脂肪酶強化水解餐廚油脂促進厭氧消化

曹 蒙， 繆恒鋒， 趙明星， 阮文權

（江南大學 環(huán)境與土木工程學院，江蘇 無錫214122）

隨著餐飲業(yè)的迅猛發(fā)展，餐廚廢水已經(jīng)成為我國主要的污染源之一，其排放量約占城市生活污水排放量的3%[1]。由于餐廚廢水的高鹽分、高有機質(zhì)濃度等特點，相比于好氧處理，厭氧消化處理具有更好的適用性[2-3]。然而，由于食物烹飪過程中使用了大量的動植物油脂，餐廚廢水中的有機物除了碳水化合物和蛋白質(zhì)外，還存在大量油脂成分，相對于碳水化合物和蛋白質(zhì)，油脂的水解速率遠小于前二者[2，4]。因此油脂會逐漸在厭氧系統(tǒng)內(nèi)積累導致污泥上浮，并形成泡沫浮渣層，影響厭氧反應器的正常運行。此外，油脂水解產(chǎn)生的長鏈脂肪酸（LCFAs）會吸附在微生物細胞膜表面阻礙傳質(zhì)過程，抑制微生物活性，進而影響處理效率和系統(tǒng)穩(wěn)定性[3]。為解決上述問題，通常在生物處理前采用預處理對油脂進行針對性去除，傳統(tǒng)的預處理方法有加壓氣浮法、化學混凝法、熱水解和酸/堿處理等。加壓氣浮法具有產(chǎn)生的污泥量少、油水分離效率高等優(yōu)點，但其處理耗時長且能耗高；化學混凝法能去除乳化油等，但是混凝劑的選取較為復雜并且污泥產(chǎn)生量大；熱水解能將大分子的蛋白質(zhì)分解成溶于水的小分子，產(chǎn)生的較高濃度氨氮保證了系統(tǒng)的可生化性和緩沖能力[5]，但需高溫高壓條件，其能耗較大；而酸預處理通常采用硫酸或鹽酸，對厭氧體系初始pH值的影響較大；堿法預處理對后續(xù)的厭氧過程有較好的促進作用，但更小的油脂顆粒尺寸易懸浮于污泥表面，不利于微生物對油脂的直接利用[6-7]。以上方法均存在各自的問題，亟需新的預處理方法用以減少或解決這些問題。

脂肪酶預處理具有很好的環(huán)境相容性，可以有效提高油脂的水解效率，其在含油廢水處理過程中的研究受到廣泛關注[8]。脂肪酶作用于油水界面，可將甘油三酯催化水解為LCFAs和甘油，而LCFAs在產(chǎn)乙酸菌（β-氧化）和產(chǎn)甲烷菌的作用下轉變成甲烷[9]。 Márcia等[10]采用上流式厭氧污泥床（UASB）反應器處理乳制品廢水，發(fā)現(xiàn)經(jīng)酶法預處理的乳制品廢水（油脂質(zhì)量濃度1 000 mg/L）可以實現(xiàn)其化學需氧量（COD）去除率達到90%。另外，有研究人員對脂肪酶的投加方式對油脂厭氧消化的影響進行了研究。Ying等[2]對餐廚垃圾進行了預水解+厭氧消化和同步水解+厭氧消化處理的比較，發(fā)現(xiàn)預水解后餐廚垃圾的甲烷產(chǎn)率高于同步處理組4.97%～26.50%。Adriano等[8]也認為酶促預處理含油廢水的厭氧效果更好，并把原因歸結于預處理后油脂在水中的溶解度及其可生物利用性的提高。

近年來，脂肪酶預處理方法被廣泛應用于屠宰場廢水、石油加工廢水等的處理，但是其對餐廚廢水中油脂預處理的研究和應用鮮有文獻報道。考慮到餐廚廢水自身的特點，作者先從酶用量、水油比、溫度和pH等方面考察華根霉脂肪酶對餐廚油脂水解效率的影響，并在此基礎上進行響應面分析（RSM）確定最優(yōu)水解條件。然后在最優(yōu)水解條件下進行預處理并進一步考察其對餐廚廢水厭氧消化性能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

