假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良患兒的血清酶學(xué)與基因特征分析

黃彩芝 張聰 李?lèi)?ài)國(guó) 莫麗亞

湖南省兒童醫(yī)院檢驗(yàn)中心（長(zhǎng)沙 410007）

假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良（pseudohypertrophic mus?cular dystrophy）是進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良中最常見(jiàn)的一種嚴(yán)重神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病，為X連鎖隱性遺傳病，其病理改變是抗肌萎縮蛋白基因缺失或突變而致肌纖維膜上的抗肌萎縮蛋白表達(dá)缺乏，導(dǎo)致肌纖維進(jìn)行性變性壞死［1-3］。根據(jù)抗肌萎縮蛋白表達(dá)缺乏的程度，可將該病分為Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）和Becker肌營(yíng)養(yǎng)不良（Becker muscular dystrophy，BMD）兩種表型，臨床上最常見(jiàn)的假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良是DMD［4］。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)DMD/BMD雖無(wú)有效的治療方法，但早期準(zhǔn)確識(shí)別該病并采取適當(dāng)?shù)母深A(yù)措施可延緩病情、延長(zhǎng)患兒生命，提高生存質(zhì)量［5］。本研究通過(guò)對(duì)118例DMD/BMD患兒的血清酶學(xué)與基因特征進(jìn)行分析，旨在提高對(duì)本病的早期認(rèn)識(shí)及診斷水平。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2014年1月至2016年12月在我院臨床診斷為DMD/BMD并要求基因診斷的118例患兒作為研究對(duì)象。DMD/BMD的臨床診斷根據(jù)《兒科學(xué)》第七版關(guān)于假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］，并排除其他常見(jiàn)神經(jīng)系統(tǒng)疾病與遺傳代謝性肌病。隨機(jī)選取同期在我院兒童保健科體檢的健康男性兒童40例作為正常對(duì)照組。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選患兒均征得監(jiān)護(hù)人知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集和處理 所有研究對(duì)象清晨空腹抽取靜脈血4.0 mL，其中2.0 mL EDTA?K2抗凝血提取DNA用于基因檢測(cè)，另2.0 mL未抗凝血分離血清用于丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotrans?feras，ALT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate ami?notransferase，AST）、乳酸脫氫酶（lactic dehydroge?nase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase MB，CK?MB）、肌紅蛋白（myoglobin，MB）、羥丁酸脫氫酶（hydroxybu?tyrate dehydrogenase，HBDH）等酶學(xué)檢測(cè)?；驒z測(cè)3周內(nèi)完成，其余各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)均在采血后2 h內(nèi)完成。

1.2.2 血清酶學(xué)檢測(cè) 采用速率法檢測(cè)血清ALT、AST、LDH、CK、HBDH，免疫抑制法檢測(cè)CK?MB，膠乳免疫比濁法檢測(cè)MB，所用儀器為美國(guó)西門(mén)子2400全自動(dòng)生化分析儀，試劑由上?？迫A生物工程股份有限公司提供（ALT批號(hào)2014036Q、2015072Q；AST批號(hào)2014022Q、2015012Q；LDH批號(hào)2014062Q、2015121Q；CK批號(hào)20141012、0150912；HBDH 批 號(hào) 20130918、16051102；CK?MB 批號(hào)20140222、20151212；MB批號(hào)20131212、160510），由專(zhuān)人嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行操作，所有項(xiàng)目質(zhì)控合格，儀器狀態(tài)正常。酶學(xué)指標(biāo)異常標(biāo)準(zhǔn)：ALT＞40 U/L、AST＞40 U/L、LDH＞450 U/L、CK＞174 U/L、CK?MB＞24 U/L、MB＞90 ng/mL、HBDH＞182 U/L。

