煙霧吸入后不同時(shí)間點(diǎn)SD大鼠肺損傷指標(biāo)及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化趨勢(shì)

程浩 宋立成 陳旭昕 奐劍波 陳麗娜 樊重陽 于丹丹 孟激光 韓志海

1安徽醫(yī)科大學(xué)海軍臨床學(xué)院（北京 100048）；2海軍總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科（北京 100048）

煙霧吸入性肺損傷（smoke inhalation induced acute lung injury，SMI?ALI）是指熱空氣、蒸汽、煙霧、有害氣體、揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)等致傷因素和其中某些物質(zhì)中的化學(xué)成分被人體吸入所造成的呼吸道和肺實(shí)質(zhì)的損傷。若進(jìn)一步發(fā)展，則可能進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。有研究表明，火災(zāi)后單純因燒傷而死亡的病死率低于10%，但是若合并煙霧吸入性損傷，則病死率將增至60%～80%。同時(shí)數(shù)據(jù)顯示，氧化應(yīng)激在煙霧吸入性肺損傷機(jī)制中起著重要作用。在煙霧吸入刺激后，機(jī)體產(chǎn)生過量活性氧自由基（ROS）及活性氮自由基（NOS）。消耗大量保護(hù)性還原酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等，造成機(jī)體損傷加重［1］。銜接蛋白P66Shc是新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞氧化應(yīng)激關(guān)鍵蛋白，由原癌基因ShcA編碼，初步發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)和調(diào)控生命周期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，進(jìn)來較多研究發(fā)現(xiàn)該蛋白在氧化應(yīng)激中占據(jù)重要地位［2］；但是在煙霧吸入性肺損傷中變化趨勢(shì)尚不明確。因此，本課題組于2017年11月至2018年4月通過建立大鼠煙霧吸入性肺損傷模型，觀察煙霧吸入后P66Shc及相關(guān)氧化還原指標(biāo)（SOD、MDA）的變化趨勢(shì)，進(jìn)一步明確銜接蛋白P66Shc在煙霧吸入性肺損傷中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 50只體重為（200±10）g，8周齡健康成年雄性SD大鼠（由海軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。許可證號(hào)：SYXK（軍）2012-0011）。隨機(jī)分為5組，分別為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組；實(shí)驗(yàn)組包括：煙霧吸入后1 h組、煙霧吸入后6 h組、煙霧吸入后12 h組，煙霧吸入后24 h組，每組10只。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過海軍總醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器 自制產(chǎn)煙箱、集煙箱（產(chǎn)煙箱與集煙箱用管道聯(lián)通，產(chǎn)煙箱一側(cè)有排風(fēng)扇）、產(chǎn)煙用電磁爐、泵吸式四合一氣體檢測(cè)儀（BW，型號(hào)：GASALERTMICROCLIP XT）、動(dòng)脈血?dú)夥治鰞x（德國西門子公司）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑 SOD試劑盒和MDA試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所；Anti?SHC抗體［EP332Y］和 Anti?SHC（phospho S36）抗體［6E10］均購自于英國abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立 選用室內(nèi)火災(zāi)中常見的易燃材料發(fā)泡橡塑絕熱制品、阻尼材料、電纜線、硅丙乳膠漆等混合材料作為產(chǎn)煙材料。將各種產(chǎn)煙材料（各10 g）粉碎后充分混勻置于產(chǎn)煙箱中的電磁爐托盤上，封閉產(chǎn)煙箱，將電磁爐通電，加熱維持爐絲溫度300℃。待煙霧充滿產(chǎn)煙箱后，打開排風(fēng)扇將煙霧吹向集煙箱中，監(jiān)測(cè)集煙箱中氣體成分及濃度，利用排風(fēng)扇控制集煙箱中CO：300～500 ppm，H2S：10～15 ppm，O2：20%～21.9%。將實(shí)驗(yàn)組SD大鼠置于集煙箱中，封閉集煙箱，穩(wěn)定吸入25 min。25 min后將實(shí)驗(yàn)大鼠移出煙霧環(huán)境置于正常環(huán)境，觀察大鼠呼吸、心率等生命體征以及精神狀態(tài)，記錄實(shí)驗(yàn)大鼠病死率。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理 實(shí)驗(yàn)組大鼠在煙霧吸入后按各自時(shí)間點(diǎn)腹腔注射戊巴比妥（30 mg/kg）麻醉后解剖，對(duì)照組大鼠與試驗(yàn)箱中吸入空氣25 min直接經(jīng)戊巴比妥麻醉后解剖

