N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶基因的克隆及表達

盧利平 ， 陳獻忠 *， 周俊波 ， 沈 微 ， 楊海泉 ， 樊 游

(1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

唾液酸在自然界中分布廣泛，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多生物體內(nèi)都含有唾液酸[1]。N-乙酰-D-神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）是唾液酸家族中最主要成員，占整個唾液酸家族的99%以上，是合成其他唾液酸物質(zhì)的生物前體物質(zhì)[2]。Neu5Ac主要以α-糖苷的形式位于非還原性寡聚糖如糖蛋白和糖脂類的末端[3]。隨著對Neu5Ac生理功能的研究進一步加深，其在食品、醫(yī)藥、疾病診斷等領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越廣泛，Neu5Ac的生產(chǎn)受到越來越多的關(guān)注。傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物提取和化學(xué)合成方法受到原材料不足、反應(yīng)過程復(fù)雜等諸多限制[4-7]，酶催化法和全細胞催化法是非常具有工業(yè)應(yīng)用潛力的Neu5Ac生產(chǎn)方法[8-10]。

酶法或全細胞合成N-乙酰神經(jīng)氨酸的第一步是以N-乙酰-D-葡萄胺（GlcNAc）為底物通過N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶（AGE）的作用異構(gòu)化為N-乙酰甘露糖胺（ManNAc），接著N-乙酰甘露糖胺與丙酮酸在N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶的作用下縮合形成Neu5Ac。AGE是合成Neu5Ac的關(guān)鍵酶，對產(chǎn)物的合成效率起著決定性作用。Maru等[11]首次從豬的腎臟中分離純化得到AGE，后通過cDNA克隆獲得目的基因并實現(xiàn)了在大腸桿菌中的異源表達。雙酶法制備Neu5Ac的方法需要添加ATP和MgCl2，通過固定化酶法也可以獲得Neu5Ac，且酶可以循環(huán)利用[12-14]。大腸桿菌具有遺傳操作容易、生長迅速等優(yōu)點，常常作為細胞催化劑或表達宿主的優(yōu)先選擇，但是由于物種間的差異，表達蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的異源表達大部分形成包涵體，AGE酶活普遍都不高。有報道指出，在大腸桿菌表達魚腥藻CH1AGE獲得的AGE酶活性是豬源AGE的46倍以上，且僅需要極少量的ATP就能達到最大酶活性，用該全細胞催化生產(chǎn)Neu5Ac的產(chǎn)率也高于酶法生產(chǎn)[15]。

Tabata等從集胞藻染色體上克隆得到slr1975基因，并實現(xiàn)了在大腸桿菌中的初步表達[16]。然而，由于重組蛋白質(zhì)的表達水平較低，純化方法較為繁瑣，從而導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)得率較低。作者通過克隆集胞藻AGE基因序列，在根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性對目的基因全序列進行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，選擇帶有T7強啟動子的pET系列表達載體，實現(xiàn)在大腸桿菌BL21（DE3）中高效異源表達，并對其酶學(xué)性質(zhì)進行了研究，從而為酶催化法生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸進行了探索。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株、質(zhì)粒大腸桿菌Escherichia coliJM109與BL21（DE3）菌株以及所用表達載體pET28a質(zhì)粒：江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源和信息中心提供；表達N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶（NanA）的重組大腸桿菌Escherichia coliBL21/pET28a-nanA：由作者所在實驗室前期構(gòu)建。

主要試劑限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶及蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量marker：購自TaKaRa生物技術(shù)公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒和牛血清蛋白：購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司；卡那霉素與異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）：購自上海生工生物工程有限公司；GlcNAc、ManNAc以及Neu5Ac：購自上海西格瑪公司；其他的分析純級試劑：購自上海生物工程公司。

1.2 方法

培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件大腸桿菌培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L），發(fā)酵培養(yǎng)基為TB培養(yǎng)基（胰蛋白胨12 g/L、酵母 提 取 物 24 g/L、 甘 油4 mL，KH2PO42.31 g/L，K2HPO412.54 g/L），1×105Pa滅菌 20 min?？剐院Y選抗生素為卡那霉素（添加質(zhì)量濃度為50 μg/mL）。

