芹菜素對黃嘌呤氧化酶活性的抑制機(jī)理研究

（上海震旦職業(yè)學(xué)院，上海201908）

黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）是尿酸生成過程中一關(guān)鍵酶，主要存在于哺乳動物的乳汁和肝臟中。在人體內(nèi)，XO能催化次黃嘌呤成黃嘌呤，最終生成尿酸[1]，當(dāng)XO活性異?；钴S時，使尿酸大量的生成和過量積累在血液中，臨床表現(xiàn)為高尿酸血癥，隨著尿酸鹽沉積進(jìn)而引起痛風(fēng)的發(fā)作[2]。研究顯示，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的改變，高尿酸血癥和痛風(fēng)的發(fā)病率逐年增高，呈年輕化趨勢，并與代謝紊亂、心腦血管疾病等相關(guān)[3]。因此抑制XO活性，從源頭減少尿酸的產(chǎn)生是臨床治療痛風(fēng)的重要手段?，F(xiàn)臨床上應(yīng)用的XO抑制劑主要是別嘌呤醇，然而可能會引發(fā)一些不良反應(yīng)，如引起過敏及抑制骨髓，對部分充血性心臟功能不全的高尿酸血癥患者不利等，這在一定程度上限制了它的臨床應(yīng)用[4]。因此研究新的低毒、少副作用的XO抑制劑具有十分重要的意義。天然產(chǎn)物有效成分的XO抑制劑來源廣泛，安全性高，因此引起了廣泛的關(guān)注。

目前，黃酮類化合物在醫(yī)藥和食品方面有重要的應(yīng)用。天然的黃酮類化合物有多種生物活性[5]，例如清除自由基、抗氧化、抗菌、抗病毒、保護(hù)肝臟、抗腫瘤、抗血栓、保護(hù)心肌和降血脂等作用。此外，研究表明，有些黃酮類化合物還能抑制XO的活性，從而抑制尿酸的合成以及一系列生理性損傷[6-7]。作為一種黃酮組分，芹菜素又稱芹黃素、洋芹素，廣泛分布于溫?zé)釒У氖卟撕退?，尤以芹菜中含量為高；在一些藥用植物如車前子、絡(luò)石藤等中也有很高的含量，植物源性飲料如茶、酒以及一些調(diào)味品中也有分布[8-9]。有文獻(xiàn)報道芹菜素對XO也具有較好的抑制活性[10]，但其對XO的抑制機(jī)理尚未見深入的研究，因此本試驗利用多種光譜連用的方法（紫外光譜、熒光光譜和圓二色譜等）結(jié)合分子對接技術(shù)來探究芹菜素對XO活性的抑制機(jī)理，為芹菜素在臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)，有助于深入分析芹菜素對黃嘌呤氧化酶的作用機(jī)制和進(jìn)行藥物的臨床應(yīng)用評價。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

美國黃嘌呤氧化酶（編號X4500-5UN，酶活1.0 units/mg～2.0 units/mg，來源于牛奶）：Sigma公司；芹菜素（純度≥98.0%）、根皮素（純度≥99.0%）、別嘌呤醇（純度≥98.0%）、黃嘌呤（純度≥99.5%）：上海阿拉丁試劑有限公司；其它試劑均為分析純。

pH211型精密pH計：意大利HANNA公司；UV-2550型紫外–可見分光光度計：日本SHIMADZU公司；F-4500型熒光光度計：日本Hitachi公司；J-810型圓二色譜儀：日本JASCO公司。

1.2 方法

1.2.1 芹菜素抑制XO的酶活測定

采用Wang等[11]的方法進(jìn)行酶活測定，并在此基礎(chǔ)上稍作修正。XO催化黃嘌呤產(chǎn)生的尿酸在295 nm處有特征吸收峰，利用UV-2550型紫外-可見分光光度計的動力學(xué)版塊，將固定濃度的XO溶液（7.5×10-8mol/L）與含有不同濃度芹菜素（根皮素）溶液混合，制備一系列3 mL的反應(yīng)體系（在pH 7.4，0.05 mol/L，Tris-HCl緩沖液中），置于37℃水浴孵化3 h，待反應(yīng)達(dá)到平衡，加入底物黃嘌呤溶液（最終濃度為5.0×10-5mol/L）啟動反應(yīng)，25℃下，以空白作對照，每隔15秒測定體系在295 nm處的吸光度，每種濃度做3個平行。

