萊茵衣藻IFT25的原核表達(dá)、純化及其多克隆抗體的制備

王 震 ， 董 彬 ， 樊振川 ，2，3， 孟德梅 *，2，3

（1.天津科技大學(xué) 教育部食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.天津市食品營(yíng)養(yǎng)與安全和藥物化學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，天津300457；3.天津科技大學(xué) 新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津 300457）

纖毛是存在于細(xì)胞表面具有運(yùn)動(dòng)或感知功能的細(xì)胞器，多項(xiàng)研究報(bào)道，纖毛的結(jié)構(gòu)或功能障礙會(huì)導(dǎo)致許多疾病[1-4]，如多囊腎病、視網(wǎng)膜變性、慢性呼吸疾病、腦積水和不孕等。為了預(yù)防和治療這些疾病，許多研究者對(duì)纖毛內(nèi)各種蛋白質(zhì)組分、結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)理進(jìn)行了大量研究[5-7]。纖毛的運(yùn)動(dòng)和感知是由馬達(dá)蛋白、IFT顆粒、BBS等元件來維持的，其中IFT顆粒是維持纖毛功能所必須的[8]。研究表明，IFT顆粒包含至少20種蛋白質(zhì)組分，這些組分形成一個(gè)復(fù)合物整體，可以運(yùn)送細(xì)胞體內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)出纖毛[9]。IFT顆粒中蛋白質(zhì)組分的構(gòu)象改變或缺失將會(huì)引起纖毛的組裝和功能障礙[4，6]。

IFT顆粒包含IFT-A和IFT-B復(fù)合物，兩者分別包含6種和14種組分，還有一些新成員將不斷被發(fā)現(xiàn)[8，10]。IFT顆粒的各個(gè)組分在各個(gè)物種間幾乎呈高度保守性，但是在秀麗隱桿線蟲和果蠅中卻沒有發(fā)現(xiàn)IFT-B復(fù)合物的組分IFT25，暗示著IFT25可能區(qū)別于其他常規(guī)的IFT-B復(fù)合物組分，在纖毛運(yùn)輸系統(tǒng)中發(fā)揮特殊的作用[10]。在萊茵衣藻中研究發(fā)現(xiàn)，IFT25是一種磷酸化蛋白質(zhì)，可以和IFT27結(jié)合，促進(jìn)IFT27的穩(wěn)定性和可溶性，說明兩者可能有功能上的關(guān)聯(lián)[11]。在小鼠中研究發(fā)現(xiàn)，IFT25缺陷型不出現(xiàn)纖毛結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度的明顯變化，說明IFT25不參與纖毛的組裝，但是發(fā)現(xiàn)其在維持Hedgehog信號(hào)正確傳導(dǎo)中發(fā)揮作用。同時(shí)在小鼠的研究中，IFT25缺陷型細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)有絲分裂缺陷，這可能表明哺乳動(dòng)物中不需要IFT25調(diào)控細(xì)胞周期[12]。目前關(guān)于IFT25的作用機(jī)制尚不清晰，因此深入研究模式生物萊茵衣藻中IFT25在纖毛組裝、纖毛內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸及信號(hào)傳導(dǎo)中的作用機(jī)制具有重要意義。

制備特異性和靈敏性的萊茵衣藻IFT25抗體，是順利完成IFT25在蛋白水平表達(dá)模式、以及IFT25與其他蛋白質(zhì)互作機(jī)制研究的重要前提。作者雖在2009年對(duì)萊茵衣藻IFT25和IFT27的互作進(jìn)行了詳細(xì)研究[11]，但是至今沒有商品化的萊茵衣藻IFT25抗體可供研究者使用，也沒有關(guān)于萊茵衣藻IFT25抗體制備方法的報(bào)道。作者采用經(jīng)濟(jì)和簡(jiǎn)單的方法，以原核表達(dá)萊茵衣藻IFT25為抗原制備兔源多克隆抗體，并運(yùn)用多種方法進(jìn)行抗體純化以提高抗體的特異性，從而為全面闡明IFT25在纖毛中的具體作用機(jī)制及理解纖毛相關(guān)疾病的致病機(jī)理奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒大腸桿菌 XL1-blue，BL21（DE3） 感受態(tài)，pGEX-2T-ift25-lcc-his-ift27 質(zhì)粒：均為作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；萊茵衣藻cc125藻種：作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑DNA Marker（1 000 bp、100 bp）、dNTPs：購(gòu)自全式金公司；T4DNA連接酶、Pfu DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶（BamH I、Hind III）、彩色預(yù)染蛋白Marker、IPTG：購(gòu)自 Fermentas公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒：均購(gòu)自索萊寶公司；引物合成和基因測(cè)序：由北京奧科鼎盛公司完成；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG：購(gòu)自康為世紀(jì)；Dextrin SepharoseTMHigh Performance、Ni SepharoseTM6 Fast Flow、Protein ASepharoseTM：購(gòu)自 GE 公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新西蘭大白兔2只，8周齡大，體重1.5～2.0 kg，由天津歐陽實(shí)驗(yàn)種兔場(chǎng)提供。

