慶大霉素在羊體內(nèi)代謝和殘留消除規(guī)律研究

胡 劍，孫豐梅，張聰聰，李艷華，陳 剛*

(1.唐山市豐南區(qū)農(nóng)牧局，河北唐山 063300；2.河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，河北張家口 075000；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081)

慶大霉素是由小單孢子屬產(chǎn)生的多組分氨基糖苷類抗生素[1]，主要由慶大霉素C1、C1a、C2和C2a組成，分子量475.9(C1，477.6;C2，463.6;C1a，449.5)[2-3]?？膳c硫酸結(jié)合成在臨床上普遍使用的硫酸慶大霉素[4]，其作用機(jī)制是與細(xì)菌核糖體30S 亞基結(jié)合，抑制細(xì)菌蛋白的合成，并間接導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜、細(xì)胞壁的缺損，對靜止期細(xì)菌殺滅作用較強(qiáng)，且對許多致病菌有抗生素后效應(yīng)[5-7]。對多種革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、變形桿菌、沙門氏菌等)和金黃色葡萄球菌均有抗菌作用[8]。肌肉注射后吸收迅速而完全。在0.5～1 h達(dá)血藥峰濃度。皮下或肌內(nèi)注射的生物利用度超過90%[9]。主要用于治療動物敏感的革蘭氏陰性和陽性菌感染，如敗血癥、泌尿生殖道感染、呼吸道感染、胃腸道感染、腹膜炎、乳腺炎及皮膚和軟組織感染以及傳染性鼻炎等[10-12]。我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定慶大霉素在牛、豬肌肉、脂肪、肝臟和腎臟的殘留限量分為100、100、2000、5000 μg/kg，牛奶、雞肉中的殘留限量200、100 μg/kg[13]，但尚未制定其在羊組織中的最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。目前世界各國及國內(nèi)尚未有開展羊組織中慶大霉素代謝和殘留消除規(guī)律研究的報道。本文針對慶大霉素在羊體內(nèi)的代謝分布及殘留消除規(guī)律進(jìn)行了研究，確定慶大霉素在羊體內(nèi)的殘留靶組織和殘留標(biāo)示物，以期為安全使用獸藥，正確制訂最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)和建議。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 水：符合GB/T 6682規(guī)定，一級水；慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥94%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司)；4%硫酸慶大霉素注射液，批號：B75140316，河北遠(yuǎn)征藥業(yè)；甲醇、乙腈和甲酸(HPLC級，美國Dikma公司)；28%氨水(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)；三氯乙酸(純度≥99%，北京百靈威科技有限公司)；乙二胺四乙酸二鈉(瑞士Sigma Aldrich公司)；磷酸二氫鉀(純度≥94%，北京百靈威科技有限公司)；乙酸銨(色譜純，北京試劑公司)；陽離子交換固相萃取柱PCX(美國Agilent公司，60 mg，3 mL)；HPH C8色譜柱(3.0×100 mm，2.7 μm，美國Agilent公司)。

1.2 儀器與設(shè)備 超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(Agilent 6470 ΜPLC-QQQ-MS/MS，美國Agilent公司)；天平(德國梅特勒-托利多公司)；漩渦混合儀(MS-3，德國IKA公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國Thermo公司)；固相萃取裝置；氮吹儀(TTL-DCⅡ，北京同泰聯(lián)公司)；真空泵(美國Agilent公司)；Millipore純化水系統(tǒng)(Milli-Q公司)。

1.3 主要溶液的配制 氨化甲醇溶液：量取濃氨水15 mL，用甲醇溶解并稀釋至100 mL；2%三氯乙酸提取液：稱取磷酸二氫鉀1.36 g，用980 mL水溶解，分別加入乙二胺四乙酸二鈉0.15 g和三氯乙酸20 g，溶解混勻并定容至1000 mL；2 mol/L乙酸銨溶液：稱取15.416 g乙酸銨，用水溶解并定容至100 mL；慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：取慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg，精密稱定，用水溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，置4 ℃避光靜止保存；慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備液一定量，用0.3%醋酸水稀釋定容成10、50、100、200、500、1000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，置4 ℃冰箱中避光保存。

