重組人促紅細(xì)胞生成素預(yù)處理減輕大鼠肝臟缺血/再灌注損傷

慕喜喜，李靜，韓璐，鐘岳，何大立，竇科峰，陶開山（. 空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽外科，陜西 西安 700；.西安市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 7000；. 西安市中心醫(yī)院超聲科，陜西 西安 7000）

缺血/再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是臨床常見的肝損傷因素之一，通常發(fā)生在肝切除、肝移植、外傷和低血容量休克的過程中，病理特點(diǎn)主要是由庫普弗（Kupffer）細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的活化引起組織細(xì)胞受損，同時(shí)鈣超載、氧自由基及細(xì)胞因子的釋放和活化引起炎癥反應(yīng)、細(xì)胞壞死及凋亡。肝臟IRI的病理生理過程十分復(fù)雜，其分子機(jī)制目前仍未完全闡明［1］。因此，積極采取有效措施減輕肝臟IRI造成的不利影響對(duì)于促進(jìn)肝切除后肝功能恢復(fù)，降低肝移植術(shù)后排斥反應(yīng)等具有重要意義。紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）是主要由腎臟產(chǎn)生的一種糖蛋白細(xì)胞因子，在過去的幾十年里，EPO由于其促進(jìn)紅細(xì)胞生成的能力而被廣泛應(yīng)用于臨床［2］。近年來，許多研究表明，EPO具有炎性轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控活性，在腎臟和心臟的缺血/再灌注過程中能起到一定的保護(hù)作用［3-4］。然而，EPO 對(duì)肝臟 IRI的意義目前未知。因此，本研究將觀察重組人促紅細(xì)胞生成素（recombinant human erythropoietin，rhEPO）預(yù)處理對(duì)肝臟IRI的影響，并探索其可能的機(jī)制，為臨床肝臟IRI的預(yù)防提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠30只購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，約6～8周齡，體重200～250 g，飼養(yǎng)于清潔環(huán)境中。

1.2 主要試劑：rhEPO（德國(guó)NeoRecormon，Roche公司）；大鼠腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin）IL-6和IL-1β的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；蛋白免疫印跡試驗(yàn)（Western Blot） 檢 測(cè) 搞 體 ：anti-p-p85（1：1000，英 國(guó)Abcam公司），anti-p85（1：500，英國(guó)Abcam公司），anti- p-AKT（1：500，美國(guó) CST公司），AKT（1：1000，美國(guó)CST公司），β-actin（1：300，英國(guó)Abmart公司），HRP標(biāo)記的二搞（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；PrimeScript RT Master Mix試劑盒（日本Takara公司）；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（上碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及模型建立：經(jīng)過約1周時(shí)間的環(huán)境適應(yīng)后，隨機(jī)均分為3組，分別設(shè)立實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和假手術(shù)組。在肝臟IRI模型建立前1小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組使用5 000 U/kg的rhEPO進(jìn)行尾靜脈注射，而對(duì)照組和假手術(shù)組，則分別注射生理鹽水。rhEPO的給藥劑量參考前期相關(guān)研究［5］。大鼠70%肝臟IRI模型：術(shù)前禁食，在環(huán)境溫度25℃下，使用1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，然后采取平臥位，縱行切口打開腹腔，應(yīng)用顯微血管夾夾閉肝左、肝中葉脈管的共干，使得肝左葉及肝中葉缺血，以實(shí)現(xiàn)70%的肝臟組織缺血，阻斷血流1小時(shí)后恢復(fù)肝臟血供3小時(shí)，然后處死大鼠，留取血樣和肝臟標(biāo)本。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過了醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（20171102）。

1.4 肝組織病理學(xué)檢查：取大鼠肝臟缺血/再灌注后的肝臟標(biāo)本，置于中性甲醛中固定，固定時(shí)間為24小時(shí)，取適量肝組織標(biāo)本經(jīng)濃度梯度酒精脫水后石蠟包埋，將石蠟包埋后的組織制作成石錯(cuò)切片。將切片先經(jīng)脫蠟水化，然后分別采用蘇木素/伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色，最后脫水透明處理，進(jìn)行中性樹脂封片，顯微鏡下觀察結(jié)果并評(píng)價(jià)損傷情況［6］。

