一株產(chǎn)柚苷酶菌株的ARTP誘變育種及培養(yǎng)基的優(yōu)化

袁文博， 江 波， 張 濤

（食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

柚苷酶是由 α-L-鼠李糖苷酶 （α-L-rhamnosidase，EC 3.2.1.40）和 β-D-葡萄糖苷酶（β-D-glucosidase，EC 3.2.1.21）組成的酶復(fù)合體[1]。 它可作用于柚皮苷、槲皮苷、柴胡皂苷、蘆丁、橘皮苷等架構(gòu)末端有α-鼠李糖和β-葡萄糖的人工或天然的糖苷類化合物[2]。柚苷酶可以將蕓香科水果果汁中最主要的苦味物質(zhì)柚皮苷分兩步水解成鼠李糖、柚皮素和葡萄糖，以達(dá)到脫苦的目的[3]，這兩種酶在參與反應(yīng)過程中是先后起作用的，具體反應(yīng)如下：

與其他脫苦方法相比，酶法脫苦具有效果好、無污染、成本低、工藝簡(jiǎn)單、專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、不破壞果汁中的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成份等優(yōu)點(diǎn)[3]，具有良好的應(yīng)用前景。除此之外，柚苷酶在活性物質(zhì)改性[4]、增強(qiáng)物質(zhì)生物學(xué)活性[5]、葡萄酒的增香[3]、物質(zhì)的分離制備[6]、制藥工業(yè)[7]等方面的應(yīng)用也日益廣泛。

柚苷酶的來源非常廣泛，植物、動(dòng)物和微生物中均有發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在柚苷酶的來源以微生物為主。例如胡奎[8]從土壤中分離出了一株搖瓶產(chǎn)酶達(dá)291 U/mL，經(jīng)NTG誘變后可達(dá)1 282 U/mL。文蓉[9]在發(fā)霉的柚子皮上篩選到一株產(chǎn)柚苷酶的青霉菌，經(jīng)誘變后酶活達(dá)573.6 U/mL。據(jù)報(bào)道，國(guó)外已有少量的柚苷酶實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，但價(jià)格昂貴，難以適應(yīng)食品工業(yè)的需求。而在國(guó)內(nèi)并沒有實(shí)現(xiàn)柚苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)，主要是缺乏適合工業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株[10]；其次是缺少成熟的柚苷酶液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝。因此，發(fā)現(xiàn)新的柚苷酶微生物來源，并研究其發(fā)酵柚苷酶的條件具有重要的科學(xué)研究及應(yīng)用價(jià)值。

從自然界篩選出來的野生菌株通常具有遺傳不穩(wěn)定、性能和耐受性差等缺點(diǎn)，常常不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求，因此采用不同的方法對(duì)分離出來的野生菌株進(jìn)行誘變選育是不可或缺的[11]。新型常壓室溫等離子體（ARTP）誘變系統(tǒng)，通過發(fā)射含有活性粒子的等離子體，能夠有效引起DNA的多樣性損傷，最終導(dǎo)致微生物突變。ARTP生物誘變育種技術(shù)與傳統(tǒng)微生物誘變方法相比，具有安全性高、操作簡(jiǎn)易、成本低、快速有效等優(yōu)勢(shì)[12-14]，已經(jīng)成為微生物誘變育種領(lǐng)域的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。目前，尚未有使用常壓室溫等離子體誘變篩選柚苷酶高產(chǎn)菌株方法的報(bào)道。

作者以實(shí)驗(yàn)室篩選出的一株之前并未報(bào)道過的產(chǎn)柚苷酶菌株A.alternate SK37.001為出發(fā)菌株，通過常溫室壓等離子體誘變，發(fā)酵酶活大幅度提高。之后研究了碳源、氮源等因素對(duì)菌株產(chǎn)柚苷酶的影響，通過單因素、Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)、Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)菌株產(chǎn)柚苷酶的液態(tài)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，目的在于獲得菌株發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的最佳培養(yǎng)基，為進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)柚苷酶提供了技術(shù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株互隔交鏈孢霉（A.alternate）：保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，編號(hào)為CCTCC NO：M 2015309。

1.1.2 培養(yǎng)基斜面保藏培養(yǎng)基采用馬鈴薯培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯 200，蔗糖 20，瓊脂 20；pH 自然，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基與初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖5、柚皮苷 5，NaNO32，K2HPO41，KCl 0.5，MgSO40.5，F(xiàn)eSO40.1；pH 自然，121 ℃滅菌 20 min。