1.4 試驗設(shè)計

1.4.1 慶大霉素在羊體內(nèi)代謝研究

1.4.1.1 試驗動物 動物：健康湖羊5只，平均6月齡，體重20～30 kg，購自北京某羊場?？瞻讓φ战M1只，試驗組4只(對照組為♀，試驗組Ⅰ、Ⅳ為♀，Ⅱ、Ⅲ為♂)。代謝籠飼養(yǎng)，自由采食飲水，適應(yīng)1周，飼喂不添加任何抗菌藥物的飼料，試驗前后飼養(yǎng)條件相同。

1.4.1.2 給藥方案 給藥途徑：羊頸部肌內(nèi)注射(在同一側(cè)注射)，每日給藥2次，連續(xù)給藥2.5 d；用法與用量：4 mg/kg×體重；第1天：上午9:00；下午3:00；第2天：上午9:00；下午3:00；第3天：上午9:00；第4天上午9:00屠宰。

1.4.1.3 樣品采集和保存 采樣時嚴(yán)格遵守動物及動物產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控抽樣規(guī)范[14]，每頭羊取肌肉300～500 g (腿肌)，皮膚+脂肪200～300 g，雙腎各取1/2(縱切)，肝臟取整葉全肝。用絞肉機(jī)充分?jǐn)囁榛靹?；血漿：每日給藥前及給藥后1、3、6、24 h 頸靜脈采血，采集的血液經(jīng)4000 r/min離心10 min，吸取上清于EP離心管中；尿、糞便：收集給藥后0～6 h，6～12 h，12～24 h全部的尿液和糞便，尿液不離心，直接保存，糞便保存前研磨并混合均勻，包裝后-20 ℃保存。

1.4.2 慶大霉素在羊組織中消除規(guī)律研究

1.4.2.1 試驗動物 動物：健康湖羊22只(♂11只，♀11只)，平均6月齡，體重20～30 kg，購自北京某羊場。空白對照組1只，試驗組分7組，每組3只。代謝籠飼養(yǎng)，自由采食飲水，適應(yīng)一周，飼喂不添加任何抗菌藥物的飼料，試驗前后各組飼養(yǎng)條件相同。

1.4.2.2 給藥方案 給藥途徑：羊頸部肌內(nèi)注射(在同一側(cè)注射)，每日給藥2次，連續(xù)給藥3 d；用法與用量：4 mg/kg×體重；第1天：上午9:00；下午3:00；第2天：上午9:00；下午3:00；第3天：上午9:00；下午3:00。

1.4.2.3 樣品采集和保存 最后一次給藥后1、3、5、7、10、20、30 d分別隨機(jī)宰殺3頭，采樣時嚴(yán)格遵守動物及動物產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控抽樣規(guī)范，每頭羊取肌肉300～500 g (腿肌)，皮膚+脂肪200～300 g，雙腎各取1/2(縱切)，肝臟取整葉全肝。用絞肉機(jī)充分?jǐn)囁榛靹?，包裝后-20 °C保存。

1.5 試驗方法 采用實驗室自建的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)對樣品進(jìn)行測定。

1.5.1 樣品前處理 稱取樣品2±0.02 g于50 mL離心管中，加10 mL磷酸鹽緩沖液，渦漩混勻1 min，超聲5 min，以10000 r/min離心10 min。取上清液于另一50 mL離心管中。殘渣再加磷酸鹽緩沖液4 mL，重復(fù)提取一次，合并兩次提取液并定容至15 mL，渦旋混勻，為備用液，供SPE凈化。

PCX陽離子交換柱依次用甲醇5 mL和水5 mL活化，取7.5 mL的備用液上柱，流干后，依次用水5 m和甲醇5 mL淋洗，抽干，用氨化甲醇5 mL洗脫，收集洗脫液于10 mL塑料離心管中，于40 ℃下用氮?dú)獯蹈桑?.3%醋酸水溶液溶解并定容至2 mL，充分渦旋，0.22 μm濾膜過濾，濾液供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.5.2 色譜、質(zhì)譜條件 色譜儀：seAgilent 1290 lnfinitiyⅡ；色譜柱：Agilent Poroshell HPH-C8(3.0×100 mm，2.7 μm)；柱溫35 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；流動相A：水相(50 mmoL乙酸銨、2%氨水、0.2%甲酸)；流動相B：乙腈。

