毛細(xì)管電泳法分析無(wú)機(jī)陰離子實(shí)驗(yàn)教學(xué)的設(shè)計(jì)與探討

劉慧青，徐中其

(東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620)

近年來(lái)，我校(東華大學(xué))基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中心得到上海市化學(xué)學(xué)科建設(shè)資金資助，相繼購(gòu)置了一批大型分析儀器，建立了精密儀器平臺(tái)，旨在推動(dòng)新型儀器分析實(shí)驗(yàn)改革，提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)水平。分析化學(xué)教研室積極開展“儀器分析”課程的教學(xué)研究與改革，以激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，提高學(xué)生綜合運(yùn)用知識(shí)能力和創(chuàng)新能力。

一、 水質(zhì)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的教學(xué)現(xiàn)狀

“儀器分析”作為我?；瘜W(xué)化工與生物工程學(xué)院開設(shè)的一門專業(yè)基礎(chǔ)課，具有很強(qiáng)的應(yīng)用性和實(shí)踐性。根據(jù)應(yīng)用化學(xué)、生物工程等專業(yè)人才培養(yǎng)的要求，將“儀器分析”實(shí)驗(yàn)課程分為幾大教學(xué)模塊，水質(zhì)檢測(cè)為其中之一。它是以分析與測(cè)定環(huán)境水樣中某些成分含量為目的，通過(guò)水質(zhì)分析技術(shù)了解環(huán)境水質(zhì)情況，為監(jiān)督和控制水質(zhì)質(zhì)量提供依據(jù)。水質(zhì)檢測(cè)方法很多，根據(jù)常規(guī)水質(zhì)檢測(cè)項(xiàng)目，分為物理性質(zhì)測(cè)定、金屬化合物測(cè)定、非金屬無(wú)機(jī)化合物測(cè)定和有機(jī)化合物測(cè)定[1]。在“儀器分析”實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，水質(zhì)檢測(cè)模塊安排了3個(gè)實(shí)驗(yàn)，分別為原子吸收光譜法測(cè)定水中的鈣、鎂含量——標(biāo)準(zhǔn)曲線法[2]，鉬酸銨分光光度法測(cè)定水中總磷[3]，離子色譜法測(cè)定水樣中的無(wú)機(jī)陰離子含量[4]。

二、 教學(xué)改革的目的、意義及設(shè)計(jì)

環(huán)境水樣的無(wú)機(jī)陰離子測(cè)定通常采用傳統(tǒng)的離子色譜法[5-6]。離子色譜法(IC)存在樣品分析時(shí)間長(zhǎng)、準(zhǔn)備工作量大、僅適用于低濃度試樣、分離效率低和色譜峰形差等缺點(diǎn)。針對(duì)離子色譜法存在的不足，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一種快速、操作簡(jiǎn)便、試劑消耗少、柱效高的檢測(cè)方法——毛細(xì)管電泳法(CE)。與離子色譜法相比，毛細(xì)管電泳法具有更高的分辨能力和分離效率[7]。另外，離子色譜法與“儀器分析”實(shí)驗(yàn)中常用的反相高效液相色譜法的實(shí)驗(yàn)原理、基本概念、儀器結(jié)構(gòu)和操作方法相似，而毛細(xì)管電泳法則是在傳統(tǒng)電泳和高效液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型高效分離技術(shù)，使分析科學(xué)從微升級(jí)進(jìn)入到了納升級(jí)水平[8]。隨著近幾年毛細(xì)管電泳法在生物醫(yī)藥、環(huán)境化學(xué)、農(nóng)學(xué)和食品分析等應(yīng)用領(lǐng)域的快速發(fā)展和深入，越來(lái)越多的企業(yè)選用毛細(xì)管電泳儀作為分離分析工具。因此，本教學(xué)改革不僅能縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間、節(jié)約試劑用量和提高分離效率，而且能將毛細(xì)管電泳法引入本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，讓學(xué)生能夠掌握更多的知識(shí)和技能，主動(dòng)適應(yīng)企業(yè)需求，提升學(xué)生就業(yè)能力。