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)室保存的pMAL-c2X 和 pET-28a（+）表達(dá)載體用 BamH I、Hind III進(jìn)行雙酶切，并進(jìn)行切膠回收；以表1中設(shè)計(jì)的引物PCR擴(kuò)增出ift25，用BamH I、Hind III進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)物純化回收目的基因；將目的基因分別與兩個(gè)載體用T4DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-blue 中，分別涂到含氨芐青霉素（120 μg/mL）、卡那霉素（30 μg/mL）的LB平板上篩選陽性菌落；挑取陽性菌落過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切和測(cè)序驗(yàn)證。

表1 擴(kuò)增ift25所用引物序列Table 1 Sequences of the PCR primers for the gene of ift25

1.2.2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)驗(yàn)證將正確重組質(zhì)粒用熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，在分別含氨芐青霉素（120 μg/mL）和卡那霉素（30 μg/mL）的LB平板上篩選含pMAL-c2X-ift25和pET-28a（+）-ift25陽性菌落；挑取陽性菌落過夜培養(yǎng)，然后按照5%接種體積分?jǐn)?shù)分別轉(zhuǎn)接到5 mL含氨芐青霉素（120 μg/mL）和卡那霉素（30 μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)至 OD600值到0.6～0.8， 加入終濃度 0.2 mmol/L的 IPTG，25℃、180 r/min誘導(dǎo)表達(dá)6 h，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析[13-14]。

1.2.3 融合蛋白MBP-IFT25的純化將含pMAL-c2X-ift25重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲波破碎菌體細(xì)胞，離心收集上清液。含融合蛋白上清液用Dextrin SepharoseTMHigh Performance進(jìn)行親和純化，純化條件為：結(jié)合緩沖液 A（20 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.1% β-巰基乙醇，pH 7.4）， 洗脫緩沖液 A（20 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.1% β-巰基乙醇，10 mmol/L 麥芽糖，pH 7.4），將洗脫出的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析[15]。

1.2.4 融合蛋白6×His-IFT25的純化含pET-28a（+）-ift25重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)后，菌體細(xì)胞進(jìn)行超聲波破碎，離心收集包涵體。包涵體用洗滌液緩沖液 （50 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，1 mol/L 尿素，1%TritonX-100，pH 8.0）洗滌 3次后，然后用變性緩沖液 （20 mmol/L NaH2PO4，8 mol/L 尿素，500 mmol/L NaCl，pH 7.4） 進(jìn)行變性溶解。融合蛋白在變性條件下用Ni SepharoseTM6 Fast Flow進(jìn)行親和純化，純化條件為：結(jié)合液緩沖液B（20 mmol/L NaH2PO4，8 mol/L 尿 素 ，500 mmol/L NaCl，pH 7.4），分別用含有 60、100、300 mmol/L 咪唑的洗脫液緩沖液B （20 mmol/L NaH2PO4，8 mol/L尿素，500 mmol/L NaCl，pH 7.4） 進(jìn)行梯度洗脫，洗脫出的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析[16-17]。

1.2.5 多克隆抗體的制備取兩只8周大的新西蘭大白兔，在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)一周后準(zhǔn)備免疫。初次免疫前在耳源靜脈取血，分離血清，在后續(xù)試驗(yàn)中作為陰性血清；初次免疫，取2 mg MBP-IFT25與等體積的完全弗氏佐劑充分乳化，在兔子頸背部選多點(diǎn)皮下注射；10～14 d后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，取2 mg MBPIFT25與等體積的不完全弗氏佐劑充分乳化，在兔子頸背部多點(diǎn)皮下注射；之后每次加強(qiáng)免疫前耳源取血，ELISA測(cè)定抗血清的效價(jià)，當(dāng)效價(jià)滿足試驗(yàn)要求，加強(qiáng)免疫后一周取血分離抗血清[18-20]。