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀：Agilent 1200；色譜柱：Sepax GP-C18 4.6 mm×250 mm；超聲波細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物科技有限公司SCIENTZ-ⅡD；ARTP微生物誘變育種機(jī)：北京思清源生物技術(shù)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 柚苷酶粗酶液的制備將菌株在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，以5%的接種體積分?jǐn)?shù)接種在含40mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，在30℃、200 r/min條件下?lián)u瓶發(fā)酵96 h，取發(fā)酵液在常溫下10 000 r/min離心20 min后收集菌體沉淀，用pH 4.0的磷酸氫二鈉（0.1 mol/L）-檸檬酸（0.05 mol/L）緩沖液洗滌菌體3次，用與發(fā)酵液等體積的緩沖液溶解，用6 cm的超聲波探頭超聲破碎10 min，功率為20%，得到懸浮液在10 000 r/min下離心10 min，取上清液即為胞內(nèi)粗酶液。

1.3.2 酶活測(cè)定方法

1）樣品的前處理：取2 mL用緩沖液制備的0.1%柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液于小離心管中，在40℃的恒溫振蕩水浴中預(yù)熱5 min。接著用移液槍加入0.1 mL的粗酶液，充分振蕩混勻，精確計(jì)時(shí)保溫10 min后從恒溫水浴中取出放入沸水浴中10 min，使酶失活，加入1.9 mL的甲醇溶液，經(jīng)10 000 r/min離心10 min后取上清液。空白為加入滅活的粗酶液，其他操作相同。

2）柚皮苷和柚皮素的定性定量測(cè)定：將處理后的反應(yīng)液用0.22 μm的濾膜過濾，用HPLC（采用Sepax C18色譜柱）檢測(cè)柚皮苷和柚皮素的峰面積。色譜條件：流動(dòng)相組成為 V甲醇∶V水=1∶1，流速 1 mL/min，柱溫 35℃，檢測(cè)波長(zhǎng) 280 nm，進(jìn)樣量 10 μL。

3）柚苷酶酶活力的定義：在溫度40℃、pH 4.0條件下，每分鐘消耗1 μg柚皮苷為1 U。

1.3.3 互隔交鏈孢霉的常壓室溫等離子體誘變方法

1）單孢子懸浮液的制備：取活化好的A.alternate SK37.001斜面，用無菌生理鹽水沖洗，將其裝入含有無菌玻璃珠的搖瓶?jī)?nèi)振蕩15 min，采用無菌雙層擦鏡紙過濾，即得單孢子懸液。然后用血球計(jì)數(shù)板對(duì)懸液中的孢子進(jìn)行鏡檢計(jì)數(shù)，并將孢子濃度調(diào)整到 106～107個(gè)/mL。

2）ARTP誘變操作：將10 μL的孢子懸液均勻涂步于金屬載片的表面上。采用氦氣為工作氣體，設(shè)置處理功率為120 W，處理距離為2 mm，氣流量為10 SLM，在此條件下對(duì)A.alternate SK37.001進(jìn)行誘變處理。為了尋找最佳的誘變處理時(shí)間，作者將孢子分別處理 0、20、30、40、50、60、80、100、120 s，對(duì)處理過的樣品在適當(dāng)?shù)南♂尪认峦堪?，通過CFU來計(jì)算致死率，并繪出致死曲線[15]。

致死率（%）=（（U－T）/U）×100%

式中，U為不經(jīng)誘變處理生長(zhǎng)的菌落數(shù)；T為經(jīng)誘變處理后生長(zhǎng)的菌落數(shù)。

1.3.4 生物量的測(cè)定將搖瓶發(fā)酵液于10 000 r/min離心10 min，將沉淀用蒸餾水洗滌3次，置于105℃下烘干至恒重，冷卻后稱重。

1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的試驗(yàn)設(shè)計(jì)按照1.3.1的方法，通過酶活的比較，分別考察碳源的種類和最佳配比、氮源的種類對(duì)A.alternate發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上采用Plackett-Burman試驗(yàn)篩選重要因子，然后對(duì)重要因子進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定重要因子的最佳添加量，最后根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)原理，用design expert 8.0.6軟件在最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得到響應(yīng)面模型，最終確定最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件，并進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與討論

2.1 常溫室壓等離子體誘變對(duì)互隔交鏈孢產(chǎn)柚苷酶的影響

按方法1.3.3對(duì)A.alternata SK37.001誘變致死率進(jìn)行計(jì)算，得到致死率曲線，見圖1。

圖1 ARTP誘變對(duì)互隔交鏈孢霉SK37.001的致死率曲線Fig.1 Lethality rate of Alternaria alternata 37.001 by ARTP