餐廚油脂和餐廚廢水：取自蘇州某餐廚垃圾處理公司，餐廚廢水為去除固形物和大部分油脂后的廢水；接種污泥：取自江南大學環(huán)境與資源研究室處理餐廚廢水的厭氧膜生物反應器；脂肪酶：華根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶，粉末狀，其適宜的溫度和pH范圍分別為30～45℃和7.5～9.0，由江南大學生物工程學院提供。餐廚油脂的性質(zhì)見表1，餐廚廢水和接種污泥的性質(zhì)見表2。

表1 餐廚油脂性質(zhì)Table 1 Characteristics of kitchen waste grease

表2 餐廚廢水及接種污泥的性質(zhì)Table2 Characteristicsofkitchen wastewater and inoculum

1.2 實驗方法

酶促餐廚油脂水解將一定量的脂肪酶加入250 mL錐形瓶中，加入一定pH的磷酸緩沖液（0.05 mol/L，以 PO43-計），振蕩使酶分散均勻，將錐形瓶放入恒溫水浴中，水浴溫度與所設水解反應溫度相同，使酶活化30 min，然后快速加入一定量的餐廚油脂，保鮮膜封口，置于恒溫振蕩水浴中（150 r/min）開始反應。根據(jù)前期水解反應預實驗可知，120 h油脂水解最充分，因此設置反應時間為120 h。實驗從酶用量（質(zhì)量分數(shù)0.06%、0.10%、0.30%、0.50%、1.00%和 2.00%）、 水油質(zhì)量比（0.1、0.3、0.5、1.0 和 1.5）、 溫度 （35、40、45、50、55、60 ℃）和 pH（6.5，7.0，7.5，8.0，8.5、9.0）4 個方面考察脂肪酶對餐廚油脂的水解情況，并在單因素實驗的基礎上進行響應面條件優(yōu)化分析。

餐廚廢水厭氧消化實驗為了評價酶法預處理對餐廚廢水（和油脂）厭氧消化的影響，實驗分為三組：第一組為餐廚廢水組（對照組），向500 mL血清瓶中加入餐廚廢水；第二組為含油廢水組，向餐廚廢水中加入油脂，使得餐廚廢水中的含油量達到3%；第三組為加酶組，在第二組的基礎上，加入相當于餐廚廢水中油脂量1.15%的脂肪酶。根據(jù)響應面分析得出的最優(yōu)預處理條件，調(diào)節(jié)三組廢水初始 pH 值為 8.0±0.1，并置于（42.5±0.5） ℃的振蕩水浴（150 r/min）中預處理24 h。預處理后，向3組血清瓶中加入相應體積的接種污泥，使厭氧消化系統(tǒng)的接種比（F/M）為1.5，并加水定容至400 mL。調(diào)節(jié)反應體系初始pH值為7.4～7.6，發(fā)酵溫度為（37.0±0.5）℃。每組實驗設置3組平行實驗，取平均值。甲烷產(chǎn)量采用產(chǎn)甲烷潛力測試儀（AMPTS）測定。

1.3 測定方法

餐廚油脂的皂化值采用GB/T 5534-2008（動植物油脂皂化值的測定）法[11]；碘值采用GB/T 5532-2008（動植物油脂碘值的測定）法[12]；酸價采用GB/T 5530-2005（動植物油脂酸值和酸度測定方法）法[13]；餐廚廢水中油脂含量采用索氏提取法[14]；TS和VS采用質(zhì)量法[15]；COD采用重鉻酸鉀法[15]；淀粉采用硫酸苯酚法[16]；蛋白質(zhì)采用福林酚法[17]；脂肪酶活性采用對硝基苯酚棕櫚酸酯法（pNPP）[18]；污泥的脫氫酶活性采用氯化三苯基四氮唑（TTC）比色法[19]；揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）采用高效液相色譜儀測定。檢測條件：檢測器波長210 nm，ZORBAX SB-A色譜柱（150 mm×4.6 mm×5 μm ID，Agilent），柱溫 35 ℃；流動相：0.5%乙腈和 99.5%的KH2PO4（0.02 mol/L）混合溶液[20]。

