膜分離技術(shù)在魚腥草芩藍(lán)口服液制備工藝中的應(yīng)用

陸 安，杜紅娜，劉炳煒，郭 寬，李 芳，郭永紅，郭永國(guó)

(1.河北維爾利動(dòng)物藥業(yè)集團(tuán)有限公司，石家莊 050200； 2.河北省功能性飼料添加劑工程技術(shù)研究中心，石家莊 050200；3.石家莊市獸用功能性添加劑工程技術(shù)研究中心，石家莊 050200)

魚腥草芩藍(lán)口服液的處方來(lái)源于《國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科肺系(一)分冊(cè)》收載的復(fù)方魚腥草合劑[1]，由魚腥草、黃芩、板藍(lán)根、連翹、金銀花五味中藥組成，該制劑具有清熱解毒的功效，用于外感風(fēng)熱引起的咽喉腫痛、急性咽炎、扁桃體炎有風(fēng)熱癥候者。與家禽外感發(fā)熱癥候相似，臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，該制劑對(duì)于家禽因外邪入侵引起的體溫升高、呼吸道感染等癥狀有明顯的改善作用。因此將其轉(zhuǎn)化為國(guó)家三類新獸藥(證書編號(hào)：(2018)新獸藥證字5號(hào))[2]。魚腥草芩藍(lán)口服液申報(bào)制備工藝采用傳統(tǒng)水提醇沉除雜的工藝，酒精試劑用量大，成本相對(duì)較高。膜分離技術(shù)作為一種新興的綠色工業(yè)科學(xué)技術(shù)，集分離、濃縮、純化和精制功能于一體，且具有簡(jiǎn)便易行、生產(chǎn)周期短、可重復(fù)性利用的優(yōu)勢(shì)[3-5]，在中藥提取分離中應(yīng)用日益增多，因此，本實(shí)驗(yàn)采用膜分離技術(shù)，利用不同膜組件截留不同分子量的原理，采用微濾、超濾和納濾相結(jié)合的方式，對(duì)魚腥草芩藍(lán)水提液進(jìn)行膜過(guò)濾除雜并進(jìn)行膜濃縮，開展優(yōu)化除雜工藝的實(shí)驗(yàn)研究，并與傳統(tǒng)水提醇沉工藝進(jìn)行比較，為該技術(shù)在魚腥草芩藍(lán)水提液除雜精制過(guò)程中應(yīng)用的適用性提供參考，并為提取純化工藝的優(yōu)化提供科研數(shù)據(jù)支持，為提升產(chǎn)品品質(zhì)提供質(zhì)量保障。

1 儀器與材料

1.1 儀器 多功能實(shí)驗(yàn)室膜分離設(shè)備(紹興海納膜技術(shù)有限公司)，膜管材質(zhì)孔徑分別為：PVDF微濾膜：孔徑 200 nm；PES超濾膜：孔徑50 kd、20 kd、10 kd、2.5 kd、1.5 kd、1 kd；復(fù)合膜納濾膜：孔徑 500 D；UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國(guó) Thermo公司)，DAD檢測(cè)器，變色龍工作站； AUW120D 型電子天平(日本 SHIMADZU 公司)；101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱(龍口市電爐制造廠)；ZSW-H250A藥品綜合穩(wěn)定性試驗(yàn)箱(偵翔機(jī)電科技(上海有限公司)。

1.2 試劑與對(duì)照品 綠原酸對(duì)照品(批號(hào) 110753-201415，含量96.2%)，黃芩苷對(duì)照品(批號(hào) Z0271504，含量95.9%) 均購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。乙腈為色譜純；甲醇、磷酸、磺基水楊酸為分析純；娃哈哈水。

1.3 藥材 魚腥草、黃芩、板藍(lán)根、連翹、金銀花等藥材購(gòu)于安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)本公司質(zhì)控部鑒別均符合《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015版(Ⅱ部)有關(guān)項(xiàng)下規(guī)定[6]。

2 方法與結(jié)果

2.1 魚腥草芩藍(lán)水提液的制備 按組方配比稱取各味藥材，加10倍量水，煎煮兩次，每次2 h，水煎液過(guò)濾，合并，作為魚腥草芩藍(lán)水提液，利用膜分離技術(shù)進(jìn)行除雜、濃縮。

2.2 膜分離試驗(yàn) 取樣品液置膜分離設(shè)備進(jìn)料筒，開機(jī)，樣品液通過(guò)進(jìn)料泵輸入膜分離組件，以錯(cuò)流方式進(jìn)行過(guò)濾，同時(shí)通過(guò)冷卻水循環(huán)機(jī)組對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行冷卻，以控制樣品液溫度。經(jīng)膜分離后透過(guò)液從膜組件外側(cè)出口端流出，截留液返回進(jìn)料筒中再次循環(huán)。待循環(huán)藥液體積較小，系統(tǒng)壓力不穩(wěn)時(shí)，加入2 L水繼續(xù)過(guò)濾，至過(guò)濾完全，分別收集透過(guò)液及未透過(guò)液，分別測(cè)定有效成分含量。