1.3.3 動(dòng)脈血?dú)夥治?大鼠麻醉后開腹，經(jīng)腹主動(dòng)脈抽取動(dòng)脈血1 mL，立即行動(dòng)脈血?dú)夥治?，檢測(cè)動(dòng)脈血PH、PaO2、PaCO2。

1.3.4 濕干比（W/D） 檢測(cè)動(dòng)脈血采集完畢后放血處死大鼠，開胸后將肺組織離體結(jié)扎左肺，完畢后分離右肺各葉，其中右肺上葉稱重后置于60℃恒溫箱中烘干至質(zhì)量不再改變后再稱重，檢測(cè)其濕干比（W/D）。

1.3.5 肺組織勻漿中SOD、MDA的檢測(cè) 將取出的右肺中葉研磨制成肺組織勻漿，分別依照試劑盒說明書操作檢測(cè)肺組織勻漿中SOD、MDA兩種氧化應(yīng)激指標(biāo)。

1.3.6 Western Blot方法檢測(cè)肺組織勻漿中P66Shc及磷酸化P66Shc蛋白表達(dá)情況 取0.1 g肺組織與1 mL裂解液混合后研磨制成肺組織勻漿，應(yīng)用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，隨后按lodding buffer：肺組織勻漿液=1∶3比例制成蛋白樣本，加樣后于10%的丙烯酰胺凝膠分離蛋白，60 mA濕轉(zhuǎn)3 h至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉1 h，適量稀釋比例的一抗P66Shc（Abcam 英國 1∶1 000）、磷酸化P66Shc（Ab?cam 英國 1∶1 000）、GAPDH（Cell Signaling Technol?ogy美國 1∶1 000），4℃孵育過夜，1×TBST洗膜3次，二抗室溫孵育（Abcam 英國 1∶10 000）1 h，1×TBST洗膜3次，ECL化學(xué)顯影，運(yùn)用Image J軟件對(duì)Western Blot結(jié)果行半定量灰度值分析。

1.3.7 肺組織病理觀察 將取出的右肺下葉迅速放入4%多聚甲醛溶液中固定，24 h后進(jìn)行石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，PH、PaO2、PaCO2、SOD、MDA等計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。若方差齊，多組間計(jì)量資料采用單因素方差分析（one?way ANOVA），組間比較采用LSD檢驗(yàn)。若方差不齊，組間則采用Dunnett T3檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠精神狀態(tài)及病死率 煙霧吸入后1 h內(nèi)，可見實(shí)驗(yàn)大鼠出現(xiàn)呼吸深快，心率明顯增快，并且口鼻部滿布黑色煙霧顆粒。其中7只大鼠出現(xiàn)煩躁不安，12只大鼠精神萎靡；其余大鼠精神狀態(tài)一般。其中在移出煙霧環(huán)境后1 min～1 h內(nèi)病死率2.5%（1/40）；1～6 h內(nèi)病死率6.7%（2/30）；6～12 h內(nèi)死亡率15%（3/20）；12～24 h內(nèi)病死率11%（1/9），對(duì)照組10只無死亡。

2.2 血?dú)夥治鼋Y(jié)果 煙霧吸入后，動(dòng)脈血PaO2明顯下降（P＜0.001），其中在吸入后1 h降至最低，隨后，PaO2逐漸恢復(fù)。PH值在煙霧吸入后與對(duì)照組相比，在1、24 h組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而在吸入后6 h組及12 h組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。PaCO2僅在煙霧吸入后1 h組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在吸入后6、12、24 h組均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果Tab.1 Arterial blood gas analysis results in each group of rats x±s

2.3 濕干比（W/D）結(jié)果 煙霧吸入后，大鼠肺組織濕質(zhì)量與干質(zhì)量比值（W/D）明顯升高；煙霧吸入后1、6、12以及24 h組與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中在煙霧吸入1 h后W/D值達(dá)到最高，后隨著時(shí)間進(jìn)展，有所下降，在煙霧吸入后6、12和24 h之間，肺組織W/D值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 MDA、SOD結(jié)果 煙霧吸入后，大鼠肺組織勻漿中MDA明顯上升（P＜0.05）。與對(duì)照組相比煙霧吸入后1、6、12 h MDA濃度逐漸增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在吸入后24 h時(shí)，MDA濃度有所下降。但仍然高于對(duì)照組。煙霧吸入后，大鼠肺組織勻漿中SOD活力明顯下降（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，煙霧吸入后1、6、12、24 h SOD活力均有所下降，其中在吸入后12 h組，SOD活力降至最低。吸入后12 h組與吸入后24 h組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同組別大鼠肺組織W/D、SOD及MDA結(jié)果Tab.2 Lung tissue W/D，SOD and MDA results in each group x±s

