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    俄色葉水提物對(duì)糖尿病模型小鼠降血糖作用的研究

    2018-10-31 02:50:22任軍輝索朗歐珠邵妍麗德央丁云春
    食品研究與開(kāi)發(fā) 2018年21期
    關(guān)鍵詞:小鼠劑量血糖

    任軍輝,索朗歐珠,*,邵妍麗,德央,丁云春

    (1.西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院,西藏拉薩850000;2.西藏自治區(qū)羅布林卡管理處,西藏拉薩850000)

    俄色葉為薔薇科植物變?nèi)~海棠Malus toringoides(Rehd.)Hughes.和花葉海棠 Malus tiansitoria(Batal.)Schneid.的葉,在西藏、青海、四川等藏區(qū)可作為保健飲品,泡水代茶飲用,具有攻堅(jiān)化積、除膩滌滯等功效,用于治療消化不良、高血糖、高血脂、高血壓等,日用量為5 g~10 g[1-2]。已有研究表明,俄色葉中含有大量黃酮類(lèi)物質(zhì),其中,以根皮苷的含量較高[3-4]。俄色葉醇提物用于糖尿病小鼠模型,可有效改善糖尿病癥狀,降低血糖水平[5]。但是,對(duì)于俄色葉水提物降血糖作用未有報(bào)道,此外,日常茶飲中,原料用量一般較少,俄色葉能否在較低劑量下發(fā)揮作用,這是本研究希望探討的問(wèn)題之一。因此,本論文采用日常茶飲方法,通過(guò)沸水浸提俄色葉,探究其降血糖作用,為俄色葉茶飲產(chǎn)品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    俄色葉:采自西藏昌都,經(jīng)西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院丁云春教授鑒定為薔薇科蘋(píng)果屬植物變?nèi)~海棠Malus toringoides(Rehd.)Hughes.的葉。

    實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雄性昆明種小鼠,SPF級(jí),體重(20±2)g,購(gòu)自西安交通大學(xué),動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(陜)2012-003。

    1.2 儀器與試劑

    四氧嘧啶(批號(hào) 101615221):Sigma公司;鹽酸二甲雙胍片(批號(hào)1707052):青島黃海制藥有限責(zé)任公司;總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒(批號(hào):20171118)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒(批號(hào):20171118)、一氧化氮(nitric oxide,NO)試劑盒(批號(hào):20171118)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒(批號(hào):20171118)、甘油三酯(triglyceride,TG)試劑盒(批號(hào):20171206)、總膽固醇(totalcholesterol,TC)試劑盒(批號(hào):20171206)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)測(cè)試盒(批號(hào):20171118)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)測(cè)試盒(批號(hào):20171118):南京建成生物工程研究所;其他試劑均為分析純。

    安準(zhǔn)型血糖儀:三諾生物傳感股份有限公;ELx800酶標(biāo)儀:美國(guó)Bio-Tek公司;TGL-16高速離心機(jī):長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 俄色葉水提物的制備

    稱(chēng)取俄色葉50 g,加入沸水約1 L,浸泡30 min后倒出上清液,反復(fù)浸泡3次,至水溶液呈無(wú)色,合并藥液,真空減壓濃縮至相當(dāng)于俄色葉生藥量5 kg/L,即得俄色葉水提物,備用。

    1.3.2 糖尿病小鼠模型建立[6]

    小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,隨機(jī)分組,禁食但不禁水12 h,每只小鼠按220 mg/kg劑量腹腔注射四氧嘧啶(四氧嘧啶采用pH 4.5檸檬酸緩沖液溶液配制),空白組、小鼠注射等劑量生理鹽水,隨后正常飼養(yǎng)。72 h后尾靜脈取血,利用血糖試紙測(cè)定空腹血糖,血糖值≥11.1 mmol/L視為糖尿病模型造模成功。

    1.3.3 動(dòng)物分組及給藥

    將造模成功的糖尿病小鼠進(jìn)行分組,分別為俄色葉水提物低劑量組(130 mg/kg,相當(dāng)于成人量1 g/d)、俄色葉水提物中劑量組(260 mg/kg,相當(dāng)于成人量2 g/d)、俄色葉水提物高劑量組(520 mg/kg,相當(dāng)于成人量4 g/d)、陽(yáng)性對(duì)照組(鹽酸二甲雙胍260 mg/kg)、模型組,同時(shí),設(shè)立空白組,每組10只,模型組和空白組給予等體積生理鹽水,連續(xù)灌胃21 d。