從圖1可以看出，等離子體對(duì)互隔交鏈孢霉SK37.001的致死率存在著顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系，誘變時(shí)間越長(zhǎng)，菌株的致死率越高。ARTP對(duì)互隔交鏈孢霉具有很強(qiáng)的致死率，當(dāng)誘變時(shí)間為80 s時(shí)，致死率就超過90%，而誘變時(shí)間達(dá)到150 s時(shí)，幾乎沒有存活。由于誘變產(chǎn)生的正突變具有隨機(jī)性，為了保證篩選到正突變菌株，同時(shí)也能夠快速分離生存能力高的菌株，故選取處理時(shí)間為80、100、120 s，三個(gè)不同致死率下的孢子懸液進(jìn)行混合涂布。

通過涂布后生長(zhǎng)菌株透明圈的大小進(jìn)行初篩，然后復(fù)篩得到了一株產(chǎn)酶能力達(dá)327.32 U/mL的菌株，相比于野生菌株產(chǎn)酶能力提高了近208%，菌體干重增長(zhǎng)了123.7%，把此誘變后的菌株命名為Alternaria alternata SK37.002，通過遺傳性狀穩(wěn)定性試驗(yàn)，Alternaria alternata SK37.002在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)8代，菌株生長(zhǎng)穩(wěn)定，其柚苷酶產(chǎn)量穩(wěn)定在316.14～331.23 U/mL之間，表明該菌株遺傳性能穩(wěn)定。

2.2 不同碳源對(duì)互隔交鏈孢產(chǎn)柚苷酶的影響

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)蔗糖或葡萄糖質(zhì)量濃度大于5 g/L時(shí)，會(huì)抑制柚苷酶的產(chǎn)生。所以分別選取柚皮苷和鼠李糖為誘導(dǎo)物，選取最適誘導(dǎo)物的添加量，同時(shí)尋找最適的碳源，以下面4種情況探究最佳配比的碳源。

1）以柚皮苷為惟一碳源：分別配制含0.5、1、1.5、2、2.5 g/L 的柚皮苷培養(yǎng)基；

2）以鼠李糖為惟一碳源：分別配制含0.5、1、1.5、2、2.5 g/L 的鼠李糖培養(yǎng)基；

3）以5 g/L葡萄糖為基礎(chǔ)碳源：分別配制含0.5、1、1.5、2、2.5 g/L 的柚皮苷作為誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基；

4）以5 g/L的蔗糖為基礎(chǔ)碳源：分別配制含0.5、1、1.5、2、2.5 g/L 的柚皮苷作為誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基。

在相同培養(yǎng)條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，每種碳源做3次平行實(shí)驗(yàn)，4 d后用HPLC法測(cè)酶活，取平均值，以柚皮苷或鼠李糖添加量為橫坐標(biāo)，柚苷酶酶活為縱坐標(biāo)，得到不同碳源對(duì)Alternaria alternata SK37.002產(chǎn)柚苷酶的影響見圖2。

圖2 不同碳源對(duì)互隔交鏈孢酶SK37.002產(chǎn)柚苷酶的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on naringinase productivity of Alternaria alternata SK37.002

微生物與糖利用有關(guān)的許多酶都是誘導(dǎo)性的，柚苷酶也是誘導(dǎo)酶。由圖2可以看出，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中是否添加誘導(dǎo)物顯著影響其產(chǎn)酶，說明A.alternata SK37.002產(chǎn)柚苷酶需要誘導(dǎo)物誘導(dǎo)，這與胡奎[8]的研究結(jié)果相同。底物柚皮苷和產(chǎn)物鼠李糖均有誘導(dǎo)作用，其中柚皮苷誘導(dǎo)作用更好，而且添加量為1.5 g/L時(shí)菌株產(chǎn)酶能力即達(dá)到頂點(diǎn)，再繼續(xù)添加柚皮苷酶活增加不明顯。在以柚皮苷為誘導(dǎo)物時(shí)，用蔗糖作為碳源比葡萄糖更適宜，究其原因可能是因?yàn)槠咸烟亲鳛樘荚磿r(shí)，會(huì)形成葡萄糖效應(yīng)[16]。同時(shí)含有一定量的蔗糖可以加快孢子萌發(fā)、加速菌絲生長(zhǎng)[17]，非常有助于胞內(nèi)酶酶活的提高。最終選取5 g/L的蔗糖作為碳源，1 g/L的柚皮苷作為誘導(dǎo)物。

