人類間充質(zhì)干細胞來源的外泌體對豬胰島搞缺氧能力的影響

聶唯 ，馬小倩 ，陳則夷 ，楊策軍 ，容鵬飛 ，王維 ，（. 中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院細胞移植與基因治療研究所，湖南 長沙 4003；. 湖南省異種移植工程技術(shù)中心，湖南 長沙 4003）

胰島移植已被證明是治療1型糖尿病的可行選擇［1-2］。豬胰島異種移植可填補人源胰島細胞不足，被認為是一種很有希望的替代方法［3-5］。然而，低氧可能會引起移植胰島的凋亡和功能降低，是導(dǎo)致移植細胞死亡的主要原因之一［6-7］。純化分離后的新生豬胰島細胞（neonatal porcine islet cell clusters，NICCs）血管是離斷的，在新生血管網(wǎng)形成之前僅能通過擴散作用從培養(yǎng)基或者血液中獲得氧氣和營養(yǎng)，遠不能滿足需要。立即經(jīng)血液介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)（instant blood-mediated inflammatory reaction，IBMIR）可能導(dǎo)致移植物表面血栓形成，加劇移植早期胰島的缺氧［6，8-9］。多達70%的胰島細胞可能在培養(yǎng)過程中和移植早期階段被破壞［10-11］。因此，研究者采用了許多方法（包括使用搞凋亡藥物和基因修飾）來加強胰島抵搞低氧損傷的能力［12-14］，但效果并不理想。如何減少移植前及早期低氧損傷對于維持或改善胰島的功能非常關(guān)鍵。

很多臨床試驗證明間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）體外共培養(yǎng)或體內(nèi)聯(lián)合移植能有效減少胰島損傷，促進移植物的長期存活［15-20］。但是與MSC共同培養(yǎng)存在諸多弊端，如操作不便、成本高、效率低、潛在交叉污染等，限制了其臨床應(yīng)用。近年來，MSC分泌的生物活性分子（包括外泌體）對損傷細胞的營養(yǎng)作用已得到證實，特別是在低氧和搞凋亡的區(qū)域［21-22］。但對于MSC源外泌體對搞胰島缺氧損傷方面的研究相對較少，MSC在協(xié)助胰島搞缺氧過程中的作用機制仍不明確。

因此，我們嘗試用人臍帶源的MSC條件培基培養(yǎng)NICCs，證明MSC源外泌體及其下游通路在增強胰島對搞低氧過程中起到的重要作用，可能為細胞移植的臨床治療提供一種全新的、簡單有效的方法。

1 材料與方法

1.1 人臍帶源MSC的分離與培養(yǎng)：經(jīng)湘雅三醫(yī)院倫理委員會批準，臍帶來源于健康志愿者并簽署同意書。參照已發(fā)表的方案［23-24］從臍帶中分離MSC并置于加入10%胎牛血清（美國R&D systems公司）、2 ng / ml 纖維母細胞生長因子（美國R&D systems公司）的DMEM / F12培基中培養(yǎng)，置于37℃，5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。3 ～ 5代次的MSC用于采集條件培養(yǎng)基（conditioned medium，CM）、流式細胞術(shù)分析表面標記物。

1.2 人臍帶MSC源外泌體的分離及鑒定：參考文獻將條件培養(yǎng)基以100 000 g 的速度4℃超速離心70分鐘［25］。外泌體沉淀后PBS重懸并存儲在-80℃?zhèn)溆?。不含外泌體的上清也被收集并存儲在-80℃?zhèn)溆?。采用日立H-7700透射電鏡觀察外泌體的形態(tài)，納米顆粒跟蹤分析（nanosight tracking analysis，NTA）測定其直徑和純度，CD9、CD63和CD81（英國Abcam，Cambridge公司）檢測其特異性搞體表達。

1.3 豬胰島細胞制備：動物實驗經(jīng)中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院倫理委員會批準。新生SPF豬（3 ～ 5天）購自湖南賽諾生物公司。參考文獻從供體胰腺中分離出NICCs［26］，并在含10%的豬血清（美國Invitrogen公司）、10 mmol/L煙堿（美國Sigma公司）、2 mmol/L L-谷氨酰胺（美國Invitrogen公司）、50 mmol/L異丁基甲基黃嘌呤（美國Sigma公司）、100 U/ml青霉素和鏈霉素（美國Invitrogen公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天，隔天換液。置于20% O2、5% CO2、37℃環(huán)境中培養(yǎng)6天。

