關(guān)于異型南五味子總?cè)茖︻愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠抗炎靶點干預(yù)的研究

【摘 要】目的：探討異型南五味子總?cè)茖︻愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的抗炎效果、抗炎靶點和藥物的作用機理。方法：將造模成功的膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠100只隨機分為模型對照組，甲氨蝶呤組，南五味子高、中、低劑量組，每組20只。通過觀察CIA大鼠不同時間足趾腫脹容積程度，血清免疫球蛋白M（IgM）、IgM2RF、γ-干擾素（IFN-γ）水平改變，大鼠關(guān)節(jié)滑膜基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）、MMP-3表達情況。結(jié)果：在改善CIA大鼠足趾腫脹容積方面，甲氨蝶呤組、南五味子各劑量組12，15，30 d與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；給藥15，30 d，南五味子高劑量組與甲氨蝶呤組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意

義（P > 0.05）。大鼠血清中IgM、IgM2RF、IFN-γ含量比較，南五味子高、中劑量組較模型對照組均有顯著抑制作用（P < 0.01），且高劑量組較甲氨蝶呤組對IgM、IgM2RF抑制差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），低劑量組這3個指標有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。在大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織MMPs表達中，異型南五味子高、中、低劑量組均能顯著抑制該蛋白高表達，與模型對照組和甲氨蝶呤組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。結(jié)論：異型南五味子各劑量對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎急性炎癥期大鼠組織腫脹疼痛均有顯著的緩解作用，且對炎性模型血清炎性細胞免疫因子和組織滑膜致炎蛋白酶有抑制效果，據(jù)此推測該藥可能是通過阻斷MMPs高表達抑制炎性因子及病情進展。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；異型南五味子；抗炎；基質(zhì)金屬蛋白酶；組織滑膜液；大鼠

Study on the Interference of Total Triterpenes of Heterogenous Schisandra on Anti-Inflammatory Target

in Rats with Rheumatoid Arthritis

Deng Ming

【ABSTRACT】Objective：Discuss the anti-inflammatory effect and target of total three terpenes of fructus schisandrae chinensis on rheumatoid arthritis，and to infer the possible mechanism of the drug.Methods：

One hundred CIA rats were randomLy divided into 5 groups，including model control group，methotrexate group，and South Schisandra group（high，medium，and low dose），20 rats in each group.The degree of swelling volume of the toes at different times after inflammation was observed.Serum IgM，IgMRF，IFN-γ level changes，CIA rat synovial MMP-1，MMP-3 expression of anti-triterpenoids and total anti-triterpenoids.Results：In improving the swelling volume of the CIA rat toes，the difference was statistically significant between 12，15，30 d

in each dose group and model control group（P < 0.01）.There was no significant difference between 15，30 d in the high dose group of South Schisandra and the methotrexate group（P > 0.05）.For the comparison of IgM，IgMRF，and IFN-γ in rats serum，the high and medium dose of Schisandra were significantly inhibited compared with the model control group（P < 0.01），and the

high dose group compared with the methotrexate group was significantly（P < 0.01）.while the low dose group had a decrease in these three indicators，but there was no statistical difference（P > 0.05）.In the expression of MMPs in rat joint synovial tissue，the high expression of the protein was significantly inhibited in the three groups of South Schisandra，which was statistically significant compared with the model control group and the methotrexate group（P < 0.05）.Conclusion：Different dose groups of special-shaped South Schisandra had significant effects on the swelling and pain in acute inflammatory stage of rheumatoid arthritis，It also has inhibitory effect on inflammatory cytoimmune factor and synovial protease in serum of inflammatory model.It is assumed that the drug maybe by blocking the high expression inhibition factor of MMPs to achieve the progress of inhibition.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid；heterotype south schisandra；inflammatory；matrix metalloproteinase；tissue synovial fluid；rats