2.5 銜接蛋白P66Shc及磷酸化P66Shc表達(dá)情況 Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，煙霧吸入后銜接蛋白P66Shc以及磷酸化P66Shc的表達(dá)量明顯上升，其中以吸入后12 h和24 h表達(dá)量最多。見圖1。Image J灰度值分析結(jié)果如圖2，與對(duì)照組相比，煙霧吸入后，磷酸化P66Shc與P66shc比值有所上升，在煙霧吸入后12 h組，磷酸化P66Shc所占比例最高（2.95±0.16），與對(duì)照組（1.10±0.05）相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠肺組織P66Shc以及P?P66Shc蛋白表達(dá)情況Fig.1 The expression of P66Shc and P?P66Shc protein in lung tissue of rats in each group

圖2 各組P?P66Shc/P66Shc灰度值比值結(jié)果Fig.2 P?P66Shc/P66Shc grayscale valueratio results for each group

2.6 肺組織病理 對(duì)照組大鼠右肺下葉肺泡結(jié)構(gòu)完整，煙霧吸入后不同時(shí)間點(diǎn)肺泡結(jié)構(gòu)均有不同程度損傷，肺泡間隔與肺泡腔有炎性細(xì)胞浸潤并伴有粉紅色滲出物。其中煙霧吸入后12 h組，肺泡壁增厚，肺泡結(jié)構(gòu)破壞最為嚴(yán)重。見圖3。

3 討論

目前，有相關(guān)研究表明，火災(zāi)中致人死亡的首要原因是煙霧吸入［3］。其中，氧化應(yīng)激在煙霧吸入性肺損傷中也占據(jù)著主導(dǎo)作用。煙霧吸入后，機(jī)體通過NF?κB等信號(hào)通路使肺組織ROS表達(dá)急劇增加［4］，過多的ROS一方面可與肺組織細(xì)胞膜結(jié)合發(fā)生過氧化反應(yīng)，最終形成對(duì)細(xì)胞有毒害作用的過氧化產(chǎn)物MDA［5］，因此MDA可作為機(jī)體氧化應(yīng)激強(qiáng)度大小的指標(biāo)。另一方面，ROS的急劇增加會(huì)大量消耗體內(nèi)抗氧化酶SOD，使得機(jī)體肺組織SOD活性急劇下降。SOD活性下降，機(jī)體無法及時(shí)清除自身所產(chǎn)生的ROS，進(jìn)一步加重氧化應(yīng)激損傷［6］。P66Shc是一種具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激功能的蛋白，目前研究認(rèn)為，P66Shc調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平主要通過兩種方式，一是直接增加細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生；二是減弱細(xì)胞對(duì)ROS的清除能力。正常情況下，P66Shc處于失活狀態(tài)，主要定位于細(xì)胞胞漿，小部分（10%～40%）與線粒體熱休克蛋白70結(jié)合，存在于線粒體膜間隙［2］。在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑刺激下，使細(xì)胞內(nèi)的P66Shc表達(dá)升高，同時(shí)激活蛋白激酶C（PKCβ）、p53等引起P66Shc磷酸化，而被脯氨酰異構(gòu)酶（Pin1）識(shí)別發(fā)生構(gòu)象改變，并在蛋白磷酸酶2A（PP2A）的作用下發(fā)生去磷酸化，并轉(zhuǎn)移至線粒體中；同時(shí)刺激使線粒體P66Shc單體從復(fù)合體中釋放出來，與轉(zhuǎn)移至線粒體中的P66Shc共同發(fā)揮氧化還原酶的活性。在線粒體呼吸中，電子從復(fù)合體Ⅰ、復(fù)合體Ⅱ傳遞至輔酶Q再傳遞至復(fù)合體Ⅲ，通過細(xì)胞色素C傳遞至復(fù)合體Ⅳ生成水，而單體化的P66Shc則氧化細(xì)胞色素C，使電子不能順利傳遞至復(fù)合體Ⅳ形成H2O，而是形成ROS（H2O2），ROS 水平升高引起細(xì)胞氧化損傷，并導(dǎo)致線粒體滲透性孔道通透性改變。此外，磷酸化的P66Shc抑制AKT依賴的叉頭轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a，即FKHRL?1，使SOD生成減少，細(xì)胞對(duì)ROS的清除能力下降［7-9］。因此，本研究以動(dòng)脈血?dú)夥治觯≒aO2、PaCO2、PH）、肺組織濕干比（W/D）、以及光鏡下肺組織病理學(xué)特點(diǎn)為指標(biāo)對(duì)煙霧吸入性肺損傷模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。以SOD、MDA活性大小以及銜接蛋白P66Shc表達(dá)量多少反映煙霧吸入后機(jī)體氧化應(yīng)激程度的大小。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)煙霧吸入后PaO2迅速下降，在吸入后1 h組達(dá)到最低值并小于60 mmHg，若FiO2按21%計(jì)算，則此時(shí)PaO2/FiO2＜300，符合最新關(guān)于ARDS診斷標(biāo)準(zhǔn)的輕度ARDS。在隨后的時(shí)間點(diǎn)內(nèi)PaO2逐漸上升，因此，在煙霧吸入1 h內(nèi)，最重要損傷因素為急性缺氧。此結(jié)果與其他煙霧損傷模型類似［10］。并且，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)煙霧吸入后，大鼠肺組織W/D明顯上升，在吸入后1 h組達(dá)到最高值，此后有所降低，但仍未恢復(fù)至對(duì)照組水平，可能原因?yàn)闊熿F吸入后1 h內(nèi)急性缺氧嚴(yán)重，加快大鼠呼吸頻率，并且由于煙霧刺激，肺組織滲出急劇增多，而在后續(xù)時(shí)間內(nèi)，大鼠缺氧狀態(tài)逐漸緩解，同時(shí)脫離了煙霧刺激，滲出逐漸減少。觀察本實(shí)驗(yàn)肺病理切片，可見煙霧吸入后，光鏡下表現(xiàn)為肺泡壁間隔增厚，炎性細(xì)胞浸潤并伴有粉紅色滲出物，尤以吸入后12 h組表現(xiàn)最為嚴(yán)重，部分肺泡間隔斷裂，肺泡可見明顯出血。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，煙霧吸入后，肺組織勻漿中MDA濃度隨著時(shí)間進(jìn)展逐漸上升，在吸入后12 h組達(dá)到最高峰，隨后MDA濃度開始下降，至吸入后24 h組，仍明顯高于對(duì)照組。SOD活力在煙霧吸入后逐漸降低，在吸入后12 h組降至最低。該結(jié)果說明煙霧吸入后，實(shí)驗(yàn)大鼠氧化應(yīng)激加強(qiáng)，機(jī)體隨之需消耗大量清除ROS的活性酶，造成抗氧化能力下降。并且，在煙霧吸入后12～24 h內(nèi)為機(jī)體氧化應(yīng)激最為嚴(yán)重時(shí)段。

