高效液相色譜法測定刺五加甘草顆粒中紫丁香苷的含量

姚路路，張 聰，潘貴珍，周德剛，田曉龍，張曉會

(1. 洛陽惠中獸藥有限公司，洛陽 471000；2. 普萊柯生物工程股份有限公司，洛陽 471000)

刺五加為五加科植物刺五加Acanthopanaxsenticosus(Rupr. et Maxim.) Harms的干燥根和根莖或莖，具有抗炎、提高機體免疫力、抗病毒、抗過敏等功效，刺五加多糖對雞免疫功能具有顯著的增強作用，其中紫丁香苷是刺五加的重要活性成分[1-2]。甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)為豆科植物甘草屬的干燥根和根莖，甘草中的甘草酸具有抗炎、抗過敏、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒等多種生物活性[3-4]，總黃酮有抗慢性不可預(yù)知應(yīng)激抑郁作用[5]，多糖具有調(diào)節(jié)機體免疫等作用[6]。

刺五加甘草顆粒是由刺五加和甘草兩味藥材組成，采用水提醇沉法，上清液減壓濃縮后，加入適量的輔料，制粒即得，可提高畜禽免疫力，用于雞傳染性支氣管炎的治療。

紫丁香苷作為刺五加的重要活性控制指標，文獻中報道的刺五加中紫丁香苷含量測定主要為刺五加藥材或刺五加單方制劑中紫丁香苷的含量測定[7-13]，對刺五加甘草顆粒中紫丁香苷的含量測定方法進行了相關(guān)研究，建立了刺五加甘草顆粒中紫丁香含量的高效液相色譜測定方法，可為刺五加甘草顆粒質(zhì)量標準的建立提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 Waters e2695高效液相色譜儀，配2489型紫外檢測器，美國Waters公司；KQ-500超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司，AB135-S型電子分析天平，瑞士梅特勒托利多公司；乙腈，HPLC級，MERK公司；水為超純水。

1.2 試藥 紫丁香苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111574-200603，含量：100%)、刺五加甘草顆粒(洛陽惠中獸藥有限公司，批號：20170801，20170802，20170803，規(guī)格：每100 g相當(dāng)于原生藥160 g)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18(250 × 4.6 mm，5 μm)；梯度洗脫，流動相：乙腈-水(0 - 7 min，乙腈11%；7 - 8 min，乙腈由11%上升到40%；8 - 13 min，乙腈40%；13 - 14 min，乙腈由40%下降到11%；14 - 20 min，乙腈11%)，流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：265 nm；進樣量：10 μL。理論板數(shù)按紫丁香苷峰計算應(yīng)不低于5000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液的制備 取紫丁香苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制溶解制成每1 mL含1 mg的溶液，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密吸取對照品貯備液1 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品，研細，稱取粉末約1.5 g，精密稱定，置小燒杯中，用50%甲醇20 mL，分次溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，超聲處理(功率250 W，頻率50k Hz)30 min，取出，放冷，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 按處方制備缺刺五加的陰性對照樣品，按“2.2.3”項下方法制成陰性對照溶液，

2.3 專屬性試驗 分別取上述對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖(圖1)。從圖中可見，供試品溶液在與對照品色譜中紫丁香苷相應(yīng)的位置上，有相同保留時間的色譜峰，陰性對照在紫丁香苷相應(yīng)保留時間處無干擾峰。

2.4 線性試驗 取“2.2.1”項下對照品貯備液，分別精密量取對照品貯備液適量，加甲醇稀釋，制得濃度為0.01218，0.02030，0.04060，0.06090，0.08120 mg/mL的一系列溶液，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以進樣濃度(C，mg/mL)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：A=3×107C-13800，r=0.9999。表明紫丁香苷進樣量在0.01218～0.08120 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗 取對照品溶液(0.04060 mg/mL)，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6針，記錄峰面積，結(jié)果RSD為0.1%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗 取刺五加甘草顆粒(批號：20170801)，按照“2.2.3”項制備供試品溶液，分別制備6份，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，結(jié)果RSD為0.9%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗 取刺五加甘草顆粒(批號：20170801)，按照“2.2.3”項制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h測定峰面積，結(jié)果RSD為0.6%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1. 紫丁香苷對照品 2. 供試品 3. 陰性對照1. Reference Substance of Syringin 2. Test sample 3. negative control圖1 專屬性考察色譜圖Fig 1 The chromatogram of Specific inspection

2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的刺五加甘草顆粒樣品6份(批號：20170801，紫丁香苷含量：0.738mg/g)，每份約0.8 g，精密稱定，置小燒杯中，各精密加入0.1015 mg/mL的紫丁香苷對照品溶液5 mL，按照“2.2.3”項制備供試品溶液，按含量測定方法操作，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定樣品含量并計算回收率，結(jié)果見表1，加樣回收率在96.46%～99.53%之間，平均值為98.4%，RSD為1.2%，表明方法準確度良好。

2.9 耐用性試驗 取刺五加甘草顆粒(批號：20170801)，按照“2.2.3”項制備供試品溶液，當(dāng)柱溫、流速發(fā)生微小變化以及使用不同型號的色譜柱，分別測定樣品的峰面積，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，當(dāng)柱溫、流速發(fā)生微小變化以及使用其他型號的色譜柱時，對含量測定結(jié)果基本無影響，表明方法耐用性良好。

表1 回收率試驗結(jié)果Tab 1 The results of recovery test

表2 耐用性試驗結(jié)果Tab 2 The results of durability test

2.10 三批樣品含量測定 取刺五加甘草顆粒樣品(20170801，20170802，20170803)，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算刺五加甘草顆粒中紫丁香苷的含量，三批樣品測定結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果Tab 2 The results of sample content determination

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測波長的選擇 通過紫外掃描，紫丁香苷在265 nm處有最大吸收，因此選擇265 nm為檢測波長。

3.2 提取溶劑及提取時間的選擇 參考《中國獸藥典》二部中刺五加藥材及刺五加浸膏含量測定項下供試品的處理方法，比較了甲醇、75%甲醇、50%甲醇作為提取溶劑對紫丁香苷含量的影響，結(jié)果50%甲醇對紫丁香苷的提取效果最好，因此選擇50%甲醇作為提取溶劑；同時考察了超聲10、20、30 min對紫丁香苷含量的影響，結(jié)果超聲30 min紫丁香苷的提取效果最好，因此選擇超聲30 min。

3.3 色譜條件的考察 本試驗考察了甲醇-水(20∶80)、乙腈-水(11∶89)、乙腈-0.1%磷酸溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-水(20∶80)、乙腈-0.1%磷酸溶液條件下，陰性對照品在紫丁香苷對照品相應(yīng)的保留時間處有干擾，乙腈-水(11∶89)條件下陰性對照品在紫丁香苷對照品相應(yīng)的保留時間處無干擾，重復(fù)進樣發(fā)現(xiàn)陰性對照品在紫丁香苷對照品相應(yīng)保留時間處會有干擾，研究發(fā)現(xiàn)陰性對照品中干擾峰保留時間過長，在第二針色譜圖中出峰，因此為確保陰性對照品中色譜峰能被完全洗脫，將流動相改為梯度洗脫，紫丁香苷的保留時間為8 min左右，與相鄰峰分離度好，峰型良好。

采用高效液相色譜法測定刺五加甘草顆粒中紫丁香苷的含量，方法簡便、準確度高、專屬性強、重現(xiàn)性好。