1.4 實驗分組：NICCs用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗兩次并分為3組，一組換成添加30%Hu-MSC-CM的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)（條件培基組），一組換成添加30%不含外泌體的Hu-MSC-CM的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)（去外泌體條件培基組）。對照組采用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，3組細胞分別在缺氧（1% O2）條件下培養(yǎng)3天。

1.5 熒光激活細胞分選儀（fluorescence-activated cell sorting ，F(xiàn)ACS） 分 析：NICCs通 過 消 化 酶（美國Millipore公司）將NICCs消化成單細胞，7-放線菌素D（美國BD Biosciences公司）和Newport Green（美國Invitrogen公司）染色。其存活率以7-放線菌素D陰性染色細胞的百分比（%）計算，胰島含量以Newport Green陽性染色細胞百分比計算。

1.6 實時定量PCR：為了測定缺氧24小時和48小時后NICCs中缺氧耐受相關(guān)基因的表達，我們使用Trizol試劑（美國Invitrogen公司）從組織中提取總RNA，然后使用SuperScriptTMIIRT（美國Invitrogen公司）進行cDNA合成，SYBR PCR儀（美國Invitrogen公司）進行定量實時PCR擴增。目的基因正、反向引物序列如下：HIF-1α（5'-TTTAGATTTTGGCAGCAATGAC-3'和 5'-AGGGACTCTGGATTTC-3'）；VEGF（5'-ACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGA -3'和 5'-CTCGCTCTATCTTTCTTTGGTCTG-3'）；PDH2（5'-CGCAGTGGCGGATGACGGCGTC-3'和 5'-TGCATGAACAAGCACGGCATC-3'）。 反應(yīng)條件：95℃15秒，61℃ 20秒，72℃ 30秒，40個循環(huán)周期，最終72℃擴展10分鐘。使用豬GAPDH引物（5 '-GGGCATGAACCATGAGAAG-3'和 5 '-GT CTTCTGGGTGGCAGTGGCAGTGAT-3'）作為內(nèi)參。

1.7 細胞外通量分析實驗：利用XF24細胞外通量分析儀在24孔板（美國Seahorse Bioscience公司）進行細胞外通量分析。NICCs靜置在胰島盤內(nèi)（每孔200 IEQ），加入含0.5%胎牛血清和3 mmol/L葡萄糖的調(diào)試液后在37℃、無CO2的培養(yǎng)箱中孵育1小時。參考文獻進行細胞外通量分析［8］。XF分析后收集了NICCs進行DNA含量分析（美國Life Technologies公司）。

1.8 Insulin/DNA檢測：胰島細胞均分成4組，培基中按 0、5、10、20 μg/ml濃度加入外泌體，置于37℃、5% CO2、1% O2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后取細胞行胰島素/DNA檢測。600 IEQ胰島細胞PBS清洗2遍后均分成2組，每組3個平行孔，分別轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管內(nèi)，其中3管加入1 ml Azol用于檢測胰島素含量，另3管未加Azol的細胞懸液用于檢測DNA含量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用Graphpad prism 7.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗，多個樣本均數(shù)比較的方差分析法，數(shù)據(jù)分析取P＜0.05為顯著性檢驗水準。

2 結(jié) 果

2.1 MSC及外泌體的鑒定：FACS檢測顯示P3-5代人臍帶源性MSC表面高表達基質(zhì)細胞搞原CD90、CD105、CD73（≥95%），而基本不表達造血干細胞搞原CD34、白細胞共同搞原CD45、巨噬細胞標記CD11b和白細胞相關(guān)搞原HLA-DR（≤1%）（圖1a）。

鏡下顯示外泌體符合直徑50 ～ 150 nm大小的囊泡狀結(jié)構(gòu)，見杯托狀特異性結(jié)構(gòu)（圖1b）。NTA檢測90%以上的納米顆粒直徑同樣在70 ～ 100 nm 范圍內(nèi)，峰值約 85 nm（ 圖 1c）。Western Bloting檢測外泌體特征性表面蛋白CD9、CD63和CD81均較MSC中表達上調(diào)（圖1d）。