目的基因的克隆根據(jù)NCBI公布的集胞藻（Synechocystis sp.PCC 6803）AGE 編碼基因 slr1975（GenBank ID：954945）序列，以及大腸桿菌密碼子利用偏好性對該序列進行密碼子分析、優(yōu)化和人工合成。以優(yōu)化后的DNA序列為模板設(shè)計一對引物，分 別 為 slrF：5’-CGCCATATGATGATGATTGCCCA TCGCCGTC-3’（下劃線為NdeI酶切位點）和slrR：5’-CGGAATTCTTAAGAAACC GGCAGTTGCAGA-3’（下劃線為EcoRI酶切位點），引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)部合成。PCR擴增參數(shù)：95℃變性5 min，然后 94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸1.5 min，30個循環(huán)后16℃保溫30 min，得到的目的基因命名為slr1975-co。

重組表達載體的構(gòu)建將slr1975-co基因PCR產(chǎn)物與pET28a質(zhì)粒同時用NdeI與EcoRI雙酶切，純化處理后用T4 DNA連接酶進行連接，16℃反應(yīng)12 h，連接產(chǎn)物命名為pET28-slr，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，提質(zhì)粒用相應(yīng)的酶酶切鑒定。

AGE的誘導(dǎo)表達挑取重組菌單菌落接種于含有卡那霉素的20 mL液體LB培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)過夜，次日以體積分數(shù)0.5%轉(zhuǎn)接到50 mL含有卡那霉素的新鮮TB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。37℃培養(yǎng)至600 nm吸光值（OD600）為0.6左右，加入500 μL母液濃度為100 mmol/L的IPTG（終濃度為1 mmol/L），轉(zhuǎn)到28℃培養(yǎng)誘導(dǎo)4 h后，4℃、5 000 r/min離心10 min收集菌體[17]。

重組酶的分離純化收集到的誘導(dǎo)細胞濃縮10倍，用pH 7.0的Tris-HCl緩沖液重懸后，超聲波破碎處理，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液得到粗酶液。將粗酶液經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾后，上1 mL HisTrap FF親和層析柱（Noveagen），蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)采用AKTA全自動蛋白質(zhì)分離純化系統(tǒng)，先用上樣緩沖液A液 （8×磷酸緩沖液，20 mmol/L的咪唑，pH 7.4）洗滌，最后用洗脫緩沖液B液（8×磷酸緩沖液，50 mmol/L 的咪唑，pH 7.4）洗脫，流速為0.5 mL/min。每管收集量1 mL，收集峰值部分為純化酶[18]。

SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量以及蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測定取10 μL點樣，12%SDSPAGE電泳檢測，考馬斯亮藍R250染色，用電子掃描系統(tǒng)分析蛋白質(zhì)相對含量。以牛血清蛋白作為標準蛋白質(zhì)，考馬斯亮蘭（Bradford法）測蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度[19]。

重組酶酶活的測定以GlcNAc為底物，利用AGE轉(zhuǎn)化生成ManNAc的酶促反應(yīng)測定轉(zhuǎn)化率確定該酶活性[20]。酶活測定反應(yīng)體系：200 μL酶液加到 200 μL新配制的底物混合物 （500 mmol/L GlcNAc，2 mmol/L ATP， 含 終 濃 度 為 20 mmol/L MgCl2的 100 mmol/L Tris-HCl，pH 7.0） 中，37 ℃金屬浴反應(yīng)30 min，沸水浴煮5 min終止反應(yīng)。4℃、12 000 r/min離心10 min去除變性蛋白質(zhì)，上清液中的GlcNAc與ManNAc通過高效液相色譜法（HLPC）測定，檢測使用Dionex Ultimate3000系統(tǒng)，色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H柱 （300 mm×7.8 mm）有機酸離子層析柱，檢測器為示差檢測器，流動相為10 mmol/L H2SO4，流速為0.5 mL/min，柱溫65℃[15]。其中，一個酶活單位（U）為每分鐘催化1 μmoL的GlcNAc轉(zhuǎn)化生成ManNAc所需的酶量。

酶學(xué)性質(zhì)分析及米氏常數(shù)（Km）的測定測定對GlcNAc、ManNAc的Km值時，分別以GlcNAc或者ManNAc為底物，在pH 6.0、42℃下，測定該酶對底物的反應(yīng)速度[11，21]。按Lineweaver-Burk法作圖。在pH 7.0條件下，將等量的底物混合物與酶液混合后置于不同溫度下（25、30、37、40、42、45、50、55℃）進行酶促反應(yīng)，反應(yīng)時間均為30 min，以此確定該酶的最適溫度。將適量的粗酶液分別在20、30、40 ℃保溫不同時間（30、60、90 min）后，與底物混合物在37℃進行酶促反應(yīng)測定重組酶活性來確定溫度穩(wěn)定性。