1.2.6 ELISA測(cè)定抗血清效價(jià)酶標(biāo)板每孔包被1 μg融合蛋白MBP-IFT25，0.5%的脫脂奶粉封閉，抗血清和陰性血清設(shè)定稀釋梯度為 1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000，二抗為辣根過氧化物酶（HPR）標(biāo)記的山羊抗兔 IgG（1∶20 000），TMB（3′，3′，5′，5′，-四甲基聯(lián)苯胺）顯色后測(cè)定OD450，抗血清OD450/陰性血清OD450≥2.0為陽性，其最高稀釋倍數(shù)為抗血清的效價(jià)[19]。

1.2.7 抗血清的純化分離完的抗血清用Protein A SepharoseTM進(jìn)行純化，純化條件為：結(jié)合緩沖液C（12 mmol/L Na2HPO4，8 mmol/L NaH2PO4，pH 7.0），洗脫緩沖液C（0.1 mol/L甘氨酸，pH 2.7），流速 0.5 mL/min。收集吸收峰對(duì)應(yīng)的洗脫液，用1 mol/L Tris-HCl（pH 9.0）將洗脫液pH值調(diào)至中性。Protein ASepharoseTM純化完的抗體用硝酸纖維素膜親和法[21]進(jìn)一步純化，將6×His-IFT25經(jīng)過SDS-PAGE和電印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（PVDF）上，麗春紅染色后剪下目的條帶，5%脫脂奶粉封閉后與經(jīng)過Protein A SepharoseTM的抗體4℃結(jié)合過夜，用洗脫緩沖液C進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并將pH值調(diào)至中性。

1.2.8 Western blotting檢測(cè)多克隆抗體的特異性萊茵衣藻cc125接種到Tris-Acetate-Phosphate（TAP）[22]培養(yǎng)基中室溫光照培養(yǎng) 3 d，取 1 mL加入離心管中，2 000 r/min離心5 min，棄去上清液；向沉淀中加入54 μL Buffer A （工作濃度0.1 mol/L的Na2CO3）和 6 μL DTT（1 mol/L），渦旋振蕩器振蕩 5 s重懸衣藻細(xì)胞；向離心管中繼續(xù)加入40 μL Buffer B（5%SDS、30%蔗糖），室溫振蕩 45 min；10 000 r/min離心5 min，收集上清液。取4 μL衣藻上清液加入1 μL 5×上樣緩沖液混勻，進(jìn)行SDS-PAGE和電轉(zhuǎn)印后，衣藻蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉；多克隆抗體稀釋度1：1000，二抗為辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔 IgG（1：5000），加入顯色液后曝光壓片顯色或曝光照相[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

兩套重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果見圖1。兩套重組質(zhì)粒均獲得了570 bp的片段，并將重組質(zhì)粒送到金唯智公司測(cè)序，測(cè)序引物選擇通用引物，經(jīng)過對(duì)比序列完全正確，說明表達(dá)載體構(gòu)建成功，將其分別命名為 pMAL-c2X-ift25 和 pET-28a（+）-ift25。

圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證Fig.1 Double enzyme verification of recombinant plasmid

2.2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及融合蛋白的可溶性分析

pMAL-c2X-ift25和 pET-28a （+）-ift25均轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中。含pMAL-c2X-ift25的菌體經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE在60 000處出現(xiàn)目的條帶，而未經(jīng)誘導(dǎo)的含重組質(zhì)粒的菌體蛋白沒有此帶，說明目的MBP-IFT25成功表達(dá)；將誘導(dǎo)完的菌體經(jīng)過超聲破碎，目的條帶主要出現(xiàn)在上清液中，而沉淀中則幾乎沒有，說明融合蛋白呈水可溶性，見圖2。含pET-28a（+）-ift25的菌體經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE在20 000附近出現(xiàn)目的條帶，而未經(jīng)誘導(dǎo)的空白對(duì)照則沒有此帶，說明6×His-IFT25成功表達(dá)，而且主要分布在沉淀中，說明6×His-IFT25主要以包涵體形式表達(dá)。這與之前報(bào)道相同，即MBP對(duì)融合蛋白有促水溶作用[14]；本試驗(yàn)中6×His與IFT25融合表達(dá)時(shí)融合蛋白的水溶性較差。