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性結(jié)締組織病，是免疫系統(tǒng)異常引起的多關(guān)節(jié)滑膜炎癥、增生，進而血管翳生成、骨質(zhì)破壞，造成關(guān)節(jié)畸形和功能障礙[1]。我國RA發(fā)病率呈逐漸增高趨勢，未經(jīng)過正規(guī)治療的患者致殘率高，病死率是一般人群的1.5～1.6倍[2]。因其難以根治、病程長、并發(fā)癥多、致殘率高等[3]，給患者及家屬帶來沉重的精神和經(jīng)濟負擔(dān)。目前臨床上治療本病常用的部分西藥和中成藥長期服用后容易出現(xiàn)骨質(zhì)疏松、胃腸道刺激等不良反應(yīng)，且大多數(shù)患者需要多種藥物聯(lián)合使用才能控制病情，因此更加重藥物相互的不良反應(yīng)，研發(fā)低毒性、高效能的植物類抗風(fēng)濕藥物成為新的研究方向。異型南五味子總?cè)剖菑V州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院多年研究的民間常用的特色藥物，在前期研究中發(fā)現(xiàn)該藥對動物模型有較好的鎮(zhèn)痛效果[4]，以及較少的不良反應(yīng)[5]，本研究繼續(xù)觀察該藥物對RA的抗炎效果以及作用靶點，現(xiàn)將結(jié)果總結(jié)報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級健康SD大鼠130只，其中雌性65只，體質(zhì)量（120±25）g，雄性65只，體質(zhì)量（118±23）g。動物來源為廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：SCXK-（粵）2016-0001。所有大鼠在實驗前均常規(guī)馴養(yǎng)1周，正常進食進水，自由活動，動物房溫度和濕度分別保持在20 ℃和70%。

1.2 實驗藥物 由廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院制劑室提供，異型南五味子藤莖采于粵北山區(qū)，采用蒸餾提純濃縮法制成提取物總?cè)平鄠溆?，藥液濃度與原藥材比重為1∶2。

1.3 主要儀器及材料 DHP9272電熱恒溫培養(yǎng)箱（深圳右一儀器公司）；實驗全自動酶標儀（上海拜格生物有限公司）；牛Ⅱ型膠原（北京柏雷德生物公司）；大鼠免疫球蛋白M（IgM）、IgM2RF、γ-干擾素（IFN-γ）、基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）、MMP-3試劑盒（上海軒轅醫(yī)療科技有限公司）；甲氨蝶呤片（上海上藥信誼藥廠有限公司，生產(chǎn)批號036171101，規(guī)格2.5 mg）。

1.4 造模和分組 選取120只SD大鼠按照造模方法建造CIA模型，再取10只為正常對照組。造模方法參照文獻[6]：將溶于醋酸的牛Ⅱ型膠原2 mg·mL-1與完全弗式佐劑1∶1等比混合成乳液，冰浴下充分乳化，制成Ⅱ型膠原乳劑。每只受試大鼠尾巴根部皮下注射上述乳劑0.1 mL，3周后再按上法注射1次，建立CIA模型。正常對照組按照等體積生理鹽水注射。采用關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）作為判斷標準：0分為正常，1分為趾關(guān)節(jié)稍有腫脹，

2分為趾關(guān)節(jié)及足趾關(guān)節(jié)腫脹，3分為踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹，4分為包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)足爪全部腫脹且嚴重變形。AI值等于四肢關(guān)節(jié)腫脹積分和，> 4分表示造模成功。本實驗造模成功率是85%。正常對照組作為關(guān)節(jié)炎指數(shù)參照（0分標準）。

成功造模后取100只大鼠依照隨機數(shù)字表法分為模型對照組，甲氨蝶呤組，南五味子高、中、低劑量組，每組20只，雌雄各半。

1.5 給藥方法 上述5組按照固定劑量灌胃給藥，其中模型對照組灌服質(zhì)量分數(shù)為0.9%的生理鹽水1 mL·kg-1·d-1，甲氨蝶呤組灌服甲氨蝶呤片

0.9 mg·kg-1，每周1次，南五味子高、中、低劑量組分別灌服南五味子提取物總?cè)平?/p>

6 mg·kg-1·d-1、3 mg·kg-1·d-1、1 mg·kg-1·d-1，

持續(xù)30 d，自由飲水和喂食物。

1.6 觀察指標 觀察并記錄各組CIA大鼠給藥后0，12，15，30 d的足趾腫脹容積變化情況，末次給藥后在大鼠腹主動脈采血，采用ELISA法檢測各組大鼠血清中IgM、IgM2RF、IFN-γ、MMP-1、MMP-3水平。處死大鼠，并取大鼠雙后足炎性踝關(guān)節(jié)，用中性甲醛溶液固定，脫鈣，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后脫蠟脫水，蘇木依細胞核染色封固切片，光學(xué)顯微鏡高倍視野鏡下觀察。參照文獻[7]對滑膜組織病理變化進行評分?；ぜ毎錾何匆姰惓?；單層密集、腫脹為輕度異常；增生成2層為中度異常；增生成3層及以上為重度異常。炎性細胞浸潤：未見異常；稀疏散在少量為輕度異常；較密集中等量中度異常；密集大量為重度異常。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 南五味子總?cè)茖Υ笫箨P(guān)節(jié)炎足趾腫脹的影響 造模后，模型對照組、甲氨蝶呤組、南五味子中劑量組（因高、中、低3劑量組圖片差異不大，選中劑量組治療后模型）大鼠足趾關(guān)節(jié)腫脹情況見圖1。給藥前5組大鼠關(guān)節(jié)無明顯差異，給藥12，15，30 d，甲氨蝶呤組，南五味子高、中、低劑量組與模型對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），