質(zhì)譜儀：Agilent 6470三重四級桿MS/MS；離子源：ESI+；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)檢測；干燥氣溫度：250 ℃；干燥氣流速：7 L/min；霧化器：40 psi；鞘氣流速：12 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；毛細(xì)管電壓：3500 V；噴嘴電壓：0 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 慶大霉素在羊體內(nèi)代謝研究 因慶大霉素在不同的羊組織、排泄物、血液中濃度范圍相差很大，因此，在定量過程中，對不同基質(zhì)采取了合適的濃度范圍進(jìn)行定量，各基質(zhì)在不同濃度范圍內(nèi)線性良好，定量方法可行，添加標(biāo)準(zhǔn)品的樣品隨樣品上樣做添加回收實驗，計算方法回收率，結(jié)果見表1，標(biāo)準(zhǔn)溶液和添加標(biāo)準(zhǔn)品樣品色譜圖見圖1和圖2。

表1 羊組織、排泄物、血液中慶大霉素的線性方程和回收率Tab 1 Linear equations and recoveries of gentamicin in sheep tissues, excreta, and blood

圖1 25 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖Fig 1 Chromatogram of 25 ng/mL standard solution

圖2 羊腎臟添加50 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig 2 Chromatogram of sheep kidney with a spiked concentration of 50 ng/mL

用藥期間、停藥期間慶大霉素在羊血液中的殘留代謝規(guī)律見表2。每日給藥前及給藥后1、3、6、24 h頸靜脈采血，研究發(fā)現(xiàn)肌肉注射慶大霉素后在血液中1 h左右達(dá)血藥峰濃度，最高血藥濃度可達(dá)133.23 mg/L，給藥后1～6 h血藥濃度迅速下降，再次給藥，重復(fù)相同血藥濃度變化規(guī)律；最后一次給藥后，血藥濃度不斷下降，24 h后檢測的血藥濃度僅為給藥后1 h的10%左右，表明慶大霉素通過肌肉注射進(jìn)入羊體，首先進(jìn)入到血液中，隨后濃度降低，可能隨血液流動循環(huán)分布到各器官組織中。

同一劑量多次給藥，用藥和停藥期間分別收集四只羊給藥后0～6、6～12、12～24 h的糞便和尿液。由表3分析得出，慶大霉素在糞便中排泄量較低，沒有明顯的代謝規(guī)律，含量最高時僅有168.6 μg；在尿液中，代謝規(guī)律明顯，0～6 h濃度最高，隨之減少，連續(xù)注射藥物呈現(xiàn)相同代謝變化規(guī)律。慶大霉素在尿液中的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于糞便，證明慶大霉素主要通過尿液排出體外。

表2 羊血液中慶大霉素的殘留濃度變化(μg/L)Tab 2 The variation in concentration of residue gentamicin in sheep blood

每日9:00、15:00給藥2次，連用2.5 d。ND：未檢出(Not Detected)

administrated at 9:00 am, 15:00 pm, respectively, for 2.5 days

每日9:00、15:00給藥2次，連用2.5 d。ND: 未檢出(Not Detected)

administrated at 9:00 am, 15:00 pm, respectively, for 2.5 days

表4 羊組織中慶大霉素的殘留濃度(μg/kg)Tab 4 Residual concentration of gentamicin in sheep tissues (μg/kg)

通過表4研究發(fā)現(xiàn)，同一劑量多次給藥，停藥24 h后，同一時間點宰殺處理的肝臟、腎臟、肌肉、脂肪，經(jīng)前處理后通過UPLC-MS/MS檢測，結(jié)果顯示慶大霉素在羊腎臟中殘留濃度最高，其次是肝臟，肌肉和脂肪含量很少。

為證明慶大霉素在羊體內(nèi)不代謝、以原型藥的形式隨尿液排出，在動物試驗中，肝臟、腎臟兩種主要藥物代謝組織取樣后稱重(表5)，所有尿液、糞便(表3)收集完全并記錄，以此計算慶大霉素原型藥總量占注射總量的比例。

