蜘蛛香膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

楊海峰，金禮琴，陳曉蘭，李鋒濤，李艷艷，吳 悅，李勇軍*

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300；2. 江蘇中牧倍康藥業(yè)有限公司，泰州 225300)

蜘蛛香為敗醬科植物蜘蛛香ValerianajatamansiJones的干燥根莖和根，其性味微苦、辛、溫，歸肺、脾、胃經(jīng)，有理氣止痛、消食止瀉、祛風(fēng)除濕之功效，主治肚腹脹痛、食積不化、腹瀉痢疾、風(fēng)濕痹痛[1-3]。蜘蛛香主要含有揮發(fā)油、黃酮類、環(huán)烯醚萜類和多糖等化學(xué)成分[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蜘蛛香提取物不僅具有鎮(zhèn)靜、催眠、鎮(zhèn)痛、雙向調(diào)節(jié)腸道蠕動(dòng)等作用[5-7]，對(duì)細(xì)菌、病毒引起的腸炎也有較好的療效[8-9]。蜘蛛香膠囊為蜘蛛香藥材細(xì)粉制成的單方硬膠囊，于2017年1月獲得國(guó)家三類新獸藥證書，是目前國(guó)內(nèi)獲批的中藥類寵物藥品，主要用于防治犬細(xì)小病毒性腸炎。試驗(yàn)從性狀、鑒別、檢查、含量測(cè)定等方面開展了蜘蛛香膠囊的質(zhì)量研究，建立了質(zhì)量控制方法，為其臨床應(yīng)用的有效性和安全性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC20A型高效液相色譜儀，配備SPD-20A紫外檢測(cè)器、LC-20AT雙泵、HT-220A柱溫箱，日本島津公司產(chǎn)品；UV-2250型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司產(chǎn)品；AS1201型自動(dòng)進(jìn)樣器，大連依利特公司產(chǎn)品；BT25S型電子天平，北京賽多利斯公司產(chǎn)品。

1.2 試藥 蜘蛛香膠囊，規(guī)格0.25g/粒，批號(hào)分別為150826、150828、150830、150906、150908、150910，江蘇中牧倍康藥業(yè)有限公司提供；橙皮苷對(duì)照品，批號(hào)110721-201316，購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，水為自制純化水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀 蜘蛛香膠囊為蜘蛛香藥材細(xì)粉制成的硬膠囊，內(nèi)容物為灰棕色或棕色的顆粒和粉末；氣特異，味微苦、辛。

2.2 鑒別

2.2.1 顯微鑒別 取蜘蛛香膠囊內(nèi)容物，置顯微鏡下觀察。顯微鑒別特征明顯，可見淀粉粒甚多，單粒類圓形、長(zhǎng)圓形或卵形，有的一端尖突，直徑5～39 μm，臍點(diǎn)裂縫狀、三叉狀或點(diǎn)狀，有的可見層紋；復(fù)粒由2～4粒組成。導(dǎo)管主為網(wǎng)狀導(dǎo)管和單紋孔導(dǎo)管。薄壁細(xì)胞內(nèi)含有淡棕褐色物和橙皮苷結(jié)晶。

2.2.2 薄層色譜鑒別 取蜘蛛香膠囊內(nèi)容物0.2 g，加乙醚5 mL，振搖，放置5 min，濾過，濾液揮去乙醚，殘?jiān)蛹状?.5 mL使溶解，作為供試品溶液。另取蜘蛛香對(duì)照藥材0.2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取供試品溶液5 μL、對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚-丙酮(5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。薄層色譜圖見圖1，可見斑點(diǎn)清晰，供試品、對(duì)照藥材及對(duì)照品在相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，說明TLC法能鑒別出橙皮苷。

(1.橙皮苷對(duì)照品；2.蜘蛛香對(duì)照藥材；3.蜘蛛香膠囊供試品)(1. reference substance of hesperidin；2. reference drug of Valeriana jatamansi Jones reference；3. ested sample of Valeriana jatamansi Jones capsule)圖1 橙皮苷的薄層色譜圖Fig 1 The TLC chromatogram of hesperidin

2.3 檢查

2.3.1 水分 采用烘干法測(cè)定蜘蛛香膠囊的水分，準(zhǔn)確稱取3批次蜘蛛香膠囊內(nèi)容物2 g，平鋪于已干燥恒重的稱量瓶中，精密稱定，置105 ℃干燥至恒重。根據(jù)減失的重量，測(cè)得3批次蜘蛛香膠囊的水分含量分別為6.8%、7.1%、6.5%，均低于9%，符合規(guī)定。

2.3.2 裝量差異 取蜘蛛香膠囊10粒，分別精密稱定重量，傾出內(nèi)容物，囊殼用小刷拭凈，再分別精密稱定囊殼重量，計(jì)算每粒內(nèi)容物的裝量與平均裝量。3批次蜘蛛香膠囊的平均裝量(n=10)分別為0.2503 g(RSD=2.7%)、0.2530 g(RSD=3.5%)、0.2515 g(RSD=2.4%)，裝量差異在標(biāo)示裝量的±10%以內(nèi)，符合規(guī)定。

2.3.3 崩解時(shí)限 取蜘蛛香膠囊6粒，采用升降式崩解儀測(cè)定其崩解時(shí)限。3批次蜘蛛香膠囊的崩解時(shí)間分別為15、16、15 min，均在30 min之內(nèi)崩解，符合規(guī)定。