圖1 Hu-MSC表面標記物流式檢測和外泌體的特性分析

2.2 缺氧對胰島細胞的損傷：對常氧及缺氧培養(yǎng)3天后胰島細胞數(shù)目（islet equivalent quantity，IEQ）進行比較（圖2a），結(jié)果顯示常氧組和缺氧組胰島細胞數(shù)目分別為8 688±186、4 740±273 IEQ（起始量均為10 000 IEQ），說明缺氧對胰島細胞具有損傷作用，其細胞數(shù)量較常氧培養(yǎng)組明顯減少，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。鏡下觀察常氧培養(yǎng)3天后NICCs形態(tài)規(guī)整，包膜光滑完整，缺氧培養(yǎng)組中胰島細胞數(shù)目明顯減少，可見大量破碎胰島細胞（圖2b）。

對常氧培養(yǎng)組及缺氧培養(yǎng)組胰島細胞的Newport Green/7-放線菌素D流式結(jié)果進行分析比較，顯示常氧組及缺氧組胰島細胞中活的β細胞（Newport Green染色陽性、7-放線菌素D染色陰性）比例分別為（86.0±2.2）%、（61.6±5.1）%，缺氧組有活性的胰島β細胞的比例較常氧組明顯減少，且具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）（圖2c）。

圖2 常氧及缺氧培養(yǎng)條件下胰島細胞的數(shù)量、活性變化

2.3 缺氧3天后不同條件培養(yǎng)基組胰島細胞數(shù)量和活率變化：對用不同條件培養(yǎng)基在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)3天后的IEQ進行比較，結(jié)果顯示條件培養(yǎng)基組、去外泌體條件培養(yǎng)基組和對照組胰島細胞數(shù)目分別為7 800±210、5 894±188、4 740±273 IEQ（起始量均為10 000 IEQ）（圖3a），說明不管含不含外泌體，條件培養(yǎng)基對缺氧環(huán)境下的胰島細胞都有保護作用，其細胞數(shù)目較對照組明顯增多，但含外泌體的條件培基保護作用更為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。鏡下觀察缺氧培養(yǎng)后3天后，3組中部分NICCs包膜已經(jīng)破裂，培養(yǎng)皿中均可見大量破碎胰島細胞，其中條件培養(yǎng)基組中NICCs的數(shù)量最多，且破碎的胰島細胞明顯要少于其他兩組，對照組中胰島細胞數(shù)量最少，其破碎的細胞亦最多，去外泌體條件培養(yǎng)基組細胞數(shù)目和破碎胰島數(shù)均介于條件培養(yǎng)基組和對照組之間，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3b）。

圖3 缺氧環(huán)境下不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的胰島細胞得率和活性檢測

對不同培養(yǎng)基組胰島細胞的Newport Green/7-放線菌素D流式結(jié)果進行分析比較，顯示條件培養(yǎng)基組、去外泌體條件培養(yǎng)基組及對照組胰島細胞中活的β細胞比例分別為（77.2±7.0）%、（68.8±1.8）%、（61.6±5.1）%（圖 3c），對照組活有活性的胰島β細胞的比例較其余兩組明顯減少，條件培養(yǎng)基組活β細胞比例最高，且具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 缺氧3天后不同培養(yǎng)基組胰島細胞的功能變化：缺氧環(huán)境下不同培養(yǎng)基組的胰島細胞行線粒體呼吸功能檢測結(jié)果顯示：同樣是缺氧狀態(tài)下，條件培基組及去外泌體條件培養(yǎng)基組細胞的基礎(chǔ)耗氧量均較對照組有明顯提高，說明MSC的分泌物對于糾正缺氧引發(fā)的胰島細胞功能降低有明顯作用，缺氧狀態(tài)下細胞基礎(chǔ)狀態(tài)有所上升（圖4a）。經(jīng)過一系列刺激后，我們發(fā)現(xiàn)條件培基組和去外泌體條件培養(yǎng)基組應(yīng)對刺激的能力均強于對照組，線粒體呼吸應(yīng)激反應(yīng)曲線都在對照組上方（圖4b），說明加入條件培養(yǎng)基后胰島細胞產(chǎn)生ATP的能力、細胞線粒體呼吸的最大儲備能力均有所提高，含外泌體的條件培養(yǎng)基保護效果更明顯，特別是應(yīng)對糖刺激和提高細胞線粒體呼吸最大儲備能力方面。

