Bacillus sp.肌氨酸氧化酶的脫輔基與重構(gòu)

王 慶， 辛 瑜， 楊海麟， 仝艷軍， 王 武

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

肌氨酸氧化酶 （Sarcosine oxidase，EC.1.5.3.1，SOX）屬于黃素蛋白氧化酶類，以FAD為輔因子，催化肌氨酸中N-甲基的氧化還原[1]。檢測血清或尿液中肌酐的含量，是判斷腎功能的一項重要指標(biāo)，而SOX則是此項檢測的關(guān)鍵診斷用酶之一[2]，在酶法測定中，肌酐轉(zhuǎn)化為肌氨酸，然后在肌氨酸氧化酶（SOX）的作用下分解成甘氨酸、甲醛和H2O2[3]，催化機理見圖1。

圖1 肌酐降解酶系的催化機理Fig.1 Catalysis in creatinine degradation enzyme system

現(xiàn)代臨床檢測肌酐的方法主要是基于上述酶促反應(yīng)機理。SOX的酶學(xué)性質(zhì)將在很大程度上影響它的應(yīng)用價值[4]。作為典型的、以共價結(jié)合FAD為輔因子的SOX，其輔基與酶蛋白的復(fù)合狀態(tài)直接影響到此類酶的活性與特異性[5]。為SOX脫去輔基再復(fù)合的研究并不多見，解決共價結(jié)合型輔基的脫除尤為困難[6-7]。本研究探索出采用不含輔因子FAD的SOX包涵體復(fù)性的方法，對肌氨酸氧化酶進行脫輔基以及與天然輔基的復(fù)合，探究如何在復(fù)性的過程中添加輔因子[8]，促使酶蛋白本體在正確折疊的過程中螯合輔因子，并呈現(xiàn)出酶學(xué)活性[9]。研究SOX酶蛋白與不同的、潛在的輔基之間存在著什么樣的關(guān)系，對改造乃至提高此類黃素酶的催化特性，將提供有意義的參考價值[10]。

1 材料與方法

1.1 菌種

E.coli BL21（DE3）/pET28a-soxopB：由作者所在實驗室保存[11]。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基（g/L）胰蛋白胨10，酵母提取物 5，氯化鈉 10，瓊脂 20；pH 7.5。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）胰蛋白胨10，酵母膏5，KH2PO42，K2HPO4·3H2O 4，NH4Cl 0.2， （NH4）2SO41.2，Na2HPO4·12H2O 7，MgSO4·7H2O 1， 葡萄糖 0.5；甘油10 mL/L。121℃下滅菌20min。

1.2.3 乳糖誘導(dǎo)液（g/L） 乳糖200；115℃滅菌30 min。

1.3 主要試劑

β-巰基乙醇、FAD （黃素腺嘌呤二核苷酸）、FMN（黃素腺嘌呤單核苷酸）、肌氨酸氧化酶、FMN（黃素腺嘌呤單核苷酸）：Sigma 公司；Tryptone、Yeast Extract、GSH、GSSG、核黃素、卡那霉素、牛血清蛋白（BSA）、辣根過氧化物酶：上海Sangon公司；尿素等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 方法

1.4.1 SOX包涵體的制備粗提取將新鮮活化菌種接種于LB發(fā)酵培養(yǎng)基（含1%卡那霉素），在 37℃、200 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)8 h后，加入終濃度為5%的乳糖誘導(dǎo)劑誘導(dǎo) 16 h，然后離心去上清液，在20 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）緩沖液中進行冰浴超聲波破碎，破碎完成后于8 000 r/min離心15 min，棄去上清液，得到肌氨酸氧化酶包涵體。

1.4.2 SOX包涵體的溶解將洗滌后的包涵體加入到 20 mmol/L Tris-HCl（pH 值 8.0，含 8 mol/L尿素，15 mmol/L β-巰基乙醇）配制的溶解液中，在200 r/min的搖床中過夜，過夜后10 000 r/min離心15 min，取離心后的上清液即為肌氨酸氧化酶包涵體溶解液。