1.2.3 基因檢測(cè) 采用多重連接酶依賴探針擴(kuò)增（multiplex ligation?dependent probe amplification，MLPA）技術(shù)（試劑為荷蘭SALSA公司生產(chǎn)的P034型和P035型試劑盒）檢測(cè)待檢樣本DMD基因的79個(gè)外顯子，用正常DNA作為參照，從而檢測(cè)DMD基因是否發(fā)生缺失或重復(fù)突變。當(dāng)檢測(cè)到單個(gè)外顯子缺失時(shí)，進(jìn)一步應(yīng)用PCR技術(shù)、基因測(cè)序技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)范圍）［M（P25～P75）］表示，組間比較采用 Mann?WhitneyU非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。采用ROC曲線法評(píng)價(jià)ALT、AST、LDH、CK、CK?MB、MB、HBDH對(duì)DMD/BMD患兒基因診斷的預(yù)測(cè)能力，以約登指數(shù)（Youden′s index）最大時(shí)的臨界值作為截?cái)嘀?。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 118例DMD/BMD患兒均為男性，最大年齡133個(gè)月，最小1個(gè)月；其中學(xué)齡前患兒（＜72月）82例，學(xué)齡期患兒（≥ 72月）36例。118例患兒中52例（44.07%）具有明顯臨床癥狀與體征，包括雙下肢或四肢乏力，行走緩慢，易跌倒，呈鴨步，跑步及爬樓梯困難，Gowers征陽(yáng)性，可見(jiàn)翼狀肩、腓腸肌肥大等，其中14例有肌營(yíng)養(yǎng)不良家族史；66例（55.93%）暫無(wú)明顯臨床表現(xiàn)患兒中僅1例有家族史。所有患兒行肌電圖檢查，結(jié)果均提示“肌源性病損電生理改變”。1例行腓腸肌活檢，結(jié)果提示“肌纖維結(jié)構(gòu)部分清楚，可見(jiàn)橫紋結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)脂肪變性或糖原性空泡改變，未見(jiàn)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肌束明顯變圓，肌細(xì)胞橫紋消失”。

2.2 血清酶學(xué)檢測(cè)結(jié)果 DMD/BMD患兒的血清酶學(xué)結(jié)果明顯高于正常對(duì)照組兒童，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜ 0.001），ALT、AST、LDH、CK、CK?MB、MB、HBDH最高水平分別達(dá)正常上限19倍、17倍、12倍、150倍、35倍、32倍、12倍。見(jiàn)表1。

表1 DMD/BMD患兒與正常兒童的血清酶學(xué)比較Tab.1 serum enzymes comparison between DMD/BMD group and control group M（P25～P75）

學(xué)齡前患兒的CK和CK?MB水平明顯高于學(xué)齡期患兒（均P＜0.01），而 ALT、AST、LDH、MB、HBDH水平在兩組患兒中的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 學(xué)齡前患兒與學(xué)齡期患兒的血清酶學(xué)比較Tab.2 serum enzymes comparison between preschool group and school age group M（P25～P75）

2.3 基因檢測(cè)結(jié)果 118例臨床診斷DMD/BMD患兒采用MLPA檢測(cè)DMD基因，陽(yáng)性結(jié)果91例，檢出率77.12%，74例（81.32%）檢出外顯子缺失，其中單個(gè)外顯子缺失17例，經(jīng)PCR驗(yàn)證均無(wú)擴(kuò)增條帶，提示確為相應(yīng)外顯子缺失；17例（18.68%）檢出外顯子重復(fù)。缺失外顯子位于中央缺失熱區(qū)（44-52號(hào)外顯子）內(nèi)的檢出率為60.81%（45/74），位于5′端缺失熱區(qū)（2～20號(hào)外顯子）內(nèi)的檢出率為6.76%（5/74）。91例MLPA檢測(cè)陽(yáng)性患兒中，發(fā)生小片段（＜5外顯子）缺失及重復(fù)突變44例（48.35%），發(fā)生大片段（＞30外顯子）缺失及重復(fù)突變8例（8.79%），最大可見(jiàn)連續(xù)63個(gè)外顯子缺失（17～79號(hào)外顯子缺失）。