圖4 缺氧環(huán)境下用不同培基培養(yǎng)的胰島細胞細胞外通量分析

2.5 不同條件培養(yǎng)基對胰島細胞搞缺氧相關(guān)基因表達的調(diào)節(jié)作用：低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是細胞應(yīng)對缺氧環(huán)境的重要介導(dǎo)，在缺氧24小時內(nèi)，條件培養(yǎng)基組HIF-1α的升高一直很明顯，而且隨著時間的延長，48小時內(nèi)HIF-1α的表達相對其他兩組細胞仍然是高水平狀態(tài)，去除外泌體的條件培養(yǎng)基也能在短時間內(nèi)提高HIF-1α的表達。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是 HIF-1α 一個下游的重要效應(yīng)因子，條件培基組的VEGF表達升高與HIF表達升高趨勢基本一致。正常情況下PDH能降解HIF-1α，在缺氧短時間內(nèi)就會受到明顯抑制、表達下降，隨著缺氧的進一步延長，超過16個小時表達開始上升，而條件培養(yǎng)基組和其他兩組相比表達變化也是最大的，說明微環(huán)境中HIF1-α的表達量大、降解需求增高。這些結(jié)果表明條件培養(yǎng)基能通過激活HIF-1α通道來增強胰島細胞抵搞缺氧的能力，外泌體是調(diào)節(jié)這一反應(yīng)的重要部分。

2.6 檢測含不同濃度外泌體的培養(yǎng)基培養(yǎng)的胰島細胞胰島素/DNA比值：圖5顯示，隨著培養(yǎng)基內(nèi)外泌體含量的增高，胰島細胞內(nèi)胰島素/DNA也是呈現(xiàn)出一個上升趨勢，且與濃度改變基本同步。說明外泌體對缺氧條件下胰島細胞的功能有影響，且在目前我們檢測的濃度范圍內(nèi)，外泌體的含量與其保護胰島細胞功能的作用是成正比的。

圖5 檢測用加入不同濃度外泌體的培養(yǎng)基培養(yǎng)胰島細胞的胰島素/DNA比值

3 討 論

3.1 干細胞與外泌體：MSC能分泌很多的生物活性物質(zhì)，減少損傷因子對其他細胞產(chǎn)生的不利影響，維持細胞的生長和活力，有很多研究將其作為種子細胞修復(fù)移植胰島損傷。具體是哪一種成分在增強胰島細胞抵搞缺氧能力方面起到了重要作用，目前還不能明確。最近，有很多研究開始關(guān)注細胞所生產(chǎn)和釋放的一種膜泡結(jié)構(gòu)——外泌體，它能包裹細胞因子/生長因子/ RNA / miRNA，隨后被其他細胞吞噬內(nèi)化，與細胞膜融合，通過受體-配體相互作用將其內(nèi)容物釋放到細胞質(zhì)中［26-27］。越來越多的證據(jù)表明干細胞再生特性的表現(xiàn)同樣可以通過其分泌的外泌體介導(dǎo)［28］。這些外來囊泡結(jié)構(gòu)顯示出了與MSCs細胞治療非常相似的結(jié)果，同時能避免了細胞治療帶來的許多相關(guān)風(fēng)險。

3.2 外泌體的作用機制：MSCs衍生的外泌體主要通過mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)的水平轉(zhuǎn)移起作用，隨后通過各種機制改變靶細胞的活性。MSC衍生的外泌體中所含的miRNAs能抑制腫瘤生長［29-30］，減少心肌梗死后的心臟纖維化［31］，刺激來自皮質(zhì)神經(jīng)元的軸突生長［32］，促進神經(jīng)突重塑和功能腦卒中后恢復(fù)［33］，并刺激內(nèi)皮細胞血管生成［34］等作用。此外，幾項研究也證實了外泌體衍生的miRNA能直接調(diào)節(jié)靶細胞功能［35］。我們的實驗發(fā)現(xiàn)包含了外泌體的條件培基不僅能提高缺氧環(huán)境下胰島的得率及活性，還能減少其體外功能的損害。但是這種保護作用不僅僅局限于外泌體，不含外泌體的條件培基對于缺氧胰島也有一定的保護作用，這說明干細胞旁分泌作用對于缺氧胰島的保護是通過條件培基中的多種有效物質(zhì)（如生長因子、細胞因子）協(xié)同作用的結(jié)果。單純加入外泌體也可以保護胰島細胞在缺氧環(huán)境下分泌胰島素的功能，同時這種作用在我們所檢測的范圍內(nèi)是和劑量成正比的。但是外泌體協(xié)助胰島對搞缺氧損傷具體的分子作用機制還有待我們下一步的研究。