圖2 SDS-PAGE檢測(cè)重組表達(dá)載體pMAL-c2X-ift25和pET-28a（+）-ift25 在 E.coli BL21（DE3）中的表達(dá)及融合蛋白的可溶性Fig.2 SDS-PAGE analyzed the expression of recombinant vector pMAL-c2X-ift25 and pET-28a（+）-ift25 in E.coli BL21 （DE3） and the solubility of fusion protein

因?yàn)槌仕苄偷哪康牡鞍卓梢员３值鞍踪|(zhì)的天然構(gòu)象，制備的抗體可以更特異性的結(jié)合目的蛋白，包涵體在變性溶解、復(fù)性操作后可以恢復(fù)蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，但是在提高復(fù)性效率上存在諸多難度和挑戰(zhàn)，而且不能達(dá)到完全復(fù)性。因此，作者選擇呈水溶性的MBP-IFT25作為免疫動(dòng)物的抗原；包涵體6×His-IFT25則用于抗體的膜純化[21]。

2.3 融合蛋白的純化

融合蛋白MBP-IFT25和6×His-IFT25經(jīng)過親和純化后，用SDS-PAGE進(jìn)行分析，見圖3。結(jié)果表明兩個(gè)融合蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量正確，且經(jīng)灰度分析（SAGECREATION凝膠成像儀）表明，兩者純度均達(dá)90%以上。

圖3 MBP-IFT25和6×His-IFT25的親和純化Fig.3 Affinity purification of MBP-IFT25 and 6×His-IFT25

2.4 ELISA測(cè)定抗血清效價(jià)及多克隆抗體的特異性檢測(cè)

融合蛋白MBP-IFT25作為抗原免疫兩只新西蘭大白兔，用ELISA測(cè)定免疫過程中的抗血清效價(jià)，結(jié)果在第四次免疫后12 d，兩只兔子的抗血清效價(jià)均超過1 280 000，見圖4，滿足試驗(yàn)要求，于第五次免疫后一周取血分離抗血清。

圖4 間接ELISA法測(cè)定抗血清的效價(jià)Fig.4 Results of ELISA test of anti-IFT25 polyclonal antiserum

取兔子1抗血清首先經(jīng)過Protein A純化，結(jié)果見圖5，再進(jìn)行抗原-抗體膜純化。用Western blotting檢測(cè)其識(shí)別萊茵衣藻中IFT25的特異性，經(jīng)過顯色可以在20 000附近識(shí)別出單一條帶，條帶相對(duì)分子質(zhì)量大小符合預(yù)期，見圖6，即制備的多克隆抗體可以特異性識(shí)別IFT25，可以直接用于后續(xù)對(duì)IFT25的研究。

圖5 Protein A純化IFT25的抗血清Fig.5 Anti-IFT25 was purified by protein A

圖6 Western blotting分析IFT25多克隆抗體的特異性Fig.6 Western blotting analysis of the specificity of IFT25polyclonal antibody

3 結(jié) 語

IFT25作為纖毛內(nèi)運(yùn)動(dòng)蛋白IFT復(fù)合物B中的一個(gè)重要組分，在纖毛運(yùn)動(dòng)和感知中的作用機(jī)制仍不清晰。制備特異性和靈敏性的IFT25抗體，來檢測(cè)其在模式生物萊茵衣藻中的表達(dá)模式及與其他IFT成員的互作機(jī)制是闡明IFT25在生物體內(nèi)作用機(jī)制的重要方式。作者成功構(gòu)建了MBP-IFT25和6×His-IFT25兩種融合蛋白，親和純化后蛋白質(zhì)純度超過90%。并用水溶性的MBP-IFT25融合蛋白作為抗原制備其多克隆抗體，ELISA測(cè)定效價(jià)超過128 000。依次經(jīng)Protein A和硝酸纖維素膜純化制備的抗體，用Western blotting檢測(cè)具有很好的特異性，能夠正確的特異性識(shí)別萊茵衣藻中的IFT25蛋白質(zhì)，表明所制備的IFT25抗體可以直接用于ELISA、Western blotting及活體中的檢測(cè)，為IFT25作用機(jī)制的闡明和纖毛相關(guān)疾病的診斷提供了重要理論和方法支持。