通過關(guān)系式：相對活性/%=（R/R0）× 100，計算 XO的相對活性，以別嘌呤醇作為陽性對照。

式中：R0為無抑制劑時吸光度變化率；R為在含有不同濃度抑制劑體系中吸光度變化率。以未加抑制劑組的酶活力為100%。

1.2.2 芹菜素對XO活性的抑制動力學(xué)研究

在上述相同條件下，固定XO的濃度（7.5×10-8mol/L），測定不同濃度芹菜素體系（0、2.5、5.0、10.0 μmol/L）中，不同濃度底物黃嘌呤（2.5、5.0、10.0、20.0×10-5mol/L）對反應(yīng)速率的影響，每種濃度做3個平行，并以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程作圖，判斷芹菜素對XO抑制作用的可逆性和抑制類型，并求出抑制常數(shù)（Ki）和抑制系數(shù)（α）。

1.2.3 芹菜素與XO作用的熒光光譜研究

在3 mL反應(yīng)體系（Tris-HCl緩沖液）中，固定XO濃度（5.0×10-7mol/L），依次滴加一定量的芹菜素溶液（3 μL/次，使?jié)舛戎饾u增加）并混合均勻，待靜置3 min，分別掃描游離XO和芹菜素-XO混合體系的熒光光譜。掃描條件：激發(fā)波長280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，掃描范圍300 nm～500 nm。

1.2.4 圓二色譜測定

在上述緩沖介質(zhì)中，分別掃描游離XO以及芹菜素-XO樣品溶液（摩爾比1∶1和2∶1）的圓二色譜。掃描條件：波長范圍為190 nm～250 nm，掃描速度為60 nm/min，以相同緩沖液做空白。再通過在線Dichroweb 軟 件（http：//dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml）計算XO的二級結(jié)構(gòu)含量變化[12]。

1.2.5 分子對接

從Protein Data Base數(shù)據(jù)庫下載XO的晶體模型（PDB ID：3ETR），從Pub Chem數(shù)據(jù)庫下載芹菜素的3D結(jié)構(gòu)，分別進(jìn)行優(yōu)化處理。再通過AutoDock 4.2分子模擬軟件進(jìn)行100次結(jié)合模擬，選出最佳結(jié)合構(gòu)象進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 芹菜素對XO活性的抑制作用

芹菜素對XO的抑制作用見圖1。

圖1 芹菜素對XO的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect on XO of apigenin

如圖1所示，在一定濃度內(nèi)，隨著芹菜素的不斷加入，XO的相對活性逐漸降低直至20%，芹菜素對酶的抑制作用呈現(xiàn)一定的濃度依賴關(guān)系，是有效的XO抑制劑；而根皮素只將相對酶活抑制到75%，最后趨于平緩，表明根皮素不是有效的XO抑制劑。分析其結(jié)構(gòu)，根皮素與芹菜素的結(jié)構(gòu)差異只在于缺少一個2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)，由此可見黃酮組分芹菜素中的2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)是抑制XO活性的重要結(jié)構(gòu)[10]。此外，芹菜素和陽性對照別嘌呤醇的IC50分別為（8.63±0.03）μmol/L和（3.02±0.02）μmol/L（n=3），數(shù)量級相同，表明芹菜素具有較好的抑制XO活性的潛力。

2.2 芹菜素對XO的抑制動力學(xué)分析

通過酶反應(yīng)動力學(xué)方法，用酶促反應(yīng)速度υ（ΔOD）對酶濃度作圖：當(dāng)不存在抑制劑時，速率直線通過原點；當(dāng)有可逆性抑制劑存在時，因抑制劑的量恒定，可得到一條通過原點而斜率較低的直線[11]。芹菜素對XO的抑制類型見圖2。