2 結果與分析

2.1 餐廚油脂水解條件優(yōu)化研究

單因素實驗酶用量對油脂水解效率的影響見圖1（a）。酶用量從0.06%上升至2.00%時，油脂水解率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。較適宜的酶用量范圍為0.30%～2.00%，能夠保證水解率在90%左右。在酶用量為0.50%時，油脂水解率最高。當酶用量超過0.50%，水解率有所降低。這可能一方面是因為脂肪酶對油脂的水解作用發(fā)生在油水界面，酶加入量過多導致油水界面被酶所飽和，而使得酶在界面聚集，導致水解率下降[21]；另一方面是因為酶用量較大時，產(chǎn)物對其水解有抑制作用，從而使得水解率下降[22]。

水油比對脂肪酶水解油脂的影響見圖1（b）。水油比為0.5時水解率最大；繼續(xù)增大水油比，油脂水解率略有下降。因此，較適宜的水油比范圍定為0.3～1.5。脂肪酶是一種界面激活酶，因此油脂水解體系中水、油的比例對兩者的有效接觸面積和水解率有很大影響[23-24]；此外，過量的水可稀釋油水界面上生成的甘油，降低其濃度，促進水解反應向正反應方向進行；而水油比過高會降低脂肪酶的相對濃度，使得水解率下降[23]。

溫度對脂肪酶水解油脂的影響主要表現(xiàn)在兩個方面：1）溫度升高可增加油脂在水中的溶解度，增加水和油的接觸面積，加快水解反應；2）當超過酶的適宜溫度范圍時，溫度升高使得脂肪酶迅速變性失活，酶失活速率遠大于反應速率的增加程度，從而使得油脂水解率降低[21-22]。由圖1（c）可知，隨著溫度的升高，油脂水解率呈上升趨勢，溫度為40℃時，其水解率最大；當溫度超過50℃時，水解率迅速降低。因此，適宜的溫度范圍定為35～50℃。

pH是決定酶催化活性的重要參數(shù)之一，pH過低或過高均會破壞脂肪酶的空間結構，影響酶分子活性部位基團的離子化狀態(tài)，從而導致酶蛋白失活，油脂水解率下降[25]。由圖1（d）可知，油脂水解率隨pH的增加呈現(xiàn)先升高后略微下降的趨勢；當pH值為8.0時，其水解率達到最大值，這與高巍等[26]的結論一致。

圖1 不同酶用量、水油比、溫度和pH對油脂水解的影響Fig.1 Effects of different enzyme dosages，ratios of water to oil，temperatures and pH on the grease hydrolysis

油脂水解參數(shù)的優(yōu)化由于影響脂肪酶水解餐廚油脂的酶用量、水油比、pH和溫度是相互影響的因素，單因素分析方法并不能有效地分析各因素的影響顯著程度及因素之間的交互作用。因此，在單因素試驗的基礎上，應用響應面分析法中的Box-Behnken Design（BBD）對酶用量、水油比、溫度、pH進行三水平的實驗設計。實驗設計見表3，BBD實驗設計方案及實驗結果見表4，水解時間均為120 h。

對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，可得4個影響因素，即酶用量（X1）、水油比（X2）、溫度（X3）和 pH（X4）的編碼值影響油脂水解反應的數(shù)學模型：

水解率=92.6+0.49X1+0.79X2-0.3X3+1.11X4-0.47X1X2+0.47X1X3-1.91X1X4-0.24X2X3+0.5X2X4+0.2X3X4-4.84X12-2.12X22-3.08X32-3.62X42

表3 BBD實驗因素和水平表Table 3 Variable factors and their levels used in BBD

表4 BBD實驗設計方案及實驗結果Table 4 BBD arrangement and responses

應用方差分析（ANOVA）二次模型的擬合度，表5給出了模型ANOVA分析的結果?？芍撃Ｐ偷臎Q定系數(shù)為0.982 6，變異系數(shù)（0.74）相對較低，說明了實驗數(shù)據(jù)的精確度較高，可靠性較好；而校正系數(shù)為0.965 2，也證明了該模型顯著，表明油脂水解率的預測值和實驗數(shù)據(jù)較為一致；在實驗變量的范圍內(nèi)，該模型能較好地進行預測[27]；信噪比為26.173（＞4），可知該回歸方程的擬合度和可信度均較高。在誤差分析中，失擬項的P值為0.086 0（＞0.05），不顯著，證明了該模型的有效性；模型的P值＜0.000 1，非常顯著。因此，所有統(tǒng)計參數(shù)表明該模型可靠性較高，可用于對實驗數(shù)據(jù)進行分析。

