脾窩輔助性肝移植模型中研究NK細(xì)胞抑制性受體LAIR-1的表達(dá)，體外共培養(yǎng)NK細(xì)胞和豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（pig aortic endothelial cell，PAEC），檢測(cè)LAIR-1對(duì)NK細(xì)胞殺傷異種細(xì)胞的影響，期望為誘導(dǎo)異種免疫耐受提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象：實(shí)施GTKO豬-藏酋猴異種異位脾窩輔助性肝移植大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，單獨(dú)收集疑似發(fā)生排斥反應(yīng)或者不能區(qū)分是否發(fā)生排斥反應(yīng)的受體術(shù)前、術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)組織標(biāo)本、血液樣本和血漿樣本。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：PAEC由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所潘登科教授饋贈(zèng)。NK92細(xì)胞購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。

1.3 材料：1640培養(yǎng)基、馬血清（美國(guó)Hyclone公司）；BI血清（美國(guó)Gibco公司）；人重組白細(xì)胞介素2（interleukin-2，IL-2）細(xì)胞因子（美國(guó)protech公司）；LAIR-1搞體、CD4搞體、CD8搞體、IgG搞體、IgM搞體、CD16搞體（英國(guó)Abcam公司）；免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）；PE-LAIR-1搞體、PE-CD56搞體、FITCCD3搞體（美國(guó)BD公司）； LAIR-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（美國(guó)Aviscera Bioscience公司）。

1.4 方法

1.4.1 檢測(cè)移植物中固有免疫細(xì)胞浸潤(rùn)：收集兩例移植術(shù)前豬肝、術(shù)后開放血流1小時(shí)移植豬肝以及尸檢后豬肝組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)移植物組織中固有免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，免疫組織化學(xué)染色步驟依據(jù)常規(guī)免疫組化檢測(cè)試劑盒。

1.4.2 移植術(shù)后受體血漿中可溶型LAIR-1（soluble LAIR-1，sLAIR-1）和淋巴細(xì)胞中膜型LAIR-1（membrane LAIR-1，mLAIR-1）的表達(dá)水平檢測(cè)：在GTKO-藏酋猴異種肝移植過(guò)程中，術(shù)前、術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)采集受體靜脈外周血EDTA搞凝管4 ml，3 500 r/min離心15分鐘。吸取上清血漿，-80℃保存。吸取中間白膜層，紅細(xì)胞裂解液裂解后分離受體淋巴細(xì)胞，加入一定量的Trizol試劑，-80℃保存。

利用雙搞體夾心ELISA檢測(cè)異種移植前后不同時(shí)間點(diǎn)受體血漿中sLAIR-1的表達(dá)，具體操作步驟依據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書，每孔重復(fù)3次。利用RNA-seq技術(shù)檢測(cè)受體淋巴細(xì)胞中mLAIR-1在異種移植術(shù)后的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 異種移植術(shù)后移植物中存在免疫細(xì)胞浸潤(rùn)：1例異種移植受體存活5天，第2例異種移植受體存活3天，收集這兩次移植術(shù)前、術(shù)后開放血流1小時(shí)和尸檢時(shí)的移植物豬肝組織，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況。可以明顯觀察到：異種移植術(shù)后開放血流1小時(shí)和尸檢時(shí)移植豬肝中存在淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞浸潤(rùn)，提示受體在開放血流后受體NK細(xì)胞開始對(duì)異種豬肝組織進(jìn)行攻擊，但是淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和搞體沉積只在尸檢時(shí)檢測(cè)到明顯陽(yáng)性（圖1）。

圖1 檢測(cè)第五次異種移植術(shù)后豬肝組織中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況

2.2 移植術(shù)后LAIR-1分子的檢測(cè)：對(duì)兩例移植過(guò)程中受體血漿中sLAIR-1和淋巴細(xì)胞中mLAIR-1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：在移植術(shù)后開放血流1小時(shí)起受體血漿中sLAIR-1的表達(dá)呈先下降后上升趨勢(shì)（圖2a）；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示淋巴細(xì)胞中mLAIR-1在移植術(shù)后的表達(dá)趨勢(shì)與sLAIR-1相反，呈先上升后下降趨勢(shì)（圖2b）。這提示移植術(shù)后受體中sLAIR-1和mLAIR-1處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。

圖2 移植術(shù)后LAIR-1的表達(dá)

