HPLC法同時(shí)測定麻杏石甘口服液中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿及苦杏仁苷含量

章安源，李有志，張傳津，張呈軍，劉道中

(山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250022)

麻杏石甘口服液是由麻黃、杏仁、石膏、甘草這4味中藥經(jīng)過現(xiàn)代提取工藝而成的口服液制劑。麻黃為本方的君藥，所含有效成分鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿為擬腎上腺類藥物，是國家規(guī)定的需要嚴(yán)格控制的毒、麻類藥品[1]，具有發(fā)汗散寒，宣肺平喘，利水消腫的作用。且近年來有關(guān)麻黃生物堿類毒副作用報(bào)道日趨增多[2]，嚴(yán)格控制含量勢(shì)在必行。苦杏仁苷是苦杏仁的主要有效成分，止咳平喘，協(xié)助麻黃，為佐藥[3]。《中國獸藥典2015年版二部》僅有薄層色譜技術(shù)鑒別麻黃堿及甘草的存在與否，缺少麻黃和苦杏仁兩種主藥成分含量控制指標(biāo)，目前尚未有應(yīng)用HPLC同時(shí)檢測麻杏石苷口服液中各組分的報(bào)道，建立一種快速、可靠、易行的檢測方法具有十分重要意義。研究首次建立HPLC在同一色譜體系中對(duì)其含量測定方法，可更好控制本制劑的內(nèi)在質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀Waters 2695 (配二極管陣列檢測器2998)；AE-240電子天平(瑞士Mettlrer Toledo 公司)；KQ - 250DB超聲儀(昆山市超聲儀有限公司)；

1.2 試藥與試劑 鹽酸麻黃堿(批號(hào)：171241 - 201007，含量99.7%)；鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品(171237-201510，含量99.8%)；苦杏仁苷對(duì)照品(110820-201607，含量90.7%)；均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈(Merck, 色譜純，) 磷酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水。

1.3 檢測方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱為waters Eclipso XDB-118 C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：0.1%磷酸溶液 (含0.3%三乙胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0)[2]，按表1進(jìn)行梯度洗脫；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫為30 ℃。檢測波長范圍210 nm。

1.3.2 陰性對(duì)照溶液 按麻杏石甘口服液處方比列精確稱取藥材(麻黃、杏仁除外)，按照制備工藝制成陰性樣品溶液后[4]，照“2.2.3”項(xiàng)下方法處理制成空白樣品溶液。

表1 梯度洗脫條件表Tab 1 Gradient elution condition table

1.3.3 混合對(duì)照品溶液 精密稱取鹽酸麻黃堿，鹽酸偽麻黃堿，苦杏仁苷對(duì)照品適量，加初始比列流動(dòng)相配制成濃度為200 μg/ml的混合對(duì)照品溶液。0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備 取適量2.2.1項(xiàng)下溶液，用初始流動(dòng)相稀釋，制備成系列濃度為：0.5、1、5、12.5、25、50、100、200 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 供試品溶液制備 取樣品充分振搖，混勻，精密量取 1 mL，置 25 mL量瓶中，加初始流動(dòng)相至刻度，超聲(120 W，40 kHz)處理 30 min，放冷，用流動(dòng)相補(bǔ)足至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得[5]。

1.3.6 陽性添加樣品 精密量取1.3.2項(xiàng)下陰性樣品溶液2 mL，分別精密加入各成分對(duì)照品，平行6份，混合均勻，按1.3.5項(xiàng)下方法制成陽性添加樣品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖 通過陰性對(duì)照溶液和陽性添加試驗(yàn)排除各制劑中主要成分與輔料對(duì)被測物的干擾。分別精密量取1.3.2、1.3.3、1.3.5項(xiàng)下溶液各10 μL,照1.3.1項(xiàng)下色譜條件，記錄色譜圖與光譜圖。結(jié)果顯示，混合對(duì)照品溶液中鹽酸麻黃堿的保留時(shí)間約為8.289 min，鹽酸偽麻黃堿與苦杏仁苷的保留時(shí)間約為10.294、40.683 min，與供試品三組峰出峰時(shí)間相吻合，峰分離度好，輔料峰也不在三組成分峰處出峰(圖1～圖3)。