表5 肝臟、腎臟中慶大霉素的原型殘留量(mg)Tab 5 The prototype residue of Gentamicin (mg) in liver and kidney

表6 腎臟、肝臟、尿液中原型藥量占注射量的比例(%)Tab 6 The proportion of kidney, liver, urine prototype drugs accounted injection volume

數(shù)據(jù)表明慶大霉素在羊肌肉、脂肪、糞便和血液中原型藥量較少，通過方法回收率換算后的量遠(yuǎn)低于0.5 mg，可忽略不計。由表6得出，肝臟、腎臟、尿液的原型藥量同樣經(jīng)過換算后，藥量總和分別占注射量的87.7%、89.4%、90.0%、94.3%，一般情況下，經(jīng)過注射、口服等方式進(jìn)入動物體內(nèi)的藥物，最終原型藥量占總注射量的90%以上時，即可認(rèn)為該藥物在動物體內(nèi)不被代謝轉(zhuǎn)化，以原型藥形式排出體外。

2.2 慶大霉素在羊體內(nèi)消除規(guī)律研究 慶大霉素在羊組織中的殘留量隨給藥后的時間變化以近似負(fù)指數(shù)函數(shù)遞減的規(guī)律變化，是按照一級動力學(xué)的過程在體內(nèi)消除，即將組織中測得的藥物濃度作對數(shù)轉(zhuǎn)換后，與時間作回歸分析，得到組織中藥物濃度與時間消除曲線方程y=ax+b(y=LnC，b=LnC0)，慶大霉素在羊組織中殘留濃度見表7，殘留消除曲線見圖3。

表7 慶大霉素注射給藥后在羊組織的殘留濃度(μg/kg)Tab 7 Gentamicin residue concentrations (μg/kg) in sheep tissues after intramuscular administration

ND: 未檢出(Not Detected)

圖3 羊組織中慶大霉素的殘留消除曲線Fig 3 The residual elimination curve of gentamicin in sheep tissues

研究表明，按8 mg/kg×體重連續(xù)給藥3 d，給藥后1 d時各組織藥物濃度均較高，尤以肝臟、腎臟為主，這兩個組織可能是慶大霉素在羊體內(nèi)的重要藥理和毒理作用部位。

通過計算得出各組織中慶大霉素的殘留消除參數(shù)(表8)。慶大霉素在脂肪中的消除半衰期最短，肌肉中半衰期最長，第1、3天時，肌肉中的慶大霉素比脂肪中殘留量少，但慶大霉素在肌肉中消除緩慢，30 d還可檢測出少量，在脂肪中消除迅速，30 d已基本代謝完。

肝臟、腎臟中的慶大霉素殘留濃度較高：第20 天時，肝臟中的平均濃度為780.33 μg/kg，腎臟為6181.89 μg/kg；第30天時，肝臟中的平均濃度為658.14 μg/kg，腎臟為3613.47 μg/kg，和EMA報道的慶大霉素在牛、豬體內(nèi)殘留消除規(guī)律相近。肝臟和腎臟的消除半衰期也不同，在確定慶大霉素在羊體內(nèi)的殘留靶組織時要具體分析。

3 討 論

3.1 慶大霉素在羊體內(nèi)分布和代謝特征 采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測了慶大霉素在羊的主要組織、尿液、糞便和血液中的分布和代謝情況。按中國獸藥典(2015版)推薦的最大用量[15]肌肉注射，慶大霉素在羊體內(nèi)1 h可到血藥峰濃度；尿液排泄量最高，通過多次收集給藥后0、3、6 h的尿液，檢測發(fā)現(xiàn)尿液排泄總量占注射總量的80%以上，在糞便中不足0.1%；停藥24 h后，慶大霉素在腎臟中殘留濃度最高，其次是肝臟，肌肉和脂肪含量很少，這和歐洲藥品管理局EMEA對慶大霉素在牛體內(nèi)代謝和分布的報道[16]一致，可能因為牛和羊同為反芻動物，二者代謝途徑相似。參考慶大霉素在其他動物體內(nèi)不代謝的報道[16-18]，將羊肝臟、腎臟、尿液全部稱重、收集，保存檢測，通過方法回收率換算，得出慶大霉素在羊肝臟、腎臟、尿液中原型藥總量占注射總量90%以上，故得出結(jié)論：慶大霉素在羊體內(nèi)的代謝途徑主要是經(jīng)血液運(yùn)輸?shù)侥I臟并經(jīng)腎小球吸收形成原尿，隨尿液排出體外，在羊體內(nèi)不代謝。與國內(nèi)外慶大霉素在人、豬、牛體內(nèi)的代謝報道一致。