本實(shí)驗(yàn)的目的是讓學(xué)生理解毛細(xì)管電泳的基本原理，熟悉毛細(xì)管電泳儀的構(gòu)成，了解影響毛細(xì)管電泳法分離的主要操作參數(shù)。因此，將對(duì)電泳的背景電解質(zhì)(BGE)、有機(jī)添加劑、分離電壓、電滲流改性劑和pH值分別進(jìn)行討論，讓學(xué)生自主選出合適的毛細(xì)管電泳條件。對(duì)于自主選擇色譜條件，最初學(xué)生還是有一定的畏難情緒。通過(guò)改變毛細(xì)管電泳法條件的分離參數(shù)，讓學(xué)生直觀感知到色譜圖的變化，從而更加容易和深入地掌握相關(guān)的理論知識(shí)。學(xué)生采用自主選擇的優(yōu)化條件，對(duì)校內(nèi)湖水和實(shí)驗(yàn)室未知水樣進(jìn)行定量分析。這種教學(xué)模式極大地促進(jìn)了學(xué)生對(duì)“儀器分析”實(shí)驗(yàn)課程學(xué)習(xí)的主動(dòng)性和積極性，培養(yǎng)了學(xué)生的創(chuàng)新能力和科研能力。

三、 水質(zhì)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)基本內(nèi)容

水質(zhì)檢測(cè)是大二第一學(xué)期“儀器分析”課程中水質(zhì)分析設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，4學(xué)時(shí)。對(duì)于本科生實(shí)驗(yàn)教學(xué)，考察間接吸收背景物質(zhì)、有機(jī)添加劑和分離電壓對(duì)無(wú)機(jī)陰離子的毛細(xì)管電泳分離的影響。而研究生的水質(zhì)分析設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)為8學(xué)時(shí)，在本科生的無(wú)機(jī)陰離子毛細(xì)管電泳分析的基礎(chǔ)上拓展部分內(nèi)容，即討論電滲流改性劑和緩沖溶液pH值對(duì)分離的影響。

1. 儀器與試劑

P/ACE MDQ型毛細(xì)管電泳儀，彈性石英毛細(xì)管柱(60 cm×75 μm，有效長(zhǎng)度50 cm)。十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、鉻酸鉀(K2CrO4)、丙三醇、乙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

陰離子標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱取適量的NaF、NaCl、Na2SO4、KBr和KNO3，用超純水定容配成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。實(shí)驗(yàn)時(shí)將儲(chǔ)備液稀釋到所需濃度。

2. 實(shí)驗(yàn)方法

配制一定濃度的鉻酸鉀溶液作背景電解質(zhì)，實(shí)驗(yàn)前用超聲波脫氣。每次進(jìn)樣前毛細(xì)管依次用超純水和電解質(zhì)溶液沖洗，每進(jìn)樣4次需更換新鮮電解質(zhì)溶液。采用壓力進(jìn)樣，毛細(xì)管溫度控制為25 ℃。

3. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程與分析討論

(1) 背景電解質(zhì)對(duì)電泳行為的影響。紫外光度檢測(cè)器是毛細(xì)管電泳法最廣泛使用的檢測(cè)器，它具有靈敏度高、響應(yīng)速度快、高溫穩(wěn)定性優(yōu)和價(jià)格實(shí)惠等優(yōu)勢(shì)。然而，大部分無(wú)機(jī)離子沒(méi)有或只有很低的紫外吸收，如何用紫外光度檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)？我們采用含強(qiáng)紫外吸收的物質(zhì)作為背景電解質(zhì)，當(dāng)它通過(guò)檢測(cè)器窗口時(shí)，出現(xiàn)較大的背景吸收。當(dāng)無(wú)機(jī)陰離子通過(guò)紫外檢測(cè)窗口時(shí)，陰離子代替背景電解質(zhì)降低了背景吸光度值，出現(xiàn)色譜峰從而達(dá)到檢測(cè)的目的。傅小蕓等[9-11]考察了多種類型背景電解質(zhì)對(duì)陰離子分離的影響，發(fā)現(xiàn)鉻酸根較適合作為背景電解質(zhì)來(lái)分離遷移率大的無(wú)機(jī)陰離子。鉻酸根濃度的大小對(duì)檢測(cè)靈敏度、陰離子的遷移時(shí)間和分離具有一定的影響。本實(shí)驗(yàn)中學(xué)生通過(guò)考察K2CrO4濃度為1.0～10 mmol/L時(shí)，濃度變化對(duì)遷移時(shí)間和分離效率的影響，然后學(xué)生自主選擇出鉻酸根的最佳濃度。當(dāng)背景電解質(zhì)為5.0 mmol/L左右的鉻酸根時(shí)，分離度最佳。