27例MLPA檢測(cè)陰性的患兒中有8例接受基因測(cè)序檢查，其中6例檢出突變，分別為外顯子無(wú)義突變 4例：Ex75c.（10603_10622delinsTGATG）、Ex46c.（6677G＞A）、Ex63c.（9258delC）、Ex11c.（1201C＞T）；外顯子移碼突變1例：Ex10c.（1019delA）；內(nèi)含子剪接突變1例：Intr45c.（6614+1G＞C）。

2.4 ROC曲線分析 ROC曲線分析顯示，CK和CK?MB用于預(yù)測(cè)DMD/BMD患兒基因診斷陽(yáng)性具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），曲線下面積分別為0.74和0.69，CK＞2 178.85 U/L時(shí)診斷靈敏度為0.63，特異度為0.81，CK?MB ＞ 121.89 U/L時(shí)診斷靈敏度為 0.78，特異度為 0.52，而 ALT、AST、LDH、MB、HBDH用于判斷DMD/BMD患兒基因診斷情況無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。CK和CK?MB兩者聯(lián)合應(yīng)用（CK+CK?MB）時(shí)對(duì)DMD/BMD患兒基因診斷陽(yáng)性預(yù)測(cè)的曲線下面積為0.79，靈敏度0.84，特異度0.62。見(jiàn)圖1。

3 討論

圖1 各檢測(cè)指標(biāo)對(duì)DMD/BMD患兒基因診斷預(yù)測(cè)的ROC曲線Fig.1 ROC curves of the indexes in predicting gene diagnosis for DMD/BMD children

假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD/BMD）發(fā)病率為新生男嬰1/3 000～1/4 000，女性一般為攜帶者，2/3患兒的病變基因來(lái)自于母親，另有約1/3患兒為新發(fā)突變，與母親遺傳無(wú)關(guān)［7］。該病起病隱匿，早期不易察覺(jué)，多于3～5歲發(fā)病，初期可見(jiàn)動(dòng)作笨拙，隨后逐漸出現(xiàn)上樓梯及蹲下后起立困難，鴨行步態(tài)等，體格檢查示肌肉萎縮明顯，呈進(jìn)行性加重，以四肢近端肌，盆帶肌為著，腓腸肌假性肥大，隨病情緩慢進(jìn)行性加重，逐漸臥床，多于20～30歲左右因呼吸衰竭或心功能不全而死亡。

研究發(fā)現(xiàn)DMD/BMD患兒血清CK明顯升高，同時(shí) LDH、CK?MB、MB 均增高［8］，主要是由于DMD/BMD患兒抗肌萎縮蛋白缺陷導(dǎo)致肌纖維損傷壞死，大量CK、LDH、CK?MB、MB從肌細(xì)胞逸出進(jìn)入血液所致。本組患兒的血清ALT、AST、LDH、CK、CK?MB、MB、HBDH水平均明顯升高，其中CK升高最明顯，最高值達(dá)正常上限的150倍，這是由于CK主要存在于體內(nèi)骨骼肌、心肌和平滑肌中，其中在骨骼肌中含量最高，而DMD/BMD患兒的骨骼肌和心肌均可受累，故血CK極度升高，此點(diǎn)有助于與其他型肌營(yíng)養(yǎng)不良鑒別。學(xué)齡前患兒的CK和CK?MB水平明顯高于學(xué)齡期患兒，說(shuō)明在病變?cè)缙诩±w維進(jìn)行性損傷、壞死，酶快速釋放，CK值升高明顯，到疾病的中后期，大部分肌纖維已被破壞，纖維結(jié)締組織和脂肪組織浸潤(rùn)受損的肌肉組織，正常肌纖維減少，CK活力逐漸下降，同時(shí)亦提示在DMD/BMD患兒起病早期心肌即可受累從而引起心肌細(xì)胞破壞、心肌萎縮和CK?MB水平升高［9］。本組有66例患兒無(wú)明顯臨床表現(xiàn)，其中41例在常規(guī)健康體檢時(shí)發(fā)現(xiàn)ALT與AST升高、25例因其它疾病治愈后血清CK仍異常升高而被進(jìn)一步診斷為DMD/BMD，提示患兒可能在發(fā)病前期就已經(jīng)存在肌細(xì)胞的損害，因此臨床上對(duì)不明原因的血清酶學(xué)明顯升高應(yīng)拓寬診斷思路警惕本病的可能，血清酶學(xué)指標(biāo)可作為診斷DMD/BMD敏感的標(biāo)志物，早期檢測(cè)可明顯減少該病的延遲診斷，在兒童健康監(jiān)測(cè)與疾病篩查中可作為常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)［10-11］。