圖1 混合對(duì)照品溶液 (1鹽酸麻黃堿，2鹽酸偽麻黃堿3苦杏仁苷)Fig 1 Mixed control solution

圖2 供試品溶液Fig 2 sample solution

圖3 陰性對(duì)照溶液Fig 3 Negative contrast solution

2.2 方法線性考察 分別精密量取1.3.4項(xiàng)下各濃度工作液20 μL，照1.3.1項(xiàng)色譜條件下注入儀器，以濃度(μg)為橫坐標(biāo)(X),，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，計(jì)算回歸方程Y鹽酸麻黃堿=19612X+9440.4，R2=0.9993；Y鹽酸偽麻黃堿=20095x+949.14,R2=0.9997； Y苦杏仁苷=6714x-29014,R2=0.9992。結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿，鹽酸偽麻黃堿在0.5～200 μg/mL，苦杏仁苷在5～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL注入色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次。以峰面積計(jì)算，得出鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿，杏仁苷的RSD分別為2.23%，2.52%， 3.02%。表明儀器精密度良好，符合檢測要求。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 同批供試品( 批號(hào)為 20180101，山東某獸藥生物科技有限公司提供) ，按1.3.5項(xiàng)下制備6份樣品溶液，分別注入液相色譜儀，計(jì)算鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿，苦杏仁苷含量，RSD分別為1.2%，1.6%、2.0%,說明該方法重現(xiàn)性好，含量穩(wěn)定。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1.3.5項(xiàng)下同一供試品溶液(批號(hào)：20180101)，室溫下每隔3 h連測8次，進(jìn)樣體積20 μL，鹽酸麻黃堿，鹽酸偽麻黃堿，苦杏仁苷峰面積RSD分別為0.81%，0.82%、0.92%，表明本制劑在制備后的24 h內(nèi)成份較穩(wěn)定。

2.6 回收率試驗(yàn) 取1.3.6項(xiàng)下溶液2 mL，按1.3.1項(xiàng)下條件測定鹽酸麻黃堿，鹽酸偽麻黃堿，苦杏仁苷含量?；厥章试?0.24～92.16%之間，變異系數(shù)在0.53%～3.20%之間，結(jié)果見表2～表4。表明該方法回收率較好，準(zhǔn)確度和精密度可以滿足檢測需求。

表2 鹽酸麻黃堿回收率試驗(yàn)(n=6)Tab 2 The resultof the recovery rate of ephedrine hydrochloride

表3 鹽酸偽麻黃堿回收率試驗(yàn)(n=6)Tab 3 The resultof the recovery rate of pseudoephedrine hydrochloride

表4 苦杏仁苷回收率試驗(yàn)(n=6)Tab 4 The resultof the recovery rate of amygdalin

2.7 樣品測定 按照1.3.5項(xiàng)下條件配制不同批號(hào)供試品溶液，進(jìn)樣，測定，計(jì)算。結(jié)果見表5。該方法穩(wěn)定，適合檢測需求。

表5 樣品測定結(jié)果(n=6)Tab 5 The resultof the sample content

2.8 檢出限和定量限 “1.3.2”項(xiàng)下溶液色譜圖顯示無麻黃堿及苦杏仁苷及其他成分干擾，分別添加濃度2.5 μg/mL鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品，12.5 μg/mL苦杏仁苷對(duì)照品，顯示信噪比(S/N)>3，故確定為方法的檢出限。添加濃度12.5 μg/mL鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品，65 μg/mL苦杏仁苷對(duì)照品，信噪比(S/N)>10，作為此方法定量限。