1.4.3 SOX包涵體的透析復(fù)性將SOX包涵體變性溶解液置入透析袋中進行復(fù)性，通過預(yù)實驗先探究復(fù)性的基本條件：如蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度、溫度、氧化還原態(tài)、pH、時間等，確定SOX透析復(fù)性的最適條件后，加入輔基FAD復(fù)性，并按一定的時間間隔取樣測酶活性。

1.4.4 SOX脫輔基蛋白與輔酶復(fù)合的條件將SOX包涵體變性溶解液置入透析袋中，按照實驗前期探索的最佳復(fù)性條件進行，如蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度0.3 g/L，透析液pH 8.5，溫度4℃，氧化還原值（GSH/GSSG）為2，復(fù)性時間為24 h等，加入的輔因子換為FMN、核黃素（均為4 mg），另外設(shè)置不添加任何輔因子的作為對照，比較不同天然輔基與SOX蛋白復(fù)合后酶活、結(jié)構(gòu)與熱穩(wěn)定性的變化。

1.5 分析測定方法

1.5.1 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度采用考馬斯亮藍法測定質(zhì)量濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物，按照標(biāo)準(zhǔn)方法進行測定。

1.5.2 酶偶聯(lián)分光光度法測定SOX酶活力以肌氨酸為底物，按照文獻[12]進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同因素對SOX包涵體復(fù)性的影響

2.1.1 變性可溶蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度對SOX后期復(fù)性的影響用變性液將包涵體的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度調(diào)制為 0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、0.8 mg/mL， 要使溶解液中尿素的濃度不能改變，否則會導(dǎo)致復(fù)性過程中蛋白質(zhì)的沉淀。在室溫下（15℃）透析開始時透析外液中加入6 mol/L的尿素，并添加過量的FAD，加入氧化還原態(tài)（GSH/GSSG）比值為 3的GSH與GSSG，以后每隔4小時將透析外液中尿素的濃度遞減2 mol/L（每次換液時都需要添加4 mg的FAD），復(fù)性結(jié)束后取樣測定SOX的比酶活，見圖2。

圖2 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度對復(fù)性后SOX比酶活的影響Fig.2 Effects of protein concentration on the specific activity of refolded SOX

從圖2可以看出，在蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.1mg/mL時復(fù)性后的酶比活性最高，變性蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度越低，越有利于復(fù)性。但初始蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度太低，復(fù)性后的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度也比較低，不利于活性蛋白質(zhì)的回收。且在蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時蛋白質(zhì)產(chǎn)生部分沉淀，所以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度不宜過高，但考慮到后期工作的復(fù)雜性，復(fù)性時蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度不能過低，所以取0.3 mg/mL。

2.1.2 復(fù)性時間對SOX比酶活的影響使包涵體的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL，室溫下（15℃）首次透析時在透析外液中加入6 mol/L的尿素，以后每隔不同時間（1、2、4、6、8 h）將透析外液中尿素的濃度遞減2 mol/L（每次換液時都需要添加2 mg的FAD），加入氧化還原態(tài) （GSH/GSSG）比值為3的GSH與GSSG，復(fù)性結(jié)束后取樣測定SOX的比酶活，見圖3。

圖3 復(fù)性時間與復(fù)性后SOX比酶活的關(guān)系Fig.3 Relation of renaturation time to the specific activity of refolding SOX

由圖3可知，復(fù)性時間為24 h比酶活比較高，到了32 h，比酶活雖然還在增長但幅度比較小，而且酶復(fù)性時間太久，SOX蛋白質(zhì)分子之間聚集，活性容易下降，故應(yīng)選擇復(fù)性時間為24 h為宜，即每隔6小時更換不同濃度的復(fù)性緩沖液。

2.1.3 復(fù)性溫度對SOX比酶活的影響使包涵體的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL，首次透析時在透析外液中加入6 mol/L的尿素，以后每隔6小時將透析外液中尿素的濃度遞減2 mol/L（每次換液時都需要添加2 mg的FAD），加入氧化還原態(tài)（GSH/GSSG）比值為3的GSH與GSSG，透析24 h后取樣測定SOX的比酶活，研究3個復(fù)性溫度對SOX重折疊的影響，見圖4。