表8 羊組織中慶大霉素的殘留消除參數(shù)Tab 8 Residual elimination parameters of gentamicin in sheep tissues

3.2 慶大霉素在羊體內(nèi)殘留標(biāo)示物的確定 殘留標(biāo)示物對獸藥在動物體的代謝、消除、殘留的監(jiān)控和獸藥食品安全具有重要的意義[19]。美國藥品管理局(FDA)規(guī)定殘留標(biāo)示物是指在靶組織中與總殘留的消除規(guī)律具有一定的相關(guān)性，且其較容易合成和提取檢測的化合物，它可能是受試藥物、可能是受試藥物的一種代謝物或代謝物的結(jié)合物[20]。國際食品法典委員會(CAC)對慶大霉素豬、牛體內(nèi)的殘留標(biāo)示物研究報道[21]，慶大霉素的殘留標(biāo)示物為母體藥物(parent drug)，也就是其原型藥。通過分析表明本試驗結(jié)果和CAC報道一致，因此，研究確定慶大霉素原型藥作為慶大霉素在羊體內(nèi)的殘留標(biāo)示物。

3.3 慶大霉素在羊體內(nèi)殘留消除規(guī)律 對羊肌肉、肝臟、腎臟和脂肪中慶大霉素的殘留消除特征及消除規(guī)律進(jìn)行了研究。以8 mg/kg×體重的劑量連續(xù)給藥3 d后，按獸藥殘留取樣規(guī)范要求，選取7個時間點宰殺動物，測定四種組織中慶大霉素的殘留量。結(jié)果表明，四種組織中慶大霉素均有殘留且殘留濃度、消除速率不同，慶大霉素在脂肪中消除半衰期最短，肌肉中最長；給藥1 d后，腎臟殘留濃度最大，30 d后，四種組織中慶大霉素的殘留濃度已降至我國現(xiàn)行慶大霉素在其他動物(豬、牛)組織中最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)以下[13]。

3.4 慶大霉素在羊體內(nèi)殘留靶組織的確定 肝臟一般是動物體主要的藥物代謝器官，對來自體內(nèi)和體外的許多非營養(yǎng)性物質(zhì)如各種藥物、毒物以及體內(nèi)某些代謝產(chǎn)物具有“解毒”、生物轉(zhuǎn)化功能，來自血液或者其他組織的慶大霉素可能都需要經(jīng)過肝臟的解毒功能；腎臟是形成尿液的器官，慶大霉素因通過腎臟排泄而蓄積，殘留濃度最高。尿液的形成和排出相比較肝臟的解排毒等功能生物周期短，因此，腎臟的消除半衰期比肝臟短。優(yōu)先考慮靶組織的殘留濃度，結(jié)合慶大霉素具有腎毒性的毒性機(jī)理[22]，本研究確定腎臟作為慶大霉素在羊體內(nèi)的殘留靶組織。

4 結(jié) 論

通過對慶大霉素在羊體內(nèi)代謝和殘留消除規(guī)律研究，表明慶大霉素在羊體內(nèi)不代謝，在腎臟中形成原尿隨尿液排出體外，腎臟可作為慶大霉素在羊體內(nèi)的殘留靶組織，慶大霉素原型藥可作為殘留標(biāo)示物。研究結(jié)果可為評價獸藥及其殘留物的安全性，制定最高殘留限量值，促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)、食品加工業(yè)和貿(mào)易行業(yè)健康發(fā)展提供理論和技術(shù)支撐。