2.3 綠原酸和黃芩苷含量測(cè)定 以綠原酸和黃芩苷含量為考察指標(biāo)，通過(guò)HPLC法分別測(cè)定水提液、不同孔徑膜管透過(guò)液、不同截留分子量范圍藥液及魚腥草芩藍(lán)口服液中綠原酸、黃芩苷含量。綠原酸和黃芩苷含量測(cè)定梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.4 微濾、超濾、納濾膜孔徑初步篩選 在室溫條件下，取適量水提液，置膜分離設(shè)備進(jìn)料筒，以200 nm濾膜微濾，分別收集透過(guò)液及未透過(guò)液，得魚腥草芩藍(lán)微濾液及大于200 nm藥液；取魚腥草芩藍(lán)微濾液，平均分成四份，其中一份減壓濃縮制備口服液得魚腥草芩藍(lán)口服液(200 nm)；剩余四份微濾液，于室溫條件下，置膜分離設(shè)備進(jìn)料筒，分別在不同孔徑膜(50 kd、10 kd、2.5 kd)適用壓力范圍內(nèi)進(jìn)行濾過(guò)，分別收集不同孔徑膜透過(guò)液，觀察濾液性狀，測(cè)定綠原酸和黃芩苷含量，比較膜過(guò)濾前后各成分轉(zhuǎn)移率及固形物去除率的變化；并將透過(guò)液進(jìn)行500 d納濾膜濃縮，濃縮液制備不同孔徑魚腥草芩藍(lán)口服液(200 nm、50 kd、10 kd、2.5 kd)，觀察口服液性狀并測(cè)定溶液中綠原酸和黃芩苷含量，分別對(duì)4種不同孔徑膜管進(jìn)行比較，對(duì)魚腥草芩藍(lán)水提液膜過(guò)濾除雜分子量截留范圍進(jìn)行初步篩選；納濾液分別收集，測(cè)定綠原酸和黃芩苷含量，對(duì)膜濃縮所用納濾膜孔徑進(jìn)行初步考察，結(jié)果見(jiàn)圖1和表2～表4。

圖1 水提液過(guò)濾前后藥液澄清度Fig 1 The liquid clarification degree of water extraction before and after filtering

孔徑性狀濾過(guò)前濾過(guò)后綠原酸轉(zhuǎn)移率/%黃芩苷轉(zhuǎn)移率/%200 nm渾濁透明、澄清92.3689.1350 kd透明、澄清透明、澄清89.2187.2510 kd透明、澄清透明、澄清59.2329.142.5 kd透明、澄清透明、澄清13.562.87

轉(zhuǎn)移率(%)=濾過(guò)液中有效成分的量/水提液中有效成分的量*100%

表3 不同膜孔徑膜固形物去除率的比較Tab 3 The comparison of different membrane aperture membrane solids removal rate

固形物去除率(%)=(水提液固形物總量-濾液固形物總量)/水提液固形物總量*100%

表4 膜孔徑對(duì)魚腥草芩藍(lán)口服液制劑工藝的影響結(jié)果Tab 4 the effect of membrane pore diameter on the preparation technology of Yuxingcaoqinlan oral liquid

2.5 分子量截留范圍的深入考察 按確定組方及工藝進(jìn)行提取，放冷至室溫，于室溫條件下，200 nm微濾后，依次通過(guò)不同孔徑濾膜(50 kd、20 kd、10 kd、2.5 kd、1.5 kd、1 kd)濾過(guò)，分別收集透過(guò)液及未透過(guò)液，得不同分子量截留范圍溶液(>200 nm、50 kd～200 nm、20 kd～50 kd、10 kd～20 kd、2.5 kd～10 kd、1.5 kd～2.5 kd、1 kd～1.5 kd、<1 kd)，分別測(cè)定不同截留分子量范圍內(nèi)綠原酸、黃芩苷含量，計(jì)算兩種有效成分所占比例，以確定膜分離技術(shù)在魚腥草芩藍(lán)口服液應(yīng)用時(shí)的分子量截留范圍。結(jié)果見(jiàn)表5和圖2。

表5 不同分子量范圍有效成分含量占比Tab 5 The radio of active component contents in different molecular weight range

圖2 不同分子量范圍有效成分含量占比圖Fig 2 The radio of active component contents in different molecular weight range