配制兩種不同pH緩沖范圍的緩沖液，0.5 mol/L磷酸緩沖液 （pH為5.0、6.0、7.0） 以及 0.5 mol/L Tris buffer緩沖液（pH 為 7.0、8.0、9.0、10.0），配制相對應(yīng)的底物混合物與酶液混合，在37℃下進行酶促反應(yīng)測定酶活，確定其最適反應(yīng)pH。調(diào)節(jié)緩沖液pH 為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0， 用不同 pH 值 A 液回溶菌體破碎離心，取上清液得到不同pH的粗酶液。然后再調(diào)回到pH 7.0的酶液與pH 7.0底物混合物混勻，37℃反應(yīng)30 min以確定其pH的穩(wěn)定性。

調(diào)整底物混合物中不同濃度Mg2+，與粗酶液反應(yīng)，測定不同濃度Mg2+對酶活性的影響；分別用Ca2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+等不同金屬離子代替 Mg2+加入到底物混合物中，以確定不同金屬離子對酶活性的影響。

在確定AGE酶的最適反應(yīng)溫度和最適pH后，在該條件下以不同濃度的底物測定比酶活，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，計算AGE對GlcNAc/ManNA 的Km值[17]。

全細胞催化法合成將E.coli/pET28-nanA和E.coli/pET28-slr分別接種于250 mL的搖瓶，按照1.2.4方法誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心收集細胞后用pH 7.5的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液洗滌2次，用相同的緩沖液重懸菌體（OD600為 20），30 ℃轉(zhuǎn)化 24 h（3次平行）。轉(zhuǎn)化底物為N-乙酰葡萄糖胺0.6 mol/L、丙酮酸1.2 mol/L、Triton X-100 1%，通過HPLC檢測分析轉(zhuǎn)化的底物、中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物。

2 結(jié)與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET28-slr的構(gòu)建

以合成的slr1975-co基因為模板，slrF與slrR為上下游引物PCR擴增得到帶有NdeI與EcoRI酶切位點的目的基因片段，重組質(zhì)粒pET28-slr酶切驗證，見圖 1（a），slr1975-co片段大小為 1 176 bp。載體構(gòu)建流程，見圖1（b），證明重組質(zhì)粒pET28-slr已經(jīng)構(gòu)建成功并導(dǎo)入到大腸桿菌BL21（DE3）中。

圖1 酶切產(chǎn)物電泳檢測圖和重組載體的構(gòu)建流程圖Fig.1 Electrophoresis detection of enzyme-digested product and construction of the recombinant plasmid

2.2 重組酶的誘導(dǎo)表達及純化

將攜帶有pET28-slr質(zhì)粒的重組大腸桿菌進行誘導(dǎo)表達，利用載體自身含有的His標簽進行純化，SDS-PAGE結(jié)果見圖2。發(fā)酵上清液中不含目的蛋白質(zhì)，粗酶液經(jīng)純化得到了單一條帶的目的產(chǎn)物，其相對分子質(zhì)量大小約為43 000，與預(yù)期蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量相符，而對照菌株沒有相應(yīng)的基因表達。結(jié)果表明，slr1975-co基因在大腸桿菌BL21（DE3）菌株中成功異源表達，純化后的可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度約為1.7 g/L。

2.3 誘導(dǎo)條件對產(chǎn)物表達量的影響

誘導(dǎo)時間對產(chǎn)物表達量的影響考察了誘

導(dǎo)時間對AGE重組蛋白質(zhì)表達的影響。分別取誘導(dǎo) 2、4、6、8 h的培養(yǎng)液，離心收集菌體并破碎，取等量上清液進行SDS-PAGE分析，同時以攜帶pET28a質(zhì)粒的重組大腸桿菌作為對照。由圖3（a）可以看出，誘導(dǎo)時間與產(chǎn)物表達量關(guān)系密切，隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時間的延長，產(chǎn)物表達量也隨之增加。