(2) 有機(jī)添加劑的影響。在毛細(xì)管電泳的電解質(zhì)體系中加入有機(jī)溶劑，能降低電解質(zhì)溶液的介電常數(shù)，從而降低電滲流，延長(zhǎng)分析時(shí)間，改善分離。本實(shí)驗(yàn)考察在1.0 mmol/L CTAB+5 mmol/L K2CrO4的緩沖溶液中，有、無(wú)添加混合有機(jī)溶劑對(duì)分離度的影響。在無(wú)添加有機(jī)溶劑的條件下，Br-和Cl-嚴(yán)重地重疊(圖1中曲線A)，未能實(shí)現(xiàn)分離；僅添加一定量的乙醇或丙三醇，5種陰離子也不能完全基線分離；在添加混合有機(jī)物3%丙三醇和10%乙醇時(shí)，Br-和Cl-得到較好分離度，5種陰離子組分在6.0 min內(nèi)達(dá)基線分離(圖1中曲線B)。

圖1 5種陰離子在無(wú)有機(jī)溶劑(A)和添加有機(jī)溶劑(B)條件下的電泳譜圖對(duì)比峰序：緩沖體系：1.0 mmol/L CTAB+5 mmol/L K2CrO4(pH=8.4)；分離電壓：-20 kV；樣品壓力進(jìn)樣0.5 psi×10 s；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm

圖2 分離電壓對(duì)出峰時(shí)間的影響緩沖體系：1.0 mmol/L CTAB+5 mmol/L K2CrO4(pH=8.4)+體積分?jǐn)?shù)3%丙三醇+體積分?jǐn)?shù)10%乙醇；樣品壓力進(jìn)樣：0.5 psi×10 s；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm

(3) 分離電壓的影響。實(shí)驗(yàn)采用負(fù)電壓，陰極進(jìn)樣，陽(yáng)極檢測(cè)。外加電壓的改變會(huì)產(chǎn)生不同的電場(chǎng)強(qiáng)度和焦耳熱，從而影響各離子的出峰時(shí)間、峰形和分離度。一方面，隨著電壓的增大，電滲速度和陰離子的遷移速度增大，出峰時(shí)間縮短，峰形變尖，柱效和分離度提高，有利于毛細(xì)管電泳法快速分析；另一方面，過(guò)高的電壓使得毛細(xì)管內(nèi)壁產(chǎn)生過(guò)多的焦耳熱，導(dǎo)致譜峰增寬，反而降低柱效和分離度[12]。實(shí)驗(yàn)中考察了不同負(fù)電壓(-15～-25 kV)對(duì)各陰離子出峰時(shí)間、分離度及柱效的影響，讓學(xué)生繪制分離電壓-出峰時(shí)間曲線圖(見(jiàn)圖2)，并計(jì)算出不同電壓下的分離度和理論塔板數(shù)。通過(guò)理論塔板數(shù)的計(jì)算了解毛細(xì)管電泳法具有強(qiáng)大的分離效率，進(jìn)而加深對(duì)平流(電泳中電滲流的流動(dòng))和層流(液相色譜中的溶液流動(dòng))驅(qū)動(dòng)的理解。通過(guò)討論不同負(fù)電壓對(duì)出峰時(shí)間、峰形和分離度的影響，讓學(xué)生自主摸索出最佳分離電壓。一般最佳分離電壓為-20 kV，在該電壓下可獲得良好的分離效果。

圖3 校內(nèi)湖水的電泳圖峰序：緩沖體系：1.0 mmol/L CTAB+5 mmol/L K2CrO4(pH=8.4)+體積分?jǐn)?shù)3%丙三醇+體積分?jǐn)?shù)10%乙醇；樣品壓力進(jìn)樣：0.5 psi×10 s；分離電壓：-20 kV；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm

4. 實(shí)驗(yàn)拓展部分

(1) 電滲流改性劑的影響。毛細(xì)管電泳分離過(guò)程中，陰離子的電泳淌度大，且方向與電滲流相反，存在遷移時(shí)間長(zhǎng)、峰形寬、分離效率低的問(wèn)題。因此需要在電解質(zhì)溶液中加入一定量的電滲流改性劑，利用CTAB中[H4N]+對(duì)毛細(xì)管壁表面的硅醇基團(tuán)進(jìn)行屏蔽，從而改變電滲流方向，實(shí)現(xiàn)陰離子的快速分離分析效果[13-14]。本實(shí)驗(yàn)中學(xué)生可配制濃度分別為0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的CTAB，考察電滲流改性劑濃度對(duì)遷移時(shí)間、分離度的影響，從而自主選出最佳濃度的CTAB。一般采用CTAB濃度為0.5～1.0 mmol/L，完全能實(shí)現(xiàn)各離子的分離。

(2) 緩沖溶液pH值對(duì)分離的影響。毛細(xì)管電泳分離無(wú)機(jī)陰離子需在弱堿性條件下進(jìn)行，學(xué)生配制不同pH值(7.0～9.5)的緩沖溶液，考察其pH值對(duì)陰離子分離的影響，選出最合適的pH值。發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH值為7.0～8.3時(shí)，隨著pH值增大，各組分的遷移時(shí)間縮短，背景電解質(zhì)體系不穩(wěn)定，組分峰高降低，分離效率不佳；當(dāng)pH值為8.4～8.9時(shí)，pH值對(duì)遷移時(shí)間的影響很小，峰形和分離度較好；當(dāng)pH值大于9.0時(shí)，F(xiàn)-峰擴(kuò)展嚴(yán)重，分離度減小。因此一般選擇緩沖溶液的pH值為8.4～8.9。

四、 考核體系

“儀器分析”實(shí)驗(yàn)課程的考核簡(jiǎn)單地以實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為唯一評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)是不合適的，應(yīng)該更關(guān)注和重視學(xué)生在整個(gè)實(shí)驗(yàn)課程中的綜合表現(xiàn)[15-16]。實(shí)驗(yàn)成績(jī)分成三部分：(1)實(shí)驗(yàn)前期的預(yù)習(xí)(包括毛細(xì)管電泳法理論知識(shí)、儀器操作方法、實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)等)，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作的參與以及預(yù)習(xí)報(bào)告的完成情況，占20%。(2)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，包括實(shí)驗(yàn)態(tài)度、組內(nèi)合作、實(shí)驗(yàn)效率、操作能力、實(shí)驗(yàn)結(jié)果等，這部分考核是整個(gè)考核體系中的重點(diǎn)，占50%。為了能全面、公正地考核學(xué)生的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，指導(dǎo)教師需要在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)每名學(xué)生的操作進(jìn)行仔細(xì)觀察并及時(shí)糾正錯(cuò)誤操作，對(duì)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)過(guò)程考核做出準(zhǔn)確評(píng)價(jià)。(3)實(shí)驗(yàn)報(bào)告，包括實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、儀器與試劑、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及處理(包括分離電壓-遷移時(shí)間曲線圖和各離子標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，不同電壓下的分離度和理論塔板數(shù)、回歸方程和實(shí)際水樣含量的計(jì)算)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析(特別是影響電泳分離的幾個(gè)參數(shù)對(duì)毛細(xì)管電泳法分離的結(jié)果和討論)、思考題，占30%。

五、 結(jié)語(yǔ)

以毛細(xì)管電泳法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的離子色譜法，促使“儀器分析”實(shí)驗(yàn)課程中儀器分析手段的多元化。同時(shí)使用區(qū)別于以往的色譜分析的間接紫外檢測(cè)法，讓學(xué)生學(xué)會(huì)無(wú)或只有很低的紫外吸收物質(zhì)的測(cè)定。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的教學(xué)改革，激發(fā)學(xué)生對(duì)“儀器分析”課程的學(xué)習(xí)興趣，增強(qiáng)學(xué)生的分析能力，有利于學(xué)生的就業(yè)和發(fā)展，同時(shí)也提高了學(xué)生的科研能力，為大四的畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)奠定基礎(chǔ)。