    1.4 觀測(cè)指標(biāo)及方法

    1.4.1 小鼠體重變化情況監(jiān)測(cè)

    灌胃給藥期間監(jiān)測(cè)小鼠第0天、第7天、第14天、第21天的體重,比較各組小鼠的體重變化。

    1.4.2 小鼠空腹血糖監(jiān)測(cè)

    灌胃給藥后的第0天、第7天、第14天、第21天,各組小鼠禁食不禁水12 h,剪尾尖取血,用血糖儀測(cè)定其空腹血糖,結(jié)果以mmol/L表示,比較各組小鼠的血糖變化。

    1.4.3 給藥3周后小鼠糖耐量測(cè)定[7]

    各組小鼠于第21天禁食不禁水12 h后灌胃相應(yīng)藥物,30 min后按照2.0 g/kg劑量灌胃25%的葡萄糖溶液,分別記錄灌胃葡萄糖之后的0、30、60、120 min血糖變化并按照公式計(jì)算曲線下面積(area under curve,AUC)。

    式中:X1、X2、X3、X4分別代表 0、30、60、120 min 的血糖值。

    1.4.4 血清中超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的測(cè)定[8-10]

    各組小鼠末次灌胃后,禁食不禁水12 h,摘眼球取血,離心得到血清,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中SOD、NO、ALT、AST 的含量。

    1.4.5 肝臟中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)的測(cè)定[11-14]

    脫頸處死小鼠后分離肝臟,用生理鹽水洗凈,而后用勻漿器研磨得肝勻漿,離心,取上清液,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定肝勻漿中MDA、GSH-Px、TC、TG的含量。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)

    采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,統(tǒng)計(jì)量用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較用單因素方差分析,P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 俄色葉水提物對(duì)糖尿病小鼠體重的影響

    俄色葉水提物對(duì)糖尿病小鼠體重的影響結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 俄色葉水提物對(duì)糖尿病模型小鼠體重的影響(±s,n=10)Table 1 Effect of water-extraction from Malus toringoides leaves on weight of diabetic mice(±s,n=10)

    表1 俄色葉水提物對(duì)糖尿病模型小鼠體重的影響(±s,n=10)Table 1 Effect of water-extraction from Malus toringoides leaves on weight of diabetic mice(±s,n=10)

    注:與模型組比較,*P<0.05 顯著,**P<0.01極顯著;與空白組比較,△P<0.05顯著,△△P<0.01 極顯著。

    體重/g造模前 給藥0 d 給藥7 d 給藥14 d 給藥21 d空白組 22.30±1.30 25.93±1.55** 29.35±1.21** 33.22±1.41** 36.25±1.98**模型組 21.26±1.24 20.55±1.43△△ 23.58±1.39△△ 25.63±1.88△△ 27.23±1.80△△陽(yáng)性對(duì)照組 0.26 21.38±1.03 21.03±1.84△△ 26.91±1.47*△ 29.40±1.97*△ 31.53±1.56*△△俄色葉低劑量 0.13 21.00±1.39 21.18±1.12△△ 26.08±1.82△ 28.35±1.17*△△ 30.08±1.06*△△俄色葉中劑量 0.26 20.86±1.53 20.90±1.29△△ 26.35±1.70*△ 29.13±1.75*△△ 31.43±2.16*△△俄色葉高劑量 0.52 20.53±1.04 20.35±0.65△△ 26.98±1.88* 29.15±1.91*△ 31.90±1.89*△組別劑量/[mg/(kg·d)]

    表1結(jié)果表明,造模后,除空白組外,其余各組小鼠體重均增長(zhǎng)緩慢,與空白組相比,有極顯著性差異(P<0.01)。灌胃給藥后,俄色葉水提物各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組體重增加較為明顯,與模型組比較,均呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。但給藥組體重仍低于空白組,與之對(duì)比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或 0.01)。

    說(shuō)明俄色葉水提物可明顯改善糖尿病小鼠癥狀,體重增加明顯,且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

    2.2 俄色葉水提物對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖的影響

    俄色葉水提物對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖的影響結(jié)果見(jiàn)表2。