圖2 芹菜素對XO的抑制類型Fig.2 Inhibitory type of apigenin on XO

圖2顯示，每個抑制劑濃度下的直線都經(jīng)過原點，且隨著芹菜素濃度的增加直線的斜率不斷降低，表明芹菜素對XO的抑制是一個可逆的過程。按照動力學(xué)方法區(qū)分抑制劑對酶的可逆性抑制作用，以及抑制劑、底物和酶之間的相互關(guān)系，可逆性抑制又可分為競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制和混合競爭型抑制。采用Lineweaver-Burk雙導(dǎo)數(shù)法作圖，判斷芹菜素對XO的抑制作用類型，結(jié)果見圖2，測得的l/υ-1/[S]關(guān)系為一組相交于第二象限的直線，這說明芹菜素對XO是一種混合競爭型抑制劑[12]。對這種抑制類型，再分別以直線的斜率和Y-截距對芹菜素濃度二次作圖，如圖2所示，直線線性關(guān)系較好，表明芹菜素在XO上只有一個或一類結(jié)合位點[13]，再計算得出Ki=（2.35±0.42）μmol/L 和 α=（4.07±0.06）μmol/L。

2.3 芹菜素與XO的相互作用

一般情況下，在激發(fā)波長為280 nm時，蛋白質(zhì)在340 nm附近有一個主要的熒光發(fā)射峰（主要因為蛋白質(zhì)中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等熒光發(fā)射基團(tuán)）。圖3是不同濃度芹菜素存在下XO熒光發(fā)射光譜。

圖3 不同濃度的芹菜素對XO熒光光譜的影響Fig.3 Effect of apigenin on fluorescence spectra of XO at different concentrations

芹菜素沒有內(nèi)源熒光，而隨著芹菜素溶液不斷加入，XO的熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低，并且最高峰的峰位出現(xiàn)了略微藍(lán)移，這說明芹菜素與XO之間發(fā)生了相互作用，并由此影響了XO內(nèi)熒光發(fā)色氨基酸周圍微環(huán)境，使其疏水性增強(qiáng)[14]。

為了進(jìn)一步闡明猝滅機(jī)理，在研究中利用Stern-Volmer方程對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[15]：F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]，lg（F0-F）/F=lgKa+nlg[Q]，式中：F0和 F 分別為未加入和加入芹菜素時XO的熒光強(qiáng)度；Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù)；KSV為猝滅常數(shù)；[Q]為芹菜素的濃度。并根據(jù)熱力學(xué)公式：lgKa=-ΔH/2.303RT+ΔS/2.303R，ΔG= ΔH-TΔS，計算焓變（ΔH）、熵變（ΔS）和吉布斯自由能變（ΔG）。根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變ΔH和熵變ΔS的相對大小，可以判斷芹菜素與XO大分子相互作用的主要作用力類型[16]。結(jié)果列于表1。

表1中，Ksv隨著溫度的升高而減小且猝滅速率常數(shù)Kq值均遠(yuǎn)大于生物分子的最大擴(kuò)散速率常數(shù)值（2×1010L/（mol·s），這表明芹菜素對XO熒光猝滅為典型的形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過程；結(jié)合常數(shù)（Ka）隨溫度升高而增大，說明復(fù)合物的穩(wěn)定性隨溫度升高而增強(qiáng)；結(jié)合位點數(shù)（n）均趨于1，表明芹菜素在XO上存在唯一的結(jié)合位點，這與抑制動力學(xué)試驗結(jié)果吻合。

根據(jù)ΔG＜0，表明芹菜素與XO的作用過程是一個Gibbs自由能降低的自發(fā)過程；ΔH＞0、ΔS＞0，說明形成復(fù)合物是熵驅(qū)動的吸熱反應(yīng)，揭示芹菜素與XO結(jié)合的主要驅(qū)動力為疏水作用力[12]。

不同溫度下芹菜素-XO體系的猝滅常數(shù)（Ksv）、結(jié)合常數(shù)（Ka）、結(jié)合為點數(shù)（n）及熱力學(xué)參數(shù)見表1。