誘導(dǎo)物濃度對產(chǎn)物表達量的影響進一步考察了不同濃度的IPTG對重組蛋白質(zhì)表達的影響。由圖 3（a）可以看出，IPTG 終濃度在 0～0.8 mmol/L范圍內(nèi)，重組酶表達量隨IPTG濃度的增大而增加；IPTG終濃度為0.8 mmol/L時，重組酶表達量達到最大，而終濃度為1.0 mmol/L時表達量略有下降；未添加誘導(dǎo)物的菌體不表達重組酶。

圖2SDS-PAGE分析AGE重組蛋白質(zhì)的表達Fig.2 SDS-PAGE analysis of the recombinant enzyme AGE expression

圖3 不同誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)劑IPTG濃度對AGE重組蛋白質(zhì)表達的影響Fig.3 Effects of induction time and IPTG concentrations on the AGE expression in E.coli BL21 （DE3）/pET28-slr

2.4 重組酶酶學(xué)性質(zhì)研究

最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性考察了重組AGE的最適反應(yīng)溫度。結(jié)果見圖4（a）。可以看出，在pH 7.0條件下，重組酶的最適反應(yīng)溫度為42℃；在25～42℃范圍內(nèi)重組酶活性隨著反應(yīng)溫度升高而增加，當反應(yīng)溫度超過45℃時，酶活力迅速下降，在55℃相對酶活僅為62.5%。

適量的粗酶液分別在不同溫度不同保溫時間測定酶活力，結(jié)果見圖4（b）。重組酶在低溫（20℃）保溫后反應(yīng)穩(wěn)定性最差，保溫在30℃時穩(wěn)定性最好，保溫時間越長酶活性越低。

最適反應(yīng)pH及pH的穩(wěn)定性考察了pH對重組酶AGE的影響，結(jié)果見圖5（a）。重組酶的最適反應(yīng)pH為6.0，當pH超過6.0時酶活性開始下降，在pH 6.0～8.0范圍內(nèi)重組酶能夠維持85%以上的酶活性，pH為10.0時相對酶活為75%，在pH 5.0條件下相對酶活只有72%。

重組酶AGE在不同pH緩沖體系的穩(wěn)定性見圖5（b）。在pH 6.0條件下重組酶保留活性最高；在pH 4.0～7.0范圍內(nèi)相對酶活性能夠維持在80%以上并隨pH升高而增加；當pH超過7.0時相對酶活迅速下降，pH為9.0時相對酶活僅為17%。由此可知重組酶在酸性條件下能夠保持較高的酶活性，而在堿性條件下比較容易失活。

金屬離子對酶活性的影響在胞外由AGE催化GlcNAc異構(gòu)化生成ManNAc的反應(yīng)中，需要外源添加ATP提供能量，也需要添加Mg2+作為ATP酶的激活劑。首先考察了不同濃度Mg2+對酶活性的影響，以不同濃度的MgCl2加入到底物混合物中，結(jié)果見圖 6（a）。 Mg2+濃度在 0～10 mmol/L 范圍內(nèi)時重組酶活性隨著Mg2+濃度升高而提高；當Mg2+濃度為15 mmol/L時重組酶活性最高，超過15 mmol/L時酶活開始下降。

圖4 不同溫度下反應(yīng)重組酶的相對活性和重組酶溫度穩(wěn)定性的測定Fig.4 Optimal temperature and thermostability of the recombinant enzyme AGE

圖5 不同pH下重組酶的相對活性和重組酶pH穩(wěn)定性的測定Fig.5 Optimal pH of the recombinant enzyme AGE and pH stability of the recombinant enzyme AGE

進一步考察了不同金屬離子對重組酶酶活性的影響，在底物混合物中加入15 mmol/L的金屬離子溶液，結(jié)果見圖 6（b）。 Zn2+、Mn2+對重組酶活性均有抑制作用，其中Zn2+的抑制作用最為明顯；加入Fe2+后重組酶活性略有增加，而Mg2+和Ca2+對重組酶活性的促進作用不是很明顯。

圖6 不同Mg2+濃度對重組酶活性的影響和不同金屬離子對重組酶活性的影響Fig.6 Effects of different Mg2+concentration on the recombinant enzyme activitiy and effects of different metal ion on the recombinant enzyme activities

最適反應(yīng)條件下酶活測定在最適反應(yīng)條件即42℃、pH 6.0下，以 N-乙酰-D-葡萄糖胺（GlcNAc）為底物經(jīng)酶促反應(yīng)測定粗酶液的比酶活為3.36 U/mg，純化酶的比酶活為12.91 U/mg。