給藥15，30 d，南五味子高劑量組與甲氨蝶呤組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 5組大鼠關(guān)節(jié)滑膜MMP-1、MMP-3水平比較 南五味子高、中、低劑量組，甲氨蝶呤組與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01或

P < 0.05），南五味子高劑量組與甲氨蝶呤組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），南五味子中、低劑量組與甲氨蝶呤組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義

（P > 0.05）。見表2。

2.3 5組大鼠血清IgM、IgM2RF、IFN-γ水平比較 甲氨蝶呤組對IgM影響與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；而南五味子高、中、低劑量組分別與甲氨蝶呤組、模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05）。在對血清IgM2RF影響方面，其他4組與模型對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），南五味子高劑量組與甲氨蝶呤組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

（P < 0.05）。在對血清IFN-γ影響方面，南五味子高、中劑量組，甲氨蝶呤組與模型對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），而南五味子低劑量組

2.4 5組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理切片觀察 模型對照組CIA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織大量3層細胞增生，大量淋巴細胞浸潤，為重度異常；南五味子高劑量組與甲氨蝶呤組滑膜細胞可見滑膜上皮少量單層增生，少量散在淋巴細胞浸潤，為輕度異常；南五味子中、低劑量組可見滑膜中等量2層細胞增生，中量炎性細胞浸潤，為中度異常。見

圖2。

3 討 論

臨床中治療RA的西藥有非甾體抗炎藥、改善病情抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素、生物制劑、靶向小分子藥物等[8]，這些藥物對RA有較強的治療作用，但是與此同時，相關(guān)的不良反應(yīng)如胃腸道刺激、肝腎功能損害、誘發(fā)腫瘤、骨質(zhì)疏松、肥胖等問題層出不窮，而且大多數(shù)患者需要多種藥物聯(lián)合使用，加重藥物不良反應(yīng)的同時，也給患者及家屬帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。目前的中成藥制劑如正清風(fēng)痛寧、雷公藤多苷相對便宜，但療效有限，也會有皮疹、影響性功能等不良反應(yīng)，導(dǎo)致患者難以長期維持用藥[9]。因此，研究新型、療效確切、不良反應(yīng)少、價格適宜、患者依從性高的抗風(fēng)濕藥物形勢非常迫切。而以植物的根莖葉果為主要成分的天然中草藥治療風(fēng)濕病的研究也越來越多，既符合天人相應(yīng)、藥食同源的理念，又具有價廉效優(yōu)、不良反應(yīng)少、以人為本整體調(diào)理的特點，在風(fēng)濕病的治療領(lǐng)域獨具特色。

在治療風(fēng)濕病的中草藥研究中，一種名為血筒的少數(shù)民族藥物引起我們的關(guān)注。這種藥物在民間經(jīng)常用于治療風(fēng)寒冷痛、手足身體麻木痹痛，以及久治不愈的慢性腰腿下肢疼痛。課題組前期研究過程中走訪了粵北、湘西等多地的少數(shù)民族，得到切實的反饋，因他們祖祖輩輩居住在深山樹林或者水邊，容易感染風(fēng)邪、寒邪以及濕邪導(dǎo)致頭身困重、肢體疼痛、活動不利等，針對這些病痛，常用抗風(fēng)濕俗稱血筒、血通的草藥，經(jīng)鑒定是五味子科的異型南五味子，是中藥雞血藤的主要來源植物[10]，通常以植物的藤和莖部位入藥，性溫，味稍辛、甘，主要功效有行氣補血、通絡(luò)止痛、祛濕散寒、活血散瘀等。民間常用于治療各種風(fēng)寒濕痛以及麻木痹痛等病，異型南五味子的主要化學(xué)成分有三萜和木脂素類化合物[11]，其中主要有效成分是總?cè)祁惢衔颷12-13]。近期文獻主要是針對三萜類化合物的細胞毒活性以及抗HIV作用開展研究[14]，表明南五味子總?cè)圃诳共《尽⒖咕?、抗腫瘤、抗HIV方面均有作用[15]。中醫(yī)藥方面的研究顯示，南五味子屬植物能活血通痹、散寒止痛、行氣通絡(luò)，主治風(fēng)濕痹證、胸腹部脹痛、慢性腰腿疼痛、急慢性關(guān)節(jié)腫痛、腰肌勞損