3 討論與結(jié)論

3.1 流動(dòng)相的選擇 苦杏仁苷和麻黃堿的測定中，流動(dòng)相的使用有多種，由于苦杏仁苷和麻黃堿在207、210 nm波長分別有最大吸收波長，但是甲醇在210 nm的末端波長處有少量紫外吸收，對(duì)準(zhǔn)確測定結(jié)果具有一定的影響，改用在末端波長吸收較小的乙腈替換甲醇做流動(dòng)相，基線更加平穩(wěn)[6]。故考察以下5種有機(jī)相成分為乙腈的組成及比列：乙腈-0.1%磷酸溶液(5∶95)[7]、乙腈-0.2%磷酸溶液(5∶95)[8]、乙腈-0.1 mol/L磷酸二氫鉀溶液(含0.1%三乙胺，磷酸調(diào)節(jié)Ph3.0)(4.5∶95.5)[9]、乙腈-0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(10∶90)[10]、乙腈-1%磷酸(3∶97)[11]。優(yōu)化篩選后發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸溶液流動(dòng)相中添加0.3%三乙胺，磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0，可使制劑中麻黃堿和偽麻黃堿分離良好，峰形佳，并無拖尾及其它雜質(zhì)峰的干擾。此外，為了擴(kuò)大方法的適用范圍，綜合考慮苦杏仁苷的出峰時(shí)間不能太晚且與其它物質(zhì)能完全分離，采用了梯度洗脫，論證了三組不同比例乙腈-0.1磷酸溶液對(duì)苦杏仁苷峰的影響，使用流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸溶液(8∶92)梯度洗脫,流速控制在0.8 mL/min，與雜質(zhì)峰分離度較好，峰形對(duì)稱。故此流動(dòng)相能夠使待測三種成分較好分離，分析時(shí)間控制在55 min內(nèi)，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好。

3.2 色譜柱的選擇 《中國獸藥典》2015年版二部中要求麻黃項(xiàng)下對(duì)麻黃堿偽麻黃堿測定中使用極性乙醚連接苯基鍵合硅膠柱，造價(jià)高，未使用。使用不同型號(hào)的ZORBAX SB C18[12]、(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Wonda-Sil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)[6]， Waters Eclipso XDB-118 C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)進(jìn)行比較，后者普通C18柱即可滿足三組成分同時(shí)進(jìn)行測定的需求。

3.3 供試品溶液前處理 供試品溶液的制備過程中先后使用1 mol/L鹽酸-20%乙醇(1∶10)萃取[13]； AB-8大孔樹脂(內(nèi)徑10-15mm)水洗脫[14]；乙醚振搖[8]等提取方法、提取溶劑、提取時(shí)間進(jìn)行考察；結(jié)果表明以上幾種處理方法繁瑣，重現(xiàn)性差?？紤]到麻黃堿及苦杏仁苷的溶解性，使用初始流動(dòng)相超聲(功率120 W，40 kHz)處理樣品溶液30 min，樣品過濾后直接進(jìn)樣，操作簡單，有效成分能夠較完全提取。符合中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)偏向于樣品前處理簡單，重復(fù)性高，成本低、效率高的發(fā)展方向[15]。

3.4 柱溫的確定 對(duì)25 ℃，30 ℃，35 ℃柱溫進(jìn)行比較試驗(yàn)， 30 ℃柱溫時(shí)，基線平穩(wěn)，系統(tǒng)柱壓穩(wěn)定，出峰時(shí)間穩(wěn)定，因此30 ℃柱溫符合檢測要求。

3.5 結(jié)論 使用HPLC、UPLC同時(shí)測定中藥材中多種成分是控制質(zhì)量的有效方法之一[16-17]，建立的方法可以同時(shí)分離3種有效成分后進(jìn)行定量分析，前處理快速準(zhǔn)確，實(shí)用性強(qiáng)，可用于鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷的含量測定，為快速有效地控制麻杏石甘口服液的質(zhì)量提供新的方法。