研究證實(shí)P66Shc在肺泡上皮細(xì)胞系中存在表達(dá)，且PKCβ/P66Shc信號(hào)通路介導(dǎo)了高氧誘導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞凋亡［11］。研究證實(shí)P66Shc基因缺失小鼠成纖維細(xì)胞受到紫外線、無血清及過氧化氫刺激后細(xì)胞內(nèi)ROS水平較野生型成纖維細(xì)胞顯著下降，而過表達(dá)P66Shc基因的成纖維細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)性則明顯增強(qiáng)。P66Shc基因缺失的內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，其細(xì)胞內(nèi)的ROS水平和DNA的氧化損傷明顯降低，而將P66Shc全長基因轉(zhuǎn)染至不表達(dá)P66Shc的細(xì)胞中，其對(duì)于氧化應(yīng)激敏感性增強(qiáng)［12-13］。本實(shí)驗(yàn)顯示，煙霧吸入后大鼠肺組織P66Shc及磷酸化P66Shc蛋白表達(dá)量遠(yuǎn)高于正常對(duì)照組，并在吸入后12和24 h組表達(dá)增加最為顯著，煙霧吸入后磷酸化P66Shc蛋白與P66Shc比值增加，在煙霧吸入后12 h組達(dá)到最高峰，此結(jié)果表明銜接蛋白P66shc在煙霧吸入后磷酸化增多，活化增多，進(jìn)一步說明煙霧吸入后氧化應(yīng)激加強(qiáng)并在吸入后12 h氧化應(yīng)激最強(qiáng)。既往研究顯示P66Shc的表達(dá)增多會(huì)激活PKC/P66Shc信號(hào)通路進(jìn)而消耗更多的SOD［14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)銜接蛋白P66Shc磷酸化活化達(dá)到最高峰時(shí)SOD活力則降至最低?？赡苁且?yàn)镻66Shc激活了PKC/P66Shc信號(hào)通路，因此消耗了更多的SOD，加重機(jī)體氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，煙霧吸入后，機(jī)體尤其是肺組織氧化應(yīng)激明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)為MDA的明顯上升、SOD的明顯下降、P66Shc的表達(dá)增加以及該蛋白磷酸化增強(qiáng)。并且在吸入后12 h以及24 h氧化應(yīng)激達(dá)到高峰。