2.6 工藝驗(yàn)證 按確定的工藝制備魚腥草芩藍(lán)水提液，三份，分別以200 nm濾膜微濾后，按確定的分子量截留范圍進(jìn)行膜分離和膜濃縮，分離測(cè)定除雜前后藥液中黃芩苷和綠原酸含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率；濃縮液制備口服液，分別測(cè)定樣品中黃芩苷和綠原酸含量，對(duì)工藝的可行性進(jìn)行考察。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 濾過(guò)前后藥液性狀及有效成分轉(zhuǎn)移率比較Tab 6 The comparison of transfer rate of effective component before and after filtration

轉(zhuǎn)移率(%)=濾過(guò)液中有效成分的量/水提液中有效成分的量*100%

2.7 不同工藝魚腥草芩藍(lán)口服液的制備及含量比較

2.7.1 膜分離技術(shù) 取微濾及不同孔徑超濾膜濃縮液，進(jìn)一步減壓濃縮至適量，加入3 ‰苯甲酸鈉，攪勻，濾過(guò)，即得。

2.7.2 傳統(tǒng)水提醇沉工藝 按組方配比稱取各味藥材，加10倍量水，煎煮兩次，每次2 h，水煎液過(guò)濾，合并，濾液減壓濃縮置至適當(dāng)相對(duì)密度的清膏，加乙醇至含醇量為70%，搖勻，靜置，濾過(guò)，濾液回收乙醇并濃縮至適量，加入3 ‰苯甲酸鈉，攪勻，濾過(guò)，即得。

2.7.3 綠原酸和黃芩苷含量測(cè)定 按2.3項(xiàng)下方法，測(cè)定魚腥草芩藍(lán)口服液中綠原酸和黃芩苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表7。

2.7.4 蛋白質(zhì)檢測(cè) 取魚腥草芩藍(lán)口服液1 mL，加水稀釋至10 mL，取1 mL，加新配制的30%磺基水楊酸試液1 mL，混勻，放置5 min，觀察是否有渾濁出現(xiàn)。結(jié)果顯示：膜分離除雜工藝制備的樣品未出現(xiàn)渾濁，醇沉工藝制備的樣品有渾濁出現(xiàn)。

2.7.5 穩(wěn)定性考察 按照《獸用中藥、天然藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的規(guī)定及魚腥草芩藍(lán)口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)不同工藝制備的魚腥草芩藍(lán)口服液進(jìn)行12個(gè)月長(zhǎng)期穩(wěn)定性(溫度25±2℃、相對(duì)濕度60±10%)和6個(gè)月加速穩(wěn)定性(溫度30±2 ℃、相對(duì)濕度60±5%)考察，分別考察不同工藝樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示：不同工藝制備的魚腥草芩藍(lán)口服液，穩(wěn)定性均良好。

表7 不同工藝魚腥草芩藍(lán)口服液有效成分含量的比較(n=3)Tab 7 The comparison of effective component content between different process of Yuxingcaoqinlan oral liquids (n=3)

3 討論與結(jié)論

分離精制工藝是中藥復(fù)方口服液生產(chǎn)過(guò)程中一個(gè)極為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，膜分離是結(jié)合分離純化和濃縮為一體的新方法，具有分離度高、分離成分穩(wěn)定、無(wú)污染、藥物純度理想等優(yōu)點(diǎn)，在人用中藥精制液制劑的純化中應(yīng)用較多[7-9]，在獸藥制劑中的研發(fā)卻鮮有報(bào)道，且目前尚未見(jiàn)有應(yīng)用膜分離技術(shù)純化魚腥草芩藍(lán)制劑的的報(bào)道，鑒于此，研究團(tuán)隊(duì)探討了膜分離技術(shù)純化魚腥草芩藍(lán)制劑的應(yīng)用價(jià)值。

結(jié)合濾液性狀、固形物去除率、綠原酸和黃芩苷轉(zhuǎn)移率及對(duì)口服液劑型的影響5個(gè)指標(biāo)，對(duì)3種不同孔徑超濾膜及200 nm微濾膜進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)魚腥草芩藍(lán)口服液水提液經(jīng)4種不同孔徑膜濾過(guò)后，均可得到澄清、透明濾液。200 nm微濾膜有效成分轉(zhuǎn)移率最佳，但所濾液固形物去除率相對(duì)較差，因此所制備口服液性狀較差；其余3種孔徑超濾膜綠原酸和黃芩苷的轉(zhuǎn)移率隨著孔徑的增大而升高，固形物去除率隨著孔徑的增大而降低，且口服液性狀均較好，同文獻(xiàn)[10-12]研究結(jié)果類似。其中，孔徑50 kd超固形物去除率較高，綠原酸和黃芩苷轉(zhuǎn)移率最高，在85%以上，且明顯高于傳統(tǒng)水提醇沉工藝所制備樣品；2.5 kd和10 kd超濾膜綠原酸和黃芩苷轉(zhuǎn)移率轉(zhuǎn)移率相對(duì)較低，在60%以下，損失較多，因此，膜過(guò)濾孔徑初步篩選為50 kd。