2.5 反應(yīng)動力學(xué)的測定

Klermund等[17]研究表明，來自Anabaena variabilis ATCC 29413的AGE的Km/GlcNAc為16.3 mmol/L，Km/ManNAc為16.7 mmol/L。本研究分別以GlcNAc和ManNAc為底物，測定了該酶的反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，AGE對GlcNAc的Km值（39.0）低于對ManNAc（46.5），對 GlcNAc的催化效率 kcat/Km為 1.04×103L/（mol·s）高于對 ManNAc 的催化效率，其 kcat/Km為 0.84×103L/（mol·s）。 相比較而言，盡管該酶是可逆催化的，但本實驗優(yōu)化合成的slr975-co催化方向有利于向N-乙酰甘露糖胺合成方向進行的，這對于構(gòu)建雙酶法催化合成NeuAc的生物催化劑是有益的。

2.6 全細胞催化法合成NeuAc

分別收集誘導(dǎo)表達后的E.coli/pET28-nanA和E.coli/pET28-slr細胞，按照1∶3細胞量混合于催化緩沖液中，加入0.6 mol/L GlcNAc和1.2 mol/L丙酮酸作為底物，檢測反應(yīng)體系中底物和產(chǎn)物，結(jié)果如圖7。由圖7可以看出，重組細胞能夠有效的將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物NeuAc。48 h時產(chǎn)物濃度達最高，為0.26 mol/L，此時的轉(zhuǎn)化率達到43.30%。隨著反應(yīng)繼續(xù)進行，NeuAc濃度開始下降而中間產(chǎn)物ManNAc則相對維持在較高水平。由此可見，重組酶的特性決定了在本反應(yīng)體系中底物濃度和中間產(chǎn)物以及產(chǎn)物濃度達到相對平衡時，剩余了較多的底物和中間產(chǎn)物，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率低于50%。其他研究者在進行全細胞催化合成NeuAc時也出現(xiàn)相似的結(jié)果[10]。因此，通過蛋白質(zhì)工程等手段改進酶的反應(yīng)動力學(xué)特性，優(yōu)化反應(yīng)條件從而提高由GlcNAc向NeuAc合成速率是我們接下來要做的工作。

圖7 全細胞催化法合成NeuAc的過程曲線Fig.7 Time course of NeuAc production and substrate consumption

3 結(jié) 語

根據(jù)集胞藻PCC6803來源的N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶基因（slr1975）序列，經(jīng)密碼子分析和優(yōu)化合成slr1975-co基因序列，測序成功后構(gòu)建重組質(zhì)粒進行誘導(dǎo)表達和蛋白質(zhì)純化，純化產(chǎn)物SDS-PAGE分析結(jié)果顯示為大小約43 000的單一條帶。

重組AGE的最適反應(yīng)溫度為42℃，最適反應(yīng)pH為6.0，在pH為4.0～7.0范圍內(nèi)保溫30 min后能保留85%以上的酶活性，在堿性條件下較容易失活；由于物種間的差異，這與魚腥草7120 AGE溫度為40℃，最適pH為8.0時酶活最高，且堿性條件下活性較好的報道有一定差別[22]。此外，在進行不同金屬離子對酶活性影響的實驗，都采用Mg2+作為ATP的激活劑，但結(jié)果顯示Fe2+對重組酶催化活性也有一定的促進作用。本研究中用考馬斯亮藍染色法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為1.7 g/L，這是由于攜帶重組質(zhì)粒的菌株誘導(dǎo)表達后需要經(jīng)過超聲破碎和過濾才能得到粗產(chǎn)物，在這一過程中重組酶丟失較嚴重；冷凍保存之后的產(chǎn)物再用于酶促反應(yīng)，在凍融過程中重組酶活性進一步損失，固定化酶法生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸可以循環(huán)利用酶[23]。

Neu5Ac是唾液酸（Sialic acid）家族中最重要的成員，其家族99%以上都是由Neu5Ac組成[24-25]。AGE酶可以高效催化N-乙酰-D-葡萄糖胺為底物得到N-乙酰神經(jīng)氨酸。全細胞催化法合成Neu5Ac既減少了酶純化的繁瑣步驟也降低了生產(chǎn)成本，已成為研究熱點。本研究實現(xiàn)了AGE在大腸桿菌中高效表達，為全細胞催化法高效合成N-乙酰-D-神經(jīng)氨酸奠定了堅實的基礎(chǔ)。