2.3 不同氮源對(duì)互隔交鏈孢SK37.002產(chǎn)柚苷酶的影響

在最適碳源和誘導(dǎo)物的基礎(chǔ)上，分別配制添加量為 4 g/L 的蛋白胨、酵母提取物、（NH4）2SO4、牛肉膏、NaNO3、玉米漿這6種不同氮源的培養(yǎng)液，以1.3.1的方法進(jìn)行培養(yǎng)，每種氮源做3次平行實(shí)驗(yàn)，用HPLC法測(cè)酶活，并取平均值，結(jié)果見圖3。

圖3 不同氮源對(duì)A.alternata SK37.002產(chǎn)柚苷酶的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources on naringinase productivity of A.alternata SK37.002

從圖3可以看出，氮源對(duì)互隔交鏈孢霉產(chǎn)柚苷酶的影響較大，當(dāng)以硫酸銨、酵母提取物、蛋白胨作為氮源時(shí)，酶活偏低；而硝酸鈉作為氮源時(shí)，柚苷酶酶活最高，為467.96 U/mL，其次是牛肉膏、玉米漿。這可能是由于A.alternata能夠更好地利用NO-中的氮離子，所以最后選擇硝酸鈉為A.alternata SK37.002菌株產(chǎn)柚苷酶的最佳氮源。

2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基成分的基礎(chǔ)上，選取柚皮苷質(zhì)量濃度、硝酸鈉質(zhì)量濃度、溫度、時(shí)間、氯化鈣質(zhì)量濃度、接種體積分?jǐn)?shù)、硫酸鎂、磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度這8個(gè)可能影響互隔交鏈孢霉SK37.002發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的因素進(jìn)行全面考察，選用n=12的Plackett-Burman設(shè)計(jì)。每個(gè)因素取高（+1）低（-1）兩個(gè)水平，其中低水平為未優(yōu)化的原始培養(yǎng)基，高水平為低水平的1.25倍左右。PB試驗(yàn)方案及試驗(yàn)測(cè)定柚苷酶酶活的結(jié)果見表 1。 A、B、D、E、G、H、J、K 分別代表柚皮苷質(zhì)量濃度、硝酸鈉質(zhì)量濃度、溫度、時(shí)間、氯化鈣質(zhì)量濃度、接種體積分?jǐn)?shù)、硫酸鎂質(zhì)量濃度和磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度，C、F、I為虛擬項(xiàng)，用于估計(jì)誤差，排除干擾。

用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表1的數(shù)據(jù)進(jìn)行柚苷酶活影響因子的顯著性分析，結(jié)果見表2。

表1 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 1 Design and results of the Plackett-Burman experiment

表2 柚苷酶活影響因子的顯著性分析Table 2 Significant factor analysis of naringinase activity

由表2可以看出，對(duì)A.alternata SK37.002產(chǎn)柚苷酶影響較大因素主要有硝酸鈉（p=0.003 7）、氯化鈣（p=0.049）、磷酸氫二鉀（p=0.031），這 3 個(gè)因素對(duì)產(chǎn)酶影響較為顯著，其中硝酸鈉的p值小于0.01，可信度高于99%，氯化鈣和磷酸氫二鉀p值小于0.05，大于0.01，可信度高于95%。其中硝酸鈉的回歸系數(shù)為正數(shù)，為正效應(yīng)，在設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)時(shí)要適當(dāng)增加其添加量，氯化鈣和磷酸氫二鉀為負(fù)效應(yīng)，設(shè)計(jì)試驗(yàn)時(shí)應(yīng)適當(dāng)減少其添加量。因此，選擇這三個(gè)因素做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

由于響應(yīng)面擬合方程只有在考察的附近區(qū)域里才充分接近實(shí)際的情形，因此應(yīng)使得顯著因素的水平盡量接近最大產(chǎn)酶區(qū)域再創(chuàng)建有效的擬合方程，最陡爬坡實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驖M足此要求。根據(jù)PB試驗(yàn)得到的結(jié)論，設(shè)定爬坡方向和步長(zhǎng)，硝酸鈉每次提高0.5個(gè)單位，氯化鈣和磷酸氫二鉀每次降低0.1個(gè)單位，結(jié)果見表3。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of the steepest ascent experiment

由表3可知，0+△2水平時(shí)柚苷酶酶活達(dá)到最大值，可以確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基在0+△2水平附近，故選此水平為中心點(diǎn)進(jìn)行接下來的響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