圖4 不同溫度對復(fù)性后SOX比酶活的影響Fig.4 Effect of different temperatures on the specific activity after refolding of SOX

由圖4可知，在4℃條件下復(fù)性的SOX的活性和質(zhì)量回收率均高于在15℃和25℃下復(fù)性的SOX。導(dǎo)致這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因是SOX變性溶解液在重折疊的過程中，分子內(nèi)部的疏水基團有機會暴露在外界環(huán)境中，分子內(nèi)部或者不同分子之間的疏水基團時時刻刻都在發(fā)生布朗運動，溫度升高時布朗運動加劇，導(dǎo)致暴露在外的水基團互相碰撞形成了不正確的折疊造成聚集的產(chǎn)生。而低溫時布朗運動速度慢，疏水基團就不容易發(fā)生接觸形成聚集體。

2.1.4 透析液pH對SOX比酶活的影響復(fù)性透析液的pH值必須在7.0以上，可以促進二硫鍵的正確形成[13]，在前面的研究條件下，使透析液的pH分別為 7.0、7.5、8.0、8.5 和 9.0，加入氧化還原態(tài)（GSH/GSSG）比值為3的GSH與GSSG，在4℃下復(fù)性24 h（每次換液時都需要添加2 mg的FAD），結(jié)束后測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和活性，考察透析液pH值對蛋白質(zhì)復(fù)性的影響，見圖5。

圖5 透析液pH對復(fù)性后SOX比酶活的影響Fig.5 Effect of dialysis pH on the specific activity of refolding SOX

研究顯示，透析液pH為8.5的條件下復(fù)性效果最好，而導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因是SOX變性溶解液在重折疊的過程中，分子內(nèi)部的二硫鍵的正確折疊起著非常重要的作用，而過高或過低的pH會影響二硫鍵的狀態(tài)，二硫鍵復(fù)性時最適宜的復(fù)性pH值一般為8.0～9.0，結(jié)合實驗結(jié)果選擇pH為8.5較為適宜。

2.1.5 透析液氧化還原態(tài)（GSH／GSSG）對復(fù)性SOX的影響氧化還原電勢對于形成正確的二硫鍵非常必要。氧化還原電勢過小，二硫鍵不會產(chǎn)生；氧化還原電勢過高，二硫鍵的形成容易出問題。首先確定GSSG濃度為1 mmol/L，分別加入GSH，使其與GSSG 摩爾比為 0.25、0.5、1、2、3、5， 考 察 GSH 與GSSG比例對SOX復(fù)性的影響，見圖6。

圖6 氧化還原環(huán)境對復(fù)性后SOX比酶活的影響Fig.6 Redox environment after refolding SOX specific activity

圖6顯示，在添加2 mmol/L的GSH條件下復(fù)性效果有明顯提高，因此選擇GSH/GSSG為2。

2.2 不同天然輔基與SOX脫輔基蛋白復(fù)合的研究

2.2.1 圓二色譜檢測不同輔基與脫輔基SOX的復(fù)合通過上述透析復(fù)性得知，在復(fù)性的過程中添加2 mg的FAD作為輔基可以使酶結(jié)構(gòu)正確折疊，使得315位的Cys與FAD輔因子通過二硫鍵結(jié)合。為了判斷不同天然輔基與脫輔基蛋白的復(fù)合是否成功[14]，在透析復(fù)性過程中分別加入4 mg不同的輔基，如FAD、FMN、核黃素，不加任何黃素輔基的設(shè)為空白，采用CD分析不同天然輔基與肌氨酸氧化酶脫輔基蛋白復(fù)合前后二級結(jié)構(gòu)的變化，不同天然輔基與酶復(fù)合的圓二色譜見圖7。

圖7 不同天然輔基與肌氨酸氧化酶脫輔基蛋白復(fù)合的CD分析Fig.7 CD analysis on SOX protein complexed with different natural cofactors