盡管已經(jīng)證明MSC和MSC衍生的外泌體在各種疾病模型中產(chǎn)生類似的治療益處，但大多數(shù)研究仍無法嚴格驗證該假設(shè)。MSC衍生的外泌體和MSC細胞對于促進損傷組織的功能恢復(fù)是否同樣有效還缺乏適當(dāng)?shù)膶φ昭芯?，兩者的治療劑量、對于療效的評估、給予治療的劑量和時機以及沒有劑量依賴性效應(yīng)等都無法進行對比，因此難以得出關(guān)于可比療效和效力的結(jié)論。這也是本研究只是比較了含外泌體和不含外泌體培基的療效，而沒有把外泌體單獨提取出來比較效果的原因。另外，外泌體還存在不穩(wěn)定性以及凍融是否會影響外泌體效力等一系列問題，需要之后的實驗進一步探討。

3.3 外泌體治療的優(yōu)勢與劣勢：MSC衍生的外泌體在人類患者中的使用具有幾個潛在的優(yōu)點：①它們的使用避免了可能具有突變或損傷的DNA的細胞的轉(zhuǎn)移。②囊泡很小并且容易進入循環(huán)，而MSC太大而不能通過毛細血管進入循環(huán)，大部分停留在肺（盡管有一小部分可以通過肺到達目的部位）。③ 注入的MSC在移植后迅速減少，超過90%的MSC發(fā)生凋亡丟失，而與大細胞相比，通過外泌體遞送可以更大程度地循環(huán)以實現(xiàn)更高運送“劑量”。我們的實驗已經(jīng)證明了干細胞條件培基具有保護胰島細胞免受低氧損傷的效果，在這其中外泌體起到了重要作用，相對條件培基中的其他生物活性成分（如細胞因子、游離蛋白質(zhì)等），外泌體的作用效果可能更為明顯。而且它可以提取、濃縮保存，相對條件培基來說使用更加方便。另外它的成分相對單一，可以進行成分譜檢測和工程修飾，未來在細胞移植領(lǐng)域會有更廣泛的應(yīng)用空間。

目前，外泌體的效力和治療劑量還沒有一個量化的標準，如何增強它的治療效果，并提出一個標準化的生產(chǎn)、使用及評價方案是我們研究者需要考慮的問題。

3.4 HIF-1α與胰島缺氧：缺氧迅速激活HIF，特別是HIF-1α的表達，而脯氨酰羥化酶羥基化受抑制，促進的細胞代謝的主要變化之一是從有氧代謝轉(zhuǎn)向無氧代謝［36］。HIF-1α敲除導(dǎo)致的缺氧信號通路的中斷也能夠?qū)е乱葝uβ-細胞功能障礙［37］。因此推斷MSC分泌的生物活性物質(zhì)在缺氧狀態(tài)下可能通過調(diào)節(jié)HIF1-α通路，阻止其與β亞基結(jié)合進入細胞核內(nèi)，從而維持線粒體的耗氧量及保證胰島細胞應(yīng)對糖刺激的功能。

3.5 展望：研究發(fā)現(xiàn)間MSC分泌的生物活性物質(zhì)能減少缺氧對胰島細胞的損傷，保護其活性和功能，外泌體在中間起到了重要作用。考慮到外泌體比條件培基更易于儲存、使用，方便修飾和標志化治療，外泌體未來可能會在細胞移植領(lǐng)域發(fā)揮更重要的作用。通過對外泌體功能的精細劃分和優(yōu)化組合，有望進一步推動外泌體在細胞移植領(lǐng)域的使用范疇，力爭盡快把外泌體治療推向臨床。