2.6 Box-Behnken Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Box-Behnken Design（BBD）法是響應(yīng)面分析法中常用的設(shè)計(jì)方法之一，可以用較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行全面研究，通過對(duì)幾個(gè)響應(yīng)過程變量進(jìn)行數(shù)學(xué)建模和分析來定向優(yōu)化分析的因素[18]。作者依據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)確定的因素與最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定的范圍，采用BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)A.alternate SK37.002發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶培養(yǎng)基進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析，各個(gè)因素與水平見表4，BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表5中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析，得到回歸方程為：Y=612.98+21.68X1-9.23X2+2.24X3-6.06X1X2+1.31X1X3-3.04X2X3-21.02X12-24.14X22-27.71X32，對(duì)二階回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。

表4 BBD試驗(yàn)影響因子和水平設(shè)計(jì)Table 4 Factors and levels of the BBD experiment

表5 BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of the BBD experiment

表6 二次回歸方程的方差分析Table 6 Analysis of variance for the second order equation

從表6可以看出，模型回歸極顯著，其中方程的相關(guān)系數(shù)R2=98.67%，說明回歸方程的擬合程度很好。調(diào)整相關(guān)系數(shù)Adj R2=97.05%，說明響應(yīng)面97.05%的變化可以由此模型解釋，模型與實(shí)際情況擬合得很好。硝酸鈉和氯化鈣對(duì)A.alternate SK.37.002菌株產(chǎn)柚苷酶的影響非常顯著，并且二者之間有較為顯著的交互作用。同硝酸鈉和氯化鈣之間的交互作用相比，硝酸鈉與磷酸氫二鉀、氯化鈣與磷酸氫二鉀之間的交互作用并不顯著。這表明了各因素對(duì)柚苷酶酶活的影響并不是單純的線性關(guān)系，二次項(xiàng)對(duì)柚苷酶活也有重要的影響。表格中失擬項(xiàng)P=0.63，大于0.05，表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)正常，模型合適。

為了確定最佳液態(tài)發(fā)酵條件，用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析。繪制三維立體響應(yīng)面圖，其中每個(gè)響應(yīng)面分析圖分別代表著兩個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用，此時(shí)第三個(gè)變量保持在最佳水平，見圖4。

圖4 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots for the pairwise interactive effects of NaNO3，CaCl2 and K2HPO4 on naringinase activity in final fermentation broth

從圖4可以看出，硝酸鈉、氯化鈣、磷酸氫二鉀添加量與酶活存在顯著的相關(guān)性，回歸方程存在最大值，為了求得 X1、X2、X3的最佳取值，對(duì)所得的回歸擬合方程的變量求一階偏導(dǎo)數(shù)，并令其為0，得到三元一次方程組，求解得出該模型的極值點(diǎn)：X1=3.40、X2=-19.72、X3=1.20，即硝酸鈉、氯化鈣、磷酸氫二鉀的最佳質(zhì)量濃度分別為5.11、0.69、0.83 g/L時(shí)，響應(yīng)值Y達(dá)到最大值，即酶活最高為620.31 U/mL，菌體干重比未優(yōu)化前增長(zhǎng)了142.3%，表7為近5年柚苷酶發(fā)酵酶活的對(duì)比。

表7 近5年柚苷酶發(fā)酵酶活對(duì)比Table 7 Comparison of Naringinase activity in five years

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，在預(yù)測(cè)最佳液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基下進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)3次，為了方便操作，實(shí)驗(yàn)選擇硝酸鈉、氯化鈣、磷酸氫二鉀的質(zhì)量濃度分別為 5，0.7，0.8 g/L，所得的實(shí)際酶活為（624.73±30.33）U/mL，與理論預(yù)測(cè)值620.31 U/mL接近，與初始酶活相比提高了90%。由此可見，響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳培養(yǎng)基成分準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際意義。

3 結(jié)語

作者以實(shí)驗(yàn)室篩選得到的Alternaria alternate為出發(fā)菌株。通過常溫室壓等離子體（ARTP）誘變獲得了一株發(fā)酵酶活達(dá)327.32 U/mL的菌株，產(chǎn)酶能力比野生菌株提高了208%。可以看出ARTP誘變育種技術(shù)是一種新型、有效的微生物誘變育種方法，為柚苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了獲得優(yōu)良菌種的方法。通過單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和Box-Benhnken試驗(yàn)對(duì)該菌產(chǎn)柚苷酶的液態(tài)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，得到Alternaria alternate產(chǎn)柚苷酶的最佳條件：蔗糖5 g/L、柚皮苷1 g/L、硝酸鈉5 g/L，磷酸氫二鉀0.8 g/L，氯化鈣0.7 g/L，氯化鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L。在此條件下，發(fā)酵酶活可達(dá)624.73±30.33 U/mL，比未優(yōu)化之 前增加了90.86%。