圓二色譜分析脫輔酶蛋白與天然輔基復(fù)合后的二級結(jié)構(gòu)特征峰與游離酶相比完整性降低，酶分子內(nèi)部α-螺旋和β-折疊比例降低，二級結(jié)構(gòu)有所變化，其中添加類似物為FAD與FMN的二級結(jié)構(gòu)峰的完整性沒有太大變化，酶活相差不大；而核黃素和未加任何天然輔基的二級結(jié)構(gòu)峰的完整性發(fā)生巨大變化，α螺旋和β-折疊比例大幅度降低，酶活相差比較大，說明酶的二級結(jié)構(gòu)遭到破壞，SOX酶分子處于變性狀態(tài)。

2.2.2 FTIR分析SOX復(fù)合度的變化采用FTIR分析不同天然輔基與肌氨酸氧化酶脫輔基蛋白復(fù)合前后其官能團的變化，判斷不同天然輔基與脫輔基蛋白的復(fù)合是否成功。不同天然輔基與酶復(fù)合的紅外光譜圖譜見圖8。

圖8 不同天然輔基與肌氨酸氧化酶脫輔基蛋白復(fù)合的FTIR分析Fig.8 FTIR analysisofdifferentnaturalcofactor complexed with SOX apoprotein

由圖8，未添加任何配體的SOX分子中2 500 cm-1左右處出現(xiàn)巰基（-SH）伸縮振動峰，該特征峰在經(jīng)過復(fù)性后明顯增強，說明無輔基酶分子中可能生成另一個二硫鍵，使酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，復(fù)性未成功[15]；添加FAD與FMN作為配體的酶分子波峰結(jié)構(gòu)未發(fā)生比較大的變化，輔基的加入促進了酶的正確折疊，結(jié)合酶活可證明FAD作為輔基與SOX復(fù)性成功，而FMN與脫輔基蛋白不能很好的結(jié)合，復(fù)性不完全。核黃素在2 100 cm-1左右處出現(xiàn)羧基（—COO—）中C=O伸縮振動峰，此特征峰強度在復(fù)合酶中明顯降低，說明羧基載體中羧基含量降低，穩(wěn)定性下降。3 100 cm-1是NH伸縮振動，此特征峰強度在復(fù)合酶中明顯降低，說明氨基載體中氨基含量降低，結(jié)合酶活顯示只能少部分復(fù)性成功。

2.2.3 DSC分析比較SOX游離酶與復(fù)性酶的熱變性利用DSC技術(shù)，分析SOX游離酶與復(fù)性酶其熱變性溫度Tm的變化，分析兩者的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

如圖9所示，游離酶和復(fù)性酶出現(xiàn)了單一的吸熱峰，該吸熱峰則表示分子在升溫過程中構(gòu)象改變伴隨著能量變化。游離酶和修飾酶的熱變性溫度Tm分別為64.03℃和44.6℃，相同的升溫速率，復(fù)性酶的Tm值比游離酶大約降低20℃；與游離酶相比，瓦解復(fù)性酶的天然結(jié)構(gòu)要花費更少的能量；兩者數(shù)據(jù)表示，復(fù)性后的SOX酶分子變得不穩(wěn)定，容易受外界影響。

圖9 游離酶與重構(gòu)酶的DSC分析Fig.9 DSC thermograms of SOX without cofactor and SOX refolded

3 結(jié) 語

作者利用不含輔因子的肌氨酸氧化酶（SOX）包涵體，通過透析復(fù)性處理，確定了較為合適的條件：酶蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.3 g/L，透析液pH為8.5時，溫度 4℃，最佳的氧化還原態(tài)（GSH/GSSG）GSH/GSSG值為2，以及復(fù)性時間為24 h時，SOX酶蛋白的復(fù)性效果相對較好。

研究進一步比較了各種天然輔基與SOX酶蛋白的復(fù)合，發(fā)現(xiàn)外加FAD（非共價的情況下）與脫輔酶蛋白復(fù)合后，酶活性高；二級結(jié)構(gòu)與原酶接近，酶活是原酶的50%；與原酶的α-螺旋與β-折疊的二級結(jié)構(gòu)相似度達80%。FMN的效果次之，酶活是原酶的30%，α-螺旋與β-折疊的二級結(jié)構(gòu)相似度為50%；而加入核黃素后SOX酶分子處于變性狀態(tài)，其對SOX酶的復(fù)性和酶活皆為負影響。