2.4 芹菜素對XO二級結(jié)構(gòu)的影響

圓二色譜是研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化的有效工具，圖6為芹菜素與XO相互作用的圓二色譜圖，XO出現(xiàn)兩個負(fù)的特征峰譜帶是α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰，并隨著芹菜素濃度增大，圖譜中特征負(fù)峰減小，且峰位峰形都沒有顯著變化，表明XO分子中α-螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生變化但仍占主導(dǎo)地位。在線SELCON3程序算得XO二級結(jié)構(gòu)含量的值列于表2，可見，當(dāng)芹菜素與XO的摩爾比增大時（從 0∶1，1∶1到 2∶1），α-螺旋（從36.8%、40.3%到47.6%）和β-折疊（11.8%、13.1%到14.4%）的含量都升高，而β-轉(zhuǎn)角（從26.3%、23.9%到20.6%）和無規(guī)卷曲（25.1%、22.7%到17.7%）含量逐漸降低，說明芹菜素的加入誘導(dǎo)XO的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生部分改變，并且α-螺旋作為主要結(jié)構(gòu)，含量增加可能使XO的二級結(jié)構(gòu)更加緊密，這不利于酶形成活性中心以及底物進(jìn)入活性中心。

表1 不同溫度下芹菜素-XO體系的猝滅常數(shù)（Ksv）、結(jié)合常數(shù)（Ka）、結(jié)合為點數(shù)（n）及熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Quenching constant（Ksv），association constant（Ka），binding sites（n），and thermodynamic parameters of apigenin-XO system at different temperature

表2 XO和芹菜素-XO體系的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量Table 2 Secondary structure contents of XO and apigenin-XO systems

2.5 分子模擬

計算機(jī)分子對接方法可形象地展現(xiàn)出配體與生物大分子的結(jié)合情況，這有助于從理論上確定其相互作用的機(jī)理和模式。芹菜素與XO分子對接團(tuán)簇分析見圖4，芹菜素與XO分子對接見圖5。

如圖4，按最佳能量原理，結(jié)合能最低（-6.15）結(jié)合次數(shù)最多（33次）的結(jié)合構(gòu)象最穩(wěn)定，所得的最佳構(gòu)象如圖5所示，該圖僅顯示了XO活性空腔內(nèi)配體芹菜素周圍氨基酸殘基（Phe 649/1009/1013、Leu 648/873/1014、Glu 802/879、Arg 880、Ser 876、Thr 1011 等），并與陽性對照別嘌呤醇的位置進(jìn)行對比。從圖中可看出，與別嘌呤醇一樣，芹菜素的剛性雙環(huán)結(jié)構(gòu)嵌入XO的疏水腔，而這阻礙了底物分子進(jìn)入活性中心的通道，由此降低了酶的催化活性。而且芹菜素的疏水結(jié)構(gòu)被疏水氨基酸包圍（Leu 648/873/1014，Phe 649/1009/1013），說明芹菜素與XO之間存在疏水作用[11-12]，這與熱力學(xué)研究結(jié)果基本一致。再者，考慮到其間近距離，芹菜素苯環(huán)結(jié)構(gòu)與周圍的芳香族氨基酸（Phe 649/1009/1013）的苯環(huán)之間可能存在π-π堆積作用，這有利于配體的結(jié)合。圖中還顯示芹菜素與XO的Leu 873、Phe 649之間形成了氫鍵，鍵長分別為3.37 ?和3.16 ?，進(jìn)一步利于芹菜素穩(wěn)定在空腔中。

圖4 芹菜素與XO分子對接團(tuán)簇分析Fig.4 Cluster analyses of the AutoDock docking runs of apigenin with XO

圖5 芹菜素與XO分子對接Fig.5 Molecular docking between apigenin and XO

3 結(jié)論

芹菜素具有良好的XO活性抑制效果；通過研究抑制動力學(xué)特點，明確芹菜素對XO具有明顯可逆的混合競爭型抑制作用，其半抑制濃度IC50為（8.63±0.03）μmol/L，抑制常數(shù) Ki為（2.35 ± 0.42）μmol/L。再結(jié)合芹菜素與XO相互作用進(jìn)行分析，芹菜素抑制XO活性的機(jī)理為：芹菜素進(jìn)入XO的疏水腔，通過疏水作用力與XO活性中心周圍的主要氨基酸殘基發(fā)生作用；并引起XO的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，α-螺旋含量增加使得XO的結(jié)構(gòu)更加緊密而不利于底物進(jìn)入疏水空腔；同時，芹菜素占據(jù)底物進(jìn)入活性中心的通道，也有效地抑制XO對黃嘌呤的催化活性。