    由表2可知,灌胃給藥后,與模型組比較,俄色葉水提物低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組的血糖值均呈現(xiàn)下降趨勢(shì),有顯著性差異(P<0.05或0.01);與空白組比較,未降低至正常水平,且差異顯著(P<0.05或0.01)。說(shuō)明俄色葉水提物對(duì)糖尿病小鼠具有降低血糖作用。

    2.3 俄色葉水提物對(duì)糖尿病模型小鼠口服糖耐受量的影響

    俄色葉水提物對(duì)糖尿病模型小鼠口服糖耐受量的影響結(jié)果見(jiàn)表3。

    表2 俄色葉水提物對(duì)糖尿病模型小鼠空腹血糖的影響(±s,n=10)Table 2 Effect of water-extraction from Malus toringoides leaves on fasting plasma glucose of diabetic mice(±s,n=10)

    表2 俄色葉水提物對(duì)糖尿病模型小鼠空腹血糖的影響(±s,n=10)Table 2 Effect of water-extraction from Malus toringoides leaves on fasting plasma glucose of diabetic mice(±s,n=10)

    注:與模型組比較,*P<0.05 顯著,**P<0.01 極顯著;與空白組比較,△P<0.05 顯著,△△P<0.01極顯著。

    組別劑量/[mg/(kg·d)]血糖水平/(mmol/L)造模前 給藥0 d 給藥7 d 給藥14 d 給藥21 d空白組 7.75±1.22 7.96±1.18** 7.80±1.35** 7.90±1.36** 7.78±1.28**模型組 7.81±1.19 22.85±7.13△△ 23.94±3.79△△ 24.67±5.47△△ 24.01±4.51△△陽(yáng)性對(duì)照組 0.26 7.91±1.26 20.43±6.36△△ 14.26±5.73**△△ 13.43±5.97**△ 11.88±4.79**△俄色葉低劑量 0.13 7.66±1.37 19.45±6.63△△ 18.32±6.96△△ 16.70±7.49*△△ 14.55±3.45*△△俄色葉中劑量 0.26 7.72±1.32 19.73±6.20△△ 16.87±6.27*△△ 15.02±5.89**△△ 12.90±2.44**△△俄色葉高劑量 0.52 7.82±1.28 21.06±7.16△△ 15.39±4.89**△△ 14.33±4.81**△△ 11.73±1.25**△△

    表3 俄色葉水提物對(duì)糖尿病模型小鼠口服糖耐受量的影響(±s,n=10)Table 3 Effect of water-extraction from Malus toringoides leaves on glucose tolerance test of diabetic mice(±s,n=10)

    表3 俄色葉水提物對(duì)糖尿病模型小鼠口服糖耐受量的影響(±s,n=10)Table 3 Effect of water-extraction from Malus toringoides leaves on glucose tolerance test of diabetic mice(±s,n=10)

    注:與模型組比較,*P<0.05 顯著,**P<0.01 極顯著;與空白組比較,△P<0.05 顯著,△△P<0.01極顯著。

    組別劑量/[mg/(kg·d)]血糖水平/(mmol/L)0 min 30 min 60 min 120 min 曲線下面積空白組 7.15±1.42** 12.90±2.57** 10.21±1.98** 7.55±1.38** 30.46±3.02**模型組 23.36±5.03△△ 31.68±1.61△△ 31.35±2.24△△ 26.96±5.82△△ 88.19±4.31△△陽(yáng)性對(duì)照組 0.26 13.51±6.14**△ 22.00±4.76**△△ 19.23±6.51**△ 10.33±3.72** 53.15±4.56**△△俄色葉低劑量 0.13 16.17±6.32*△△ 26.73±5.70*△△ 27.25±5.98*△△ 18.10±9.15*△△ 71.12±17.21*△△俄色葉中劑量 0.26 14.42±5.06**△△ 27.32±2.95**△△ 22.82±4.02**△△ 16.60±2.97**△△ 65.65±10.65**△△俄色葉高劑量 0.52 16.90±4.70**△△ 26.10±4.06**△△ 22.08±5.30**△△ 14.92±5.32**△△ 64.09±14.00**△△