表5 響應面模型的方差分析Table 5 ANOVA of the response surface model

表6給出了響應面模型系數(shù)顯著性檢驗，當P＜0.05時，參數(shù)顯著。由表可知，X4對水解反應的線性影響（P＜0.000 1）和平方影響（P＜0.000 1）均非常顯著，其次是X2，而X3對水解反應的線性影響（P＞0.05）不顯著。此外，除了X1X4的交互作用非常顯著（P＜0.0001），其他任何兩因素的交互作用都不顯著。

表6 響應面模型系數(shù)顯著性檢驗Table 6 Least square fit and significance of the response surface model

續(xù)表6

采用響應面圖描述4個實驗因素對餐廚油脂水解反應的影響。圖2給出了當其中兩個因素保持不變時，另外兩個因素的變化對水解率的影響。圖2（a）中，pH和溫度分別保持8.0和42.5℃，當酶用量從0.30%增至1.15%時，油脂水解率迅速增加；繼續(xù)增大酶用量，水解率則有所降低。從圖2（b）和2（c）中亦可得出相同的結論，根據(jù)模型系數(shù)檢驗可知，酶用量對水解率的影響較為顯著（P＜0.05）。圖2（b）保持水油質(zhì)量比和pH分別為0.9和8.0，當酶用量為1.15%時，水解率隨著溫度的升高而呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢。圖2（c）中保持水油質(zhì)量比和溫度分別為0.9和42.5℃不變，水解率隨著酶用量和pH的增加迅速變大，當酶用量和pH分別達到1.15%和8.0時油脂水解率達到最大值；繼續(xù)增加酶用量和pH水解率略有降低。圖2（d）中增加水油質(zhì)量比或降低溫度，水解率均出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。圖2（e）給出了水油質(zhì)量比和pH的交互作用對油脂水解率的影響，酶用量和溫度分別保持1.15%和42.5℃不變，水解率隨著水油質(zhì)量比和pH的變大而增加，當水油質(zhì)量比和pH分別達到0.9和8.0時，水解率達到最大值；繼續(xù)增大水油質(zhì)量比和pH，水解率則有所降低。pH和溫度對水解率的影響見圖2（f）。酶用量和水油質(zhì)量比分別固定為1.15%和0.9，當增大pH和溫度時，水解率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；此外，水解率隨溫度變化的曲面較為平緩，表明溫度對其影響不顯著，這與表6相符（P=0.134 5＞0.05）。

由響應面優(yōu)化分析得知，華根霉脂肪酶對餐廚油脂的最適水解條件為：酶用量為質(zhì)量分數(shù)1.15%，水油質(zhì)量比為0.9，pH為8.0，溫度為42.5℃，水解率預測值為86.6%。在該實驗條件下重復3次實驗，測得水解率為（88.1±2.2）%，與預測值較為接近，表明該響應面模型能夠很好的預測這4個實驗因素對水解反應的影響。

圖2 因素交互作用對水解反應影響的3D響應面圖Fig.2 3D response surface plots of interactions between independent variables

2.2 餐廚廢水厭氧發(fā)酵研究

日產(chǎn)甲烷量和累積甲烷量的變化為了考察酶促預處理對餐廚廢水以及油脂厭氧消化的作用，作者對比了餐廚廢水組、含油廢水組以及加酶組3組實驗的厭氧消化的效果，單位COD甲烷日產(chǎn)量及甲烷累積產(chǎn)量見圖3。