1.5 血清學(xué)檢測(cè)：用促凝管收集實(shí)驗(yàn)鼠的血液，分離血清，送至本院檢驗(yàn)科，使用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）的釋放情況。并用ELISA試劑盒，按照使用說明書，檢測(cè)血清炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白的表達(dá)量。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)：按說明用Trizol提取肝組織總RNA，取4 mg總RNA，使用Prime Script RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用ABI 7500 system進(jìn)行實(shí)時(shí)擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃30秒，95℃5秒40個(gè)循環(huán)，60℃34秒，最后95℃15秒。內(nèi)參選擇 β-actin，使用2-ΔΔCt的方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.7 Western Blot檢測(cè)：用1×蛋白上樣緩沖液，在冰上裂解細(xì)胞（加入蛋白酶抑制劑），提取蛋白99℃變性10分鐘。然后用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)提取蛋白濃度。制作10%的SDS-PAGE分離膠，蛋白上樣后電泳，110 V，120分鐘。轉(zhuǎn)膜，220 mA，40分鐘。5%牛奶封閉后，加入一搞4℃孵育過夜。用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二搞，室溫孵育1小時(shí)。最后用ChemiDocTMXRS+和Image LabTMsoftware顯影，并計(jì)算條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 rhEPO預(yù)處理可減輕大鼠肝臟缺血/再灌注損傷（圖1）：檢測(cè)大鼠血清中的AST和ALT變化反映肝功能情況，結(jié)果顯示，IRI處理后血清中兩種轉(zhuǎn)氨酶的釋放量均有明顯增加。但是，rhEPO組AST和ALT的釋放量均較對(duì)照組低〔AST（U/L）：582.0±52.5 比 245.0±31.7； ALT（U/L）：388.0±39.6比166.0±24.3，P ＜ 0.05）〕，提示肝損傷較輕。組織病理結(jié)果顯示，肝臟70%缺血/再灌注后造成明顯的肝組織損傷，肝組織形態(tài)出現(xiàn)異常，如肝細(xì)胞壞死、肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)液泡化以及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等，肝損傷評(píng)分較高，而采用rhEPO預(yù)處理的肝組織損傷明顯較輕。

圖1 rhEPO預(yù)處理對(duì)肝臟缺血/再灌注損傷的影響

2.2 rhEPO預(yù)處理進(jìn)一步活化了PI3K/AKT信號(hào)通路（圖2）：提取肝組織總蛋白，Western Blot檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白p85和AKT的表達(dá)和活化情況。結(jié)果顯示，肝臟經(jīng)歷IRI后，p85和AKT的蛋白總量未見明顯變化，但是，p-p85和p-AKT的表達(dá)量均有明顯增加；同時(shí)，給予rhEPO預(yù)處理后，p-p85和p-AKT的表達(dá)量增加尤為明顯，顯著高于對(duì)照組，提示IRI激活了PI3K/AKT信號(hào)通路，而rhEPO預(yù)處理則進(jìn)一步活化了PI3K/AKT激活信號(hào)。

2.3 rhEPO預(yù)處理降低了IRI時(shí)肝組織中的炎性因子轉(zhuǎn)錄水平（圖3）：提取肝組織總RNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)IRI肝組織中的炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達(dá)量。結(jié)果顯示，和假手術(shù)組比較，IRI引起肝臟TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高，但是，給予rhEPO預(yù)處理組TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組。

圖2 rhEPO預(yù)處理活化了PI3K/AKT信號(hào)通路

圖3 rhEPO預(yù)處理降低了IRI時(shí)肝組織中的炎性因子轉(zhuǎn)錄水平

2.4 rhEPO預(yù)處理抑制了IRI時(shí)血清中的炎性因子釋放（圖4）：為了進(jìn)一步檢測(cè)rhEPO預(yù)處理對(duì)IRI過程中血清炎性因子的釋放情況，使用ELISA法對(duì)不同處理組血清中的TNF-α、IL-6和IL-1β的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比較，對(duì)照組引起血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)量顯著升高，但是，給予rhEPO預(yù)處理后TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組〔TNF-α（pg/ml）：425.0±31.2比 227.0±19.7；IL-6（pg/ml）：353±26.4 比 189±16.3；IL-1β（pg/ml）：511.0±39.6 比 328.0±23.2，均 P ＜ 0.05）〕。