等病。

基于該藥在民間有較好的療效以及安全性高的口碑，我們前期也對異型南五味子進行了相關(guān)的藥效和毒理學(xué)方面的研究，本項目主要研究該藥對RA的急性炎癥期模型足部腫脹的抑制效果、慢性免疫炎癥期模型體內(nèi)部分炎性細胞因子免疫因子IgM、IgM2RF、IFN-γ，以及結(jié)締組織關(guān)節(jié)液滑膜中介導(dǎo)陽性細胞因子的相關(guān)活性酶類MMPs變化情況。實驗結(jié)果證實，異形南五味子高、中、低劑量組均對RA的急性炎癥期組織腫脹疼痛有顯著的緩解作用，與甲氨蝶呤組比較，南五味子高劑量組的抑制作用稍強。對于大鼠血清中IgM、IgM2RF、IFN-γ含量，南五味子高、中劑量組較模型對照組均有顯著抑制作用（P < 0.01），且高劑量組較甲氨蝶呤組對IgM、IgM2RF抑制差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），而低劑量組這3個指標有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），可見在抑制細胞免疫方面，南五味子相對于傳統(tǒng)的免疫抑制劑有獨特的免疫調(diào)節(jié)功能，因此推測異型南五味子總?cè)瓶赡苁峭ㄟ^抑制免疫炎性因子，阻斷炎性因子介導(dǎo)的遲發(fā)型炎癥反應(yīng)，抑制關(guān)節(jié)滑膜炎的發(fā)生和關(guān)節(jié)破壞，從而起到控制RA病情發(fā)展的功效。MMPs是一種存在于結(jié)締組織中的蛋白酶大家族，通過調(diào)控生長因子、炎性因子、組織抑制因子水平[16]，從而調(diào)控整個細胞免疫網(wǎng)絡(luò)。MMPs的失衡在RA的發(fā)生、發(fā)展中尤為重要，特別是該家族中的MMP-1和MMP-3，在關(guān)節(jié)滑膜中數(shù)量增加，是滑膜炎性細胞增生、血管翳形成、關(guān)節(jié)軟骨破壞等一系列直接導(dǎo)致病情進展的重要因素，因此MMP-1和MMP-3高陽性表達的抑制對緩解疾病至關(guān)重要。通過本實驗觀察發(fā)現(xiàn)，南五味子高劑量組在抑制滑膜MMPs高表達方面比甲氨蝶呤效果顯著，而五味子中低劑量組也與甲氨蝶呤組效果相當(dāng)；大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織研究發(fā)現(xiàn)，與模型對照組比較，各治療組滑膜內(nèi)淋巴細胞等炎性細胞浸潤減少，上皮增生減輕，據(jù)此可以推測異型南五味子總?cè)瓶赡苁峭ㄟ^活性物質(zhì)抑制MMPs的高表達，從而阻止由此介導(dǎo)的細胞炎性因子和免疫應(yīng)答，減少抗原抗體復(fù)合物沉積，調(diào)控免疫網(wǎng)絡(luò)，減輕滑膜炎癥、緩解關(guān)節(jié)軟骨破壞，阻止病情發(fā)展。

綜上所述，在前期實驗證實異型南五味子總?cè)茖A動物模型有較好的急性期鎮(zhèn)痛作用的基礎(chǔ)上，本研究繼續(xù)開展南五味子總?cè)茖A的抗炎效果以及作用靶點探索。實驗證明了異型南五味子各劑量組均對RA的急性炎癥期大鼠組織腫脹疼痛有顯著的緩解作用，且與傳統(tǒng)的免疫抑制劑比較，對動物模型血清以及組織細胞炎性細胞免疫因子和致炎蛋白酶抑制效果較強，據(jù)此推測該藥可能是通過阻斷MMPs高表達，從而抑制炎性因子達到控制疾病進展的目的，下一步研究將進行其他部分相關(guān)指標觀測以及人體關(guān)節(jié)滑膜液體外實驗，確定異型南五味子總?cè)茖A的作用機制以及作用靶點是否與本研究類似，同時也為這種具有較好抗風(fēng)濕療效的純植物藥物的研發(fā)使用奠定基礎(chǔ)。

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收稿日期：2018-06-09；修回日期：2018-07-01