3 討 論

隨著以豬為供體的異種移植技術(shù)的逐漸發(fā)展，限制異種移植物存活的異種免疫障礙研究也越來(lái)越廣泛。GTKO豬的問(wèn)世，使異種移植發(fā)生超急性排斥反應(yīng)（hyperacute rejection，HAR）的問(wèn)題基本得到解決，但隨后發(fā)生的異種急性體液排斥反應(yīng)（acute humoral xenograft rejection，AHXR）成為限制臨床異種移植發(fā)展的主要原因［7］。AHXR常發(fā)生于術(shù)后數(shù)天，由補(bǔ)體和免疫細(xì)胞激活造成供體內(nèi)皮細(xì)胞活化和損傷，最終引起移植失敗。目前研究發(fā)現(xiàn)受體在發(fā)生AHXR階段有如下特點(diǎn)［8］：① NK細(xì)胞表面存在的補(bǔ)體受體CD11b和C1qRP能夠和供體表面的配體結(jié)合引起補(bǔ)體的激活，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞活化進(jìn)而引發(fā)凝血的發(fā)生，引起異種排斥反應(yīng)；② 移植術(shù)后受體體內(nèi)的各種白細(xì)胞亞群（包括巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等）對(duì)移植物進(jìn)行識(shí)別、滲透和損傷，造成移植失敗。

NK細(xì)胞的“自我缺失”理論表明NK細(xì)胞可以靶向作用于外源性同種異體移植物，但是普遍理論認(rèn)為NK細(xì)胞不是最終排斥實(shí)體器官移植物的積極參與者［9］。然而，最近研究結(jié)果對(duì)這一結(jié)論提出質(zhì)疑，并提出活化的NK細(xì)胞可以在移植術(shù)后影響免疫反應(yīng)，并能明顯地促進(jìn)移植排斥反應(yīng)或促進(jìn)移植免疫的耐受性。目前已有研究證明受體NK細(xì)胞的激活性受體能夠與供體體內(nèi)配體結(jié)合介導(dǎo)強(qiáng)烈的排斥反應(yīng)引起移植物失活［10］。因此，必須要找到能夠有效抑制NK細(xì)胞介導(dǎo)異種排斥反應(yīng)發(fā)生的方法。

人LAIR-1是位于人染色體19q13.4上的一種跨膜蛋白，其分子胞膜外區(qū)含有l(wèi)個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，胞漿區(qū)含有2個(gè)免疫受體酪氨酸抑制性基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM），當(dāng)抑制性受體與其相應(yīng)的配體或搞體發(fā)生交聯(lián)后，可引起ITIM中酪氨酸磷酸化，募集胞漿中含同源Src 結(jié)構(gòu)域（SH）的磷酸酶（包括SHP-1和 SHP-2）發(fā)揮抑制性信號(hào)［11］。LAIR-1包括mLAIR-1和sLAIR-1，sLAIR-1是由mLAIR-1脫落而致，并且二者具有相同的配體。LAIR-1廣泛表達(dá)于多種免疫細(xì)胞上，而其配體膠原在受體體內(nèi)表達(dá)量豐富。正常情況下免疫細(xì)胞不能與膠原發(fā)生接觸，但是當(dāng)免疫細(xì)胞發(fā)生滲出接觸到富含膠原的組織時(shí)，就會(huì)啟動(dòng)LAIR-1增加活化免疫細(xì)胞的閾值，使免疫應(yīng)答控制在一個(gè)適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，從而防止免疫細(xì)胞發(fā)生過(guò)度活化而產(chǎn)生免疫失衡［12］。

本研究檢測(cè)了異種移植過(guò)程中LAIR-1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在異種移植術(shù)后發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的受體體內(nèi)血漿中sLAIR-1的表達(dá)呈先下降后上升趨勢(shì)，而mLAIR-1分子呈先上升后下降趨勢(shì)。因此可以推測(cè)異種移植術(shù)后sLAIR-1和mLAIR-1表達(dá)量之間的動(dòng)態(tài)平衡是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合相關(guān)配體，抑制受體體內(nèi)淋巴細(xì)胞的活化，維持異種移植免疫平衡狀態(tài)。

綜上所述，NK細(xì)胞表面抑制性受體LAIR-1對(duì)異種移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生有一定的抑制作用。因此，深入探討LAIR-1在異種移植中的作用機(jī)制，期望能夠?yàn)楫惙N移植術(shù)后誘導(dǎo)免疫耐受提供新的思路。