DMD和BMD是同一DMD基因突變所致的不同臨床表現(xiàn)類(lèi)型，DMD致病基因位于Xp21，該基因的突變率約1/10 000，遠(yuǎn)高于其他基因的突變頻率；且突變形式多樣，外顯子缺失突變是主要的突變類(lèi)型，其次為重復(fù)突變、點(diǎn)突變、小缺失及插入、剪切位點(diǎn)改變等，其中點(diǎn)突變多為無(wú)義突變［12］。本研究采用MLPA技術(shù)對(duì)118例臨床診斷DMD/BMD的患兒進(jìn)行基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)91例（77.12%）患兒存在外顯子缺失或重復(fù)突變，60.81%（45/74）外顯子缺失突變集中在44～52號(hào)外顯子缺失熱點(diǎn)區(qū)域，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［13］。MLPA檢測(cè)陽(yáng)性患兒中，發(fā)生小片段缺失及重復(fù)突變的例數(shù)較多（44例），發(fā)生大片段缺失及重復(fù)突變的有8例，最大可見(jiàn)連續(xù)63個(gè)外顯子缺失。有27例患兒MLPA檢測(cè)結(jié)果呈陰性，可能是由于DMD基因發(fā)生了探針識(shí)別序列以外的微小改變，而MLPA技術(shù)的檢測(cè)局限性使其不能檢出基因點(diǎn)突變［14-15］，對(duì)這一部分患兒建議通過(guò)測(cè)序進(jìn)行微小突變篩查，本研究中8例接受了基因測(cè)序檢查，其中6例檢出突變。

DMD/BMD基因診斷準(zhǔn)確可靠，可明確致病基因，為遺傳咨詢與未來(lái)可能的基因治療提供了依據(jù)，但因其費(fèi)用昂貴及設(shè)備技術(shù)要求高等原因限制了其在臨床上的應(yīng)用。本研究中ROC結(jié)果表明，CK ＞2 178.85 U/L、CK?MB ＞121.89 U/L時(shí)對(duì)基因診斷陽(yáng)性具有較高的預(yù)測(cè)能力，兩者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)臨床診斷為DMD/BMD的患兒預(yù)測(cè)基因診斷陽(yáng)性的曲線下面積為0.79，靈敏度0.84，特異度0.62，且血清酶學(xué)檢測(cè)對(duì)DMD/BMD篩查具有簡(jiǎn)便快速、經(jīng)濟(jì)可行、依從性好的優(yōu)點(diǎn)，尤其在基層醫(yī)院極具應(yīng)用價(jià)值，有利于減輕患兒家屬經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)并協(xié)助臨床醫(yī)師正確選擇診治方案。本研究的不足之處在于，仍有19例MLPA檢測(cè)結(jié)果呈陰性的患兒因未接受基因測(cè)序檢查而未能明確診斷，可能導(dǎo)致研究結(jié)果分析存在一定偏差，有待進(jìn)一步的深入研究。