膜分離技術(shù)的應(yīng)用還體現(xiàn)在對(duì)不同分子量范圍成分的獲取及藥理活性研究[13-14]。陳彤[15]等采用截留相對(duì)分子量100 kd的聚醚砜膜對(duì)三七總皂苷進(jìn)行分離純化。膜分離純化工藝研究文獻(xiàn)報(bào)道較多，但膜分離純化和膜濃縮工藝相結(jié)合的研究報(bào)道相對(duì)比較少。魚腥草芩藍(lán)口服液試驗(yàn)過(guò)程中首次利用膜分離技術(shù)對(duì)魚腥草芩藍(lán)水提液進(jìn)行分子量截留范圍的深入考察，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，魚腥草芩藍(lán)水提物中有效成分綠原酸集中在1.5 kd～20 kd之間，占比分別為76.94%；有效成分黃芩苷集中在2.5 kd～50 kd之間，占比分別為77.05%，均在75%以上，綜合考慮兩種成分的占比，確定優(yōu)選截留分子量范圍可選擇為1.5 kd～50 kd。三批次驗(yàn)證試驗(yàn)表明，膜過(guò)濾工藝除雜后，藥液中綠原酸和黃芩苷轉(zhuǎn)移率均在70%以上，且所制備魚腥草芩藍(lán)中綠原酸和黃芩苷含量均比傳統(tǒng)醇沉工藝要高。對(duì)于不同分子量范圍所含成分的藥理活性的不同，有待于進(jìn)一步研究。

黃芩苷和綠原酸分子量分別為446.35和354.31，均小于500，但在研究中發(fā)現(xiàn)，在水溶液中，采用截留分子量為500的膜過(guò)濾時(shí)，透過(guò)液中卻不存在黃芩苷和綠原酸成分，說(shuō)明黃芩苷和綠原酸與其它成分之間可能是以類似于絡(luò)合物性質(zhì)的“分子團(tuán)”形式存在，其原因可能是中藥所含成分的復(fù)雜性導(dǎo)致各成分之間相互吸引而形成“分子團(tuán)”。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)綠原酸“分子團(tuán)”的大小約為1.5 kd分子量，黃芩苷“分子團(tuán)”的大小約為2.5 kd分子量，所以用膜分離純化采用的膜標(biāo)稱分子量就不能與分子量接近，而應(yīng)該通過(guò)試驗(yàn)來(lái)摸索。

蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)類成分是可能影響口服液制劑穩(wěn)定性的常見(jiàn)物質(zhì)。Kumar[16]將綠茶提取液通過(guò)孔徑0.2 μm的微濾膜，除去細(xì)胞碎片及大分子蛋白質(zhì)。魚腥草芩藍(lán)口服液試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)蛋白質(zhì)類成分進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示：膜分離除雜工藝制備的樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)時(shí)未出現(xiàn)渾濁，醇沉工藝制備的樣品有渾濁出現(xiàn)，說(shuō)明膜分離除雜工藝確實(shí)過(guò)濾掉了絕大部分的蛋白質(zhì)類無(wú)效成分；試驗(yàn)過(guò)程中亦對(duì)鞣質(zhì)類成分進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示：兩種工藝制備的魚腥草芩藍(lán)口服液中均有鞣質(zhì)存在。鞣質(zhì)的分子量為1701.22，而膜濃縮的分子量截留范圍為小于等于1.5 kd，考慮到有效成分的保留率，膜分離除雜工藝未能將魚腥草芩藍(lán)口服液中鞣質(zhì)類成分去除掉。提示在以后的試驗(yàn)研究中，在保證有效成分保留率的前提下，可以同時(shí)去除掉蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)類可能影響制劑穩(wěn)定性的物質(zhì)，以保證口服液類制劑的穩(wěn)定性。魚腥草芩藍(lán)口服液穩(wěn)定性試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，不同工藝制備的樣品12個(gè)月長(zhǎng)期穩(wěn)定性和6個(gè)月加速穩(wěn)定性均良好，12個(gè)月以上的長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)及臨床療效驗(yàn)證試驗(yàn)有待于進(jìn)一步考察。

綜上所述，1.5 kd～50 kd截留分子量范圍內(nèi)的超濾膜對(duì)魚腥草芩藍(lán)水提液濾過(guò)效果較好，且在口服液生產(chǎn)過(guò)程中可縮短生產(chǎn)流程、提高制劑的穩(wěn)定性和安全性，對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)和推廣具有指導(dǎo)意義。