圖4 rhEPO預(yù)處理抑制了IRI時(shí)血清中的炎性因子釋放

3 討 論

EPO是由腎臟和肝臟分泌的一種激素樣物質(zhì)，屬于集落刺激因子，在骨髓造血微環(huán)境下能發(fā)揮促進(jìn)紅細(xì)胞生成的作用，研究表明其具有搞氧化［7］、搞炎［8］、搞細(xì)胞凋亡［9］和促血管生成［10］的特性，但是其對(duì)缺血/再灌注引起的肝損傷是否具有保護(hù)作用，目前研究極少。因此，我們通過建立大鼠70%肝臟組織IRI模型，阻斷血流1小時(shí)后恢復(fù)肝臟血供3小時(shí)，觀察肝損傷情況。組織學(xué)分析顯示，缺血/再灌注造成明顯的肝組織損傷，組織形態(tài)出現(xiàn)異常，出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死、細(xì)胞質(zhì)液泡化以及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。值得注意的是，在術(shù)前1小時(shí)，行尾靜脈給藥的情況下，缺血/再灌注造成的肝組織病理變化明顯減輕，說明rhEPO預(yù)處理能顯著減輕缺血/再灌注造成的肝損傷。因此，我們認(rèn)為rhEPO預(yù)處理是防治肝臟IRI的有效措施之一。

為了進(jìn)一步探索其機(jī)制，我們測(cè)試了與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)的PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑。PI3K激酶由一個(gè)催化亞基p110和一個(gè)調(diào)控亞基p85組成，它的激活依賴于p85激活［11］。一旦p85被激活，它就會(huì)向p-AKT發(fā)出信號(hào)，這與炎癥反應(yīng)有關(guān)［12］。由PI3K激活的AKT可通過促凋亡蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和激活內(nèi)皮一氧化氮合酶生成一氧化氮來調(diào)控細(xì)胞存活［13］。最近發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT通路的激活可以顯著減輕大腦 IRI［14］和心肌 IRI［15］。研究表明，IRI誘導(dǎo)了PI3K的p85調(diào)控亞基的激活，對(duì)照組大鼠的p-p85水平明顯高于假手術(shù)組大鼠。令人驚訝的是，在大鼠體內(nèi)的rhEPO預(yù)處理進(jìn)一步增強(qiáng)了p85的活性。這一結(jié)果促使我們深入研究了AKT的活性，因?yàn)閜85的磷酸化會(huì)使AKT產(chǎn)生活性。與上述結(jié)果一致，p-AKT的表達(dá)也明顯增加，rhEPO增強(qiáng)了AKT的活性。

為了進(jìn)一步證明增強(qiáng)的PI3K/AKT信號(hào)能抑制炎癥反應(yīng)，我們隨后在IRI肝臟組織中選擇性地測(cè)定了TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)。結(jié)果顯示，rhEPO預(yù)處理的大鼠表現(xiàn)出明顯較低的TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)量?？傊覀兊臄?shù)據(jù)說明rhEPO增強(qiáng)了PI3K/AKT的活化信號(hào)，然后抑制了炎癥反應(yīng)，保護(hù)肝臟不受IRI的影響。在調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)方面，PI3K/AKT通路一直被認(rèn)為是很重要的［16］。例如，不同的PI3K異質(zhì)二聚體可以分別控制細(xì)胞增殖和存活、B和T細(xì)胞受體信號(hào)，以及B和T淋巴細(xì)胞的趨化性［17-18］。最近，人們?cè)絹碓蕉嗟匕l(fā)現(xiàn)，在固有免疫細(xì)胞中，PI3K/AKT通路具有廣泛而顯著的作用［19-20］。固有免疫細(xì)胞遷移至受損的組織或器官，需要對(duì)細(xì)胞骨架和膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行動(dòng)態(tài)重組，而PI3K信號(hào)則是提供細(xì)胞極性和偽足擴(kuò)展來實(shí)現(xiàn)這一過程的關(guān)鍵［18］。有研究顯示，PI3K的激活減弱了Geniposide引起的肝臟IRI［21］，因此，本實(shí)驗(yàn)沒有進(jìn)行額外的研究，以證明激活的PI3K/AKT信號(hào)抑制了在肝內(nèi)引起的免疫反應(yīng)。值得注意的是，rhEPO減輕肝臟IRI損傷可能會(huì)涉及到其他途徑，而不僅僅是PI3K/AKT信號(hào)，如MAPK激酶級(jí)聯(lián)信號(hào)［3］，這將是下一步的研究重點(diǎn)。

總之，本研究有力地說明了rhEPO預(yù)處理可以改善IRI引起的肝臟損傷，表現(xiàn)為肝臟組織病理變化較輕以及炎性浸潤(rùn)明顯減弱。機(jī)制研究表明，rhEPO增強(qiáng)了PI3K/AKT信號(hào)的激活，從而抑制了炎癥的滲透以緩解肝臟IRI。以上結(jié)果提示，rhEPO在臨床實(shí)踐中可以作為預(yù)防或治療肝臟IRI的一種很好的替代療法。