    由表3可知,給予葡萄糖溶液后,各組血糖水平均有明顯上升,其中,30 min時(shí),俄色葉水提物中、高劑量組血糖處于最高水平,而后血糖水平均有所下降;其中,俄色葉3個(gè)劑量組血糖水平均低于模型組,曲線下面積也小于模型組,均呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05或0.01),但仍極顯著高于空白組(P<0.01)。說(shuō)明俄色葉水提物可有效改善糖尿病小鼠的糖耐量。

    2.4 俄色葉水提物對(duì)糖尿病模型小鼠血清SOD、NO、ALT、AST的影響

    俄色葉水提物對(duì)糖尿病模型小鼠血清SOD、NO、ALT、AST的影響結(jié)果見(jiàn)表4。

    表4 俄色葉水提物對(duì)糖尿病模型小鼠血清SOD、NO、ALT、AST的影響(±s,n=10)Table 4 Effect of water-extraction from Malus toringoides leaves on SOD,NO.ALT,AST in serum of diabetic mice(±s,n=10)

    注:與模型組比較,*P<0.05 顯著,**P<0.01 極顯著;與空白組比較,△P<0.05 顯著,△△P<0.01極顯著。

    組別劑量/[mg/(kg·d)]血清SOD/(U/mL)血清NO/(μmol/L)血清ALT/(U/gprot)血清AST/(U/gprot)空白組 79.05±7.77** 60.63±9.23** 31.90±5.85 39.14±5.06模型組 47.29±4.45△△ 113.08±7.83△△ 32.17±7.45 39.71±3.14陽(yáng)性對(duì)照組 0.26 62.00±6.07**△ 60.21±8.32** 33.05±6.77 38.04±6.49俄色葉低劑量 0.13 59.91±4.82**△△ 81.86±6.97**△△ 34.36±5.31 40.28±5.78俄色葉中劑量 0.26 63.09±3.78**△ 76.84±4.68**△△ 33.28±6.69 37.28±6.14俄色葉高劑量 0.52 70.12±9.19** 64.02±4.03**△ 32.81±4.87 36.89±9.16

    由表4可見(jiàn),俄色葉水提物各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組的SOD活性升高明顯,而NO含量顯著下降,與模型組比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),與空白組比較,未完全恢復(fù)至正常水平(P<0.05或0.01)。ALT、AST結(jié)果顯示,各組兩個(gè)指標(biāo)均未出現(xiàn)顯著性差異。說(shuō)明俄色葉水提物可提高SOD活性,降低NO含量,且對(duì)肝功無(wú)影響。

    2.5 俄色葉水提物對(duì)糖尿病模型小鼠肝臟MDA、GSH-Px、TG、TC 的影響

    俄色葉水提物對(duì)糖尿病模型小鼠肝臟MDA、GSH-Px、TG、TC 的影響見(jiàn)表 5。

    表5 俄色葉水提物對(duì)糖尿病模型小鼠肝臟MDA、GSH-Px、TG、TC的影響(±s,n=10)Table 5 Effect of water-extraction from Malus toringoides leaves on MDA,GSH-Px,TG,TC in liver of diabetic mice(±s,n=10)

    表5 俄色葉水提物對(duì)糖尿病模型小鼠肝臟MDA、GSH-Px、TG、TC的影響(±s,n=10)Table 5 Effect of water-extraction from Malus toringoides leaves on MDA,GSH-Px,TG,TC in liver of diabetic mice(±s,n=10)

    注:與模型組比較,*P<0.05 顯著,**P<0.01極顯著;與空白組比較,△P<0.05顯著,△△P<0.01 極顯著。

    組別劑量/[mg/(kg·d)]肝臟MDA/(nmol/gprot)肝臟GSH-Px/(U/gprot)肝臟TG/(mmol/gprot)肝臟TC/(mmol/gprot)空白組 0.49±0.15** 157.97±18.52** 0.063±0.022** 0.037±0.018**模型組 0.79±0.16△△ 120.66±21.75△△ 0.152±0.050△△ 0.188±0.020△△陽(yáng)性對(duì)照組 0.26 0.53±0.16** 145.71±14.10* 0.084±0.021** 0.045±0.029**俄色葉低劑量 0.13 0.58±0.15* 141.25±13.69* 0.126±0.019△△ 0.077±0.015**俄色葉中劑量 0.26 0.53±0.09** 146.17±12.58* 0.094±0.017*△ 0.067±0.012**俄色葉高劑量 0.52 0.41±0.14** 157.88±19.86** 0.079±0.013** 0.063±0.008**