由圖3（a）可知，反應初期，餐廚廢水組的起始產(chǎn)甲烷速率明顯高于含油廢水組和加酶組，餐廚廢水組在第3天達到產(chǎn)氣高峰，甲烷產(chǎn)量為44.60 mL/g·COD；而其它兩組的第一次產(chǎn)氣高峰均出現(xiàn)在第6 天，甲烷產(chǎn)量分別為 33.33、47.62 mL/g·COD。 這可能是因為含油廢水組中未水解的油脂吸附在微生物表面影響了傳質(zhì)過程，而加酶組中由于預處理大量產(chǎn)生的LCFAs對產(chǎn)甲烷菌的活性有抑制作用[28]，所以出現(xiàn)了第一次產(chǎn)氣高峰均相對延后的現(xiàn)象。隨著時間的延長，餐廚廢水組的甲烷日產(chǎn)量逐漸降低，第19天后，日產(chǎn)量降至2.00 mL/g·COD以下，產(chǎn)甲烷逐漸停止。而含油廢水組和加酶組分別在第13天和第11天出現(xiàn)第二次產(chǎn)氣高峰，日產(chǎn)量分別為 35.23、56.93 mL/g·COD，該過程主要表現(xiàn)為油脂在水解后的甲烷化。然而加酶組無論在產(chǎn)甲烷速率還是在產(chǎn)甲烷量方面，都比含油廢水組表現(xiàn)突出，顯示了脂肪酶預處理能夠很好地提高油脂的產(chǎn)甲烷效率。

圖3 反應體系單位COD甲烷日產(chǎn)量和甲烷累積產(chǎn)量的變化Fig.3 Daily methane yield and cumulative methane yield during anaerobic digestion processes

另一方面，從3組實驗的累積產(chǎn)甲烷量看，反應前11天，由于含油廢水組和加酶組中油脂與LCFAs的存在，兩組的累積甲烷產(chǎn)量均低于餐廚廢水組；而隨著微生物對油脂的適應和降解[29]，加酶組在第11天第二次產(chǎn)氣高峰出現(xiàn)，其累積甲烷產(chǎn)量迅速超越餐廚廢水組，而到第18天含油廢水組的累積甲烷產(chǎn)量也高于餐廚廢水組，卻低于加酶組。反應最終，三組累積甲烷產(chǎn)量分別為368.86、499.47、572.12 mL/g·COD；相比于餐廚廢水組，含油廢水組和加酶組的累積甲烷產(chǎn)量分別提高了35.41%和55.10%，而加酶組的累積產(chǎn)甲烷量則比含油廢水組提高了14.56%。表明油脂具有很高的產(chǎn)甲烷潛力[30]，并且脂肪酶預處理含油廢水能提高甲烷產(chǎn)量，這與Adriano[8]等人的研究結論一致。

pH值和VFAs質(zhì)量濃度的變化為了進一步考察油脂和脂肪酶的加入對厭氧發(fā)酵過程的影響，對反應體系中的pH和VFAs質(zhì)量濃度進行了分析。pH是厭氧消化系統(tǒng)最關鍵的影響因素，產(chǎn)甲烷菌的生長pH范圍一般控制在6.5～7.5。3組實驗組體系內(nèi)pH變化情況見圖4（a）。反應第1天，三組pH迅速降低，這是因為反應剛開始，底物中的營養(yǎng)物質(zhì)水解產(chǎn)生了大量的VFAs，從而導致體系中的pH迅速下降。隨著反應的進行，產(chǎn)甲烷菌逐漸利用有機酸，體系pH開始升高。厭氧發(fā)酵過程中，三組實驗組的pH變化趨勢基本相同，并且反應過程中pH值維持在7.1～7.8，保證了厭氧消化的正常進行。