2.3.4 微生物限度 按照非無菌產(chǎn)品，采用微生物計(jì)數(shù)法和控制菌檢查法進(jìn)行微生物限度檢查。供試液制備方法如下：取蜘蛛香膠囊內(nèi)容物10 g置入滅菌研缽中，加pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液至20 mL，置45 ℃水浴中，振蕩，使溶解，充分研磨，并在研磨過程中逐漸增加稀釋液，直至供試品完全呈細(xì)勻狀態(tài)為止，稀釋液加入至總量為100 mL，作為1∶10的供試液。測(cè)定3批次蜘蛛香膠囊的細(xì)菌總數(shù)分別為74 cfu/g、67 cfu/g、61 cfu/g，霉菌和酵母菌總數(shù)分別為23 cfu/g、28 cfu/g、25 cfu/g，未檢出大腸埃希菌，微生物限度檢查結(jié)果符合規(guī)定。

2.4 含量測(cè)定

2.4.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為40 μg/mL的溶液，即得。

2.4.2 供試品溶液制備 取蜘蛛香膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，分別取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 色譜條件 色譜柱：CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)；檢測(cè)波長(zhǎng)：284 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 繆L。在上述色譜條件下，橙皮苷與供試品溶液中的其他組分分離度良好，其保留時(shí)間在14.6 min左右，見圖2。

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密稱取橙皮苷對(duì)照品20 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液0.5、1、2、5、10、20 mL，分別置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成8、16、32、80、160、320 g/mL系列濃度的對(duì)照品溶液。精密吸取上述不同濃度的對(duì)照品溶液20 μL，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以峰面積(Y)對(duì)橙皮苷質(zhì)量(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=1906206.20X+102959.48(r=0.9999)，橙皮苷進(jìn)樣量在0.16～6.4 μg范圍內(nèi)與峰面積成良好的線性關(guān)系。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取20 μL同一橙皮苷對(duì)照品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果橙皮苷對(duì)照品溶液峰面積的RSD為0.43%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取蜘蛛香膠囊內(nèi)容物約0.5 g，精密稱定，按“2.4.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別于配制后0、1、3、6、12、24 h，按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定峰面積。結(jié)果同一供試品溶液在不同時(shí)間點(diǎn)所測(cè)得的橙皮苷峰面積的RSD為1.7%(n=6)，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的蜘蛛香膠囊內(nèi)容物6份，每份約0.5 g，精密稱定，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)得同一批次蜘蛛香膠囊中橙皮苷的平均含量為2.11 mg/粒，RSD為1.9%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批號(hào)已知橙皮苷含量的蜘蛛香膠囊內(nèi)容物6份，每份約0.5 g，精密稱定，每份分別精密加入橙皮苷對(duì)照品溶液20 mL(0.2005 mg/mL)，按“2.4.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，并按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見表1，橙皮苷的平均回收率為97.7%，RSD為1.3%(n=6)，表明該方法準(zhǔn)確性良好。

(A.橙皮苷對(duì)照品；B.蜘蛛香膠囊供試品；1. 橙皮苷)(A.reference substance of hesperidin; B. tested sample of Valeriana jatamansi Jones capsule; 1. hesperidin)圖2 橙皮苷的高效液相色譜圖Fig 2 The HPLC chromatogram of hesperidin

樣品編號(hào)樣品重量樣品含量加入量測(cè)得總量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%10.50074.19524.018.165099.020.49974.19744.018.032395.630.50014.19284.018.121397.940.50054.20094.018.142798.350.50034.19334.018.157598.960.49954.19874.018.077396.797.71.3

2.4.9 樣品含量測(cè)定 取不同批次的蜘蛛香膠囊內(nèi)容物，每批取3份，每份約0.5 g，精密稱定，按“2.4.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，并按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算出橙皮苷含量，并換算成每粒蜘蛛香膠囊中所含的橙皮苷含量。6批次蜘蛛香膠囊的橙皮苷含量測(cè)定結(jié)果見表2，橙皮苷平均含量為2.08 mg/粒。

表2 蜘蛛香膠囊中橙皮苷的含量測(cè)定結(jié)果Tab 2 The determination of hesperidin in tested sample of Valeriana jatamansi Jones capsule

3 討論與結(jié)論

目前中藥質(zhì)量控制的方法是其活性成分的定性與定量分析。橙皮苷(hesperidin)是蜘蛛香的主要化學(xué)成分之一，含量高，穩(wěn)定性好，可作為蜘蛛香質(zhì)量控制的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。鑒別試驗(yàn)中，采用了獸藥典普遍采用的顯微鑒別和薄層色譜鑒別，其鑒別操作簡(jiǎn)單、特征明顯，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好。對(duì)水分、裝量差異、崩解時(shí)限、微生物限度等檢查項(xiàng)目進(jìn)行方法驗(yàn)證和測(cè)定，檢查結(jié)果均符合我國(guó)獸藥典的相關(guān)規(guī)定。參考文獻(xiàn)報(bào)道的蜘蛛香藥材中橙皮苷HPLC檢測(cè)方法[10-12]，分別選擇了乙腈-0.1%磷酸溶液(15∶80)、乙腈：水(15∶85)、甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)、乙腈-2%醋酸溶液(18∶82)等幾種不同組成及不同比例的流動(dòng)相進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示以甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)作為流動(dòng)相獲得的色譜峰峰形較好，橙皮苷的分離效果最好。

6個(gè)不同批次的蜘蛛香膠囊中橙皮苷(C28H34O15)的平均含量為2.08 mg/粒，考慮不同產(chǎn)地蜘蛛香藥材中橙皮苷含量的差異，以含量測(cè)定值的80%作為含量下限，本品每粒含蜘蛛香以橙皮苷(C28H34O15)計(jì)，不得少于1.66 mg。綜上所述，所建立的蜘蛛香膠囊質(zhì)量控制方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，能準(zhǔn)確的進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，可作為其生產(chǎn)、檢驗(yàn)、使用和監(jiān)管的技術(shù)依據(jù)。