    表5結(jié)果可知,與模型組比較,俄色葉水提物各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組的MDA、TG、TC含量均顯著降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01),除TG外,其余兩個(gè)指標(biāo)均接近空白組。而GSH-Px測(cè)定結(jié)果顯示,俄色葉水提物各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組含量明顯升高,與模型組比較,有顯著性差異(P<0.05或0.01),且與空白組無(wú)顯著性差異。說(shuō)明俄色葉水提取物可提高GSH-Px,降低MDA、TG、TC等指標(biāo)水平。

    3 結(jié)論與討論

    糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一組以高血糖為特征的慢性非傳染性代謝性疾病,主要與遺傳及生活習(xí)慣等因素相關(guān)。糖尿病發(fā)病率高、病程較長(zhǎng),易誘發(fā)冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化及多器官功能衰竭等并發(fā)癥[15-16]。隨著生活水平的提高,飲食結(jié)構(gòu)的改變,糖尿病已成為高發(fā)疾病,嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康。血糖控制不佳的糖尿病晚期患者常伴有多器官的并發(fā)癥,是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因。研究表明氧化應(yīng)激及其所誘發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化是糖尿病發(fā)展并加重的主要因素[17-18]。此外,糖尿病患者往往伴發(fā)高血脂癥,極易引起血液黏稠度增高和動(dòng)脈粥樣硬化,進(jìn)而誘發(fā)各種血管病變,也是導(dǎo)致并發(fā)癥發(fā)生的關(guān)鍵因素之一[19-21]。肝組織作為機(jī)體調(diào)節(jié)血脂的重要器官,對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)十分敏感。因此,糖尿病患者除了很好地控制血糖外,還應(yīng)抑制自由基損傷、調(diào)節(jié)血脂并保護(hù)肝功能。

    氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)加劇糖尿病病情的發(fā)展,并進(jìn)一步導(dǎo)致相應(yīng)并發(fā)癥的發(fā)生。研究表明,過(guò)高的氧化應(yīng)激壓力會(huì)使細(xì)胞膜上生成大量有高度毒性作用的脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA,并對(duì)胰腺β細(xì)胞的功能造成不同程度的損傷,加劇胰島組織的破壞[22-23]。另一方面,內(nèi)源性抗氧化物酶體系對(duì)患者機(jī)體又可起到保護(hù)作用,例如,SOD和GSH-Px可以通過(guò)清除體內(nèi)過(guò)多的自由基,來(lái)降低有毒有害自由基在機(jī)體內(nèi)的堆積,防止產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)機(jī)體組織所造成的損傷,從而防止糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展[24-25]。此外,NO對(duì)于糖尿病胰島素抵抗和胰腺β細(xì)胞功能障礙的發(fā)生發(fā)展,也可發(fā)揮重要作用,其會(huì)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡,減少胰島素的分泌[26]。因此,增加 SOD、GSH-Px含量,并抑制 MDA、NO在體內(nèi)的生成,可起到預(yù)防和治療糖尿病的作用。此外,糖尿病患者多有血脂升高的癥狀,而TG、TC含量可反映機(jī)體內(nèi)血脂水平,有效控制二者含量,能夠防止糖尿病及并發(fā)癥的惡化,故降低二者水平可反應(yīng)藥物對(duì)糖尿病的治療效果[27-28]。以上氧化應(yīng)激指標(biāo)和血脂指標(biāo)的改善均能說(shuō)明藥物對(duì)糖尿病模型的治療作用。

    本論文研究顯示,俄色葉水提物可有效恢復(fù)糖尿病小鼠體重增長(zhǎng),降低血糖水平,提高糖耐受量,且呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系,還可提高SOD、GSH-Px活性,降低 NO、MDA、TG、TC 含量,對(duì) AST、ALT 等指標(biāo)無(wú)影響。說(shuō)明俄色葉水提物對(duì)糖尿病模型小鼠有降血糖作用,其作用與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān),且對(duì)肝功無(wú)影響。

    本研究樣品采用常規(guī)茶飲方式制備所得,降血糖效果良好且劑量較低,說(shuō)明俄色葉作為日常茶飲,具有輔助糖尿病患者降血糖的潛力,可為下一步俄色葉資源的開(kāi)發(fā)與利用提供試驗(yàn)依據(jù)及廣闊前景。

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