厭氧消化過程中，底物中的有機質(zhì)被厭氧微生物轉變成VFAs，它是厭氧過程中有機質(zhì)水解酸化的產(chǎn)物，同時也是產(chǎn)甲烷菌的利用底物，VFAs質(zhì)量濃度大小常常作為評價水解酸化和產(chǎn)甲烷平衡的重要指標[31]，VFAs質(zhì)量濃度過高會抑制甚至終止產(chǎn)甲烷過程[32]。圖4（b）為消化液中VFAs質(zhì)量濃度變化圖，3組實驗組的VFAs質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，與pH值的變化趨勢相反，因為反應初期產(chǎn)酸菌的生長代謝速率快于產(chǎn)甲烷菌的生長代謝，隨著反應的進行產(chǎn)甲烷菌大量繁殖，其對體系中VFAs的消耗變大，因此反應后期VFAs質(zhì)量濃度呈下降趨勢。反應第5天，加酶組VFAs質(zhì)量濃度達到最高值4 486 mg/L，分別是餐廚廢水組（3 279 mg/L）和含油廢水組（3 109 mg/L）最大值的1.37倍和1.44倍。此外，3組VFAs質(zhì)量濃度在0～14 d均保持較高質(zhì)量濃度（＞800 mg/L），而這期間三組甲烷日產(chǎn)量也較高（＞11.5 mL/g·COD），說明產(chǎn)甲烷菌的活性與體系中的VFAs質(zhì)量濃度有一定正相關關系；第15天之前，加酶組的VFAs質(zhì)量濃度明顯高于其他兩組，這可能是因為預處理加速了油脂的水解，更有助于產(chǎn)酸菌對油脂的利用，使得產(chǎn)酸量明顯較高。反應17 d后，含油廢水組的VFAs質(zhì)量濃度高于加酶組，因為未經(jīng)預處理的油脂的水解酸化過程較緩慢，因此出現(xiàn)反應后期VFAs質(zhì)量濃度較高的現(xiàn)象。

圖4 反應體系內(nèi)pH值和VFA的變化Fig.4 Variations of pH and VFA during anaerobic digestion processes

2.2.3脫氫酶活性的變化 厭氧過程中的氧化還原反應主要源于脫氫酶的催化，脫氫酶是一種胞內(nèi)酶，與細胞內(nèi)的氧化磷酸化過程關系緊密[33]。作者選用脫氫酶活性的變化來表征污泥活性的變化。圖5中三組脫氫酶活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這可能是因為反應初期底物中營養(yǎng)物質(zhì)較多，微生物大量繁殖導致脫氫酶活性增大；隨著反應的進行，底物不斷被消耗使得脫氫酶活性降低[30]。反應初期，脫氫酶活性迅速升高，3組均在第二天達到最大值，分別為 272.7、114.3、189.2 TF μg/（L·h）；由此可見，反應初期餐廚廢水組的脫氫酶活性明顯高于加酶組，含油廢水組的活性最低，這可能是因為油脂粘附在微生物表面會阻礙傳質(zhì)過程進而影響微生物活性，并且LCFAs對微生物活性有一定的抑制作用[3]。此外，由于甘油酯經(jīng)酶預處理轉變成了相對分子質(zhì)量較小的甘油和LCFAs，油脂的溶解性提高更易接近微生物，底物中可被利用的營養(yǎng)物質(zhì)濃度升高[5，8]，從而導致了加酶組脫氫酶活性高于含油廢水組。

圖5 反應體系內(nèi)脫氫酶活力的變化Fig.5 Change of dehydrogenase activity during anaerobic digestion processes

3 結 語

1）對華根霉脂肪酶催化餐廚油脂水解反應的參數(shù)進行了研究，在單因素實驗的基礎上，應用BBD進行四因素三水平的實驗設計，對實驗結果進行響應面分析，可得華根霉脂肪酶對餐廚油脂的最適水解條件為：酶用量為1.15%，水油質(zhì)量比為0.9，pH為8.0，溫度為42.5℃，水解率預測值為86.6%，重復實驗水解率為（88.1±2.2）%，兩者較接近，表明該響應面模型能較好地預測餐廚油脂的水解情況。

2）脂肪酶預處理后餐廚廢水的厭氧消化結果表明，加酶實驗組的最終累積甲烷產(chǎn)量（572.12 mL/g·COD）是餐廚廢水組（368.86 mL/g·COD）和含油廢水組（499.47 mL/g·COD）的1.55倍和 1.15倍。系統(tǒng)pH維持在7.1～7.8；VFA質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先上升后下降最后趨于平緩的趨勢，不存在累積現(xiàn)象；加酶實驗組脫氫酶活性最高達 189.2 TF μg/（L·h），比含油廢水組提高了65.53%。脂肪酶預處理是提高含油廢水厭氧消化效率的有效途徑之一。