俄色葉水提物對糖尿病模型小鼠降血糖作用的研究

任軍輝，索朗歐珠，*，邵妍麗，德央，丁云春

（1.西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，西藏拉薩850000；2.西藏自治區(qū)羅布林卡管理處，西藏拉薩850000）

俄色葉為薔薇科植物變?nèi)~海棠Malus toringoides（Rehd.）Hughes.和花葉海棠 Malus tiansitoria（Batal.）Schneid.的葉，在西藏、青海、四川等藏區(qū)可作為保健飲品，泡水代茶飲用，具有攻堅化積、除膩滌滯等功效，用于治療消化不良、高血糖、高血脂、高血壓等，日用量為5 g～10 g[1-2]。已有研究表明，俄色葉中含有大量黃酮類物質(zhì)，其中，以根皮苷的含量較高[3-4]。俄色葉醇提物用于糖尿病小鼠模型，可有效改善糖尿病癥狀，降低血糖水平[5]。但是，對于俄色葉水提物降血糖作用未有報道，此外，日常茶飲中，原料用量一般較少，俄色葉能否在較低劑量下發(fā)揮作用，這是本研究希望探討的問題之一。因此，本論文采用日常茶飲方法，通過沸水浸提俄色葉，探究其降血糖作用，為俄色葉茶飲產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

俄色葉：采自西藏昌都，經(jīng)西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院丁云春教授鑒定為薔薇科蘋果屬植物變?nèi)~海棠Malus toringoides（Rehd.）Hughes．的葉。

實驗動物：雄性昆明種小鼠，SPF級，體重（20±2）g，購自西安交通大學(xué)，動物質(zhì)量合格證號SCXK（陜）2012-003。

1.2 儀器與試劑

四氧嘧啶（批號 101615221）：Sigma公司；鹽酸二甲雙胍片（批號1707052）：青島黃海制藥有限責(zé)任公司；總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號：20171118）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號：20171118）、一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒（批號：20171118）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（批號：20171118）、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒（批號：20171206）、總膽固醇（totalcholesterol，TC）試劑盒（批號：20171206）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）測試盒（批號：20171118）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）測試盒（批號：20171118）：南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

安準(zhǔn)型血糖儀：三諾生物傳感股份有限公；ELx800酶標(biāo)儀：美國Bio-Tek公司；TGL-16高速離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 俄色葉水提物的制備

稱取俄色葉50 g，加入沸水約1 L，浸泡30 min后倒出上清液，反復(fù)浸泡3次，至水溶液呈無色，合并藥液，真空減壓濃縮至相當(dāng)于俄色葉生藥量5 kg/L，即得俄色葉水提物，備用。

1.3.2 糖尿病小鼠模型建立[6]

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機分組，禁食但不禁水12 h，每只小鼠按220 mg/kg劑量腹腔注射四氧嘧啶（四氧嘧啶采用pH 4.5檸檬酸緩沖液溶液配制），空白組、小鼠注射等劑量生理鹽水，隨后正常飼養(yǎng)。72 h后尾靜脈取血，利用血糖試紙測定空腹血糖，血糖值≥11.1 mmol/L視為糖尿病模型造模成功。

1.3.3 動物分組及給藥

將造模成功的糖尿病小鼠進(jìn)行分組，分別為俄色葉水提物低劑量組（130 mg/kg，相當(dāng)于成人量1 g/d）、俄色葉水提物中劑量組（260 mg/kg，相當(dāng)于成人量2 g/d）、俄色葉水提物高劑量組（520 mg/kg，相當(dāng)于成人量4 g/d）、陽性對照組（鹽酸二甲雙胍260 mg/kg）、模型組，同時，設(shè)立空白組，每組10只，模型組和空白組給予等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃21 d。

1.4 觀測指標(biāo)及方法

1.4.1 小鼠體重變化情況監(jiān)測

灌胃給藥期間監(jiān)測小鼠第0天、第7天、第14天、第21天的體重，比較各組小鼠的體重變化。

1.4.2 小鼠空腹血糖監(jiān)測

灌胃給藥后的第0天、第7天、第14天、第21天，各組小鼠禁食不禁水12 h，剪尾尖取血，用血糖儀測定其空腹血糖，結(jié)果以mmol/L表示，比較各組小鼠的血糖變化。

1.4.3 給藥3周后小鼠糖耐量測定[7]

各組小鼠于第21天禁食不禁水12 h后灌胃相應(yīng)藥物，30 min后按照2.0 g/kg劑量灌胃25%的葡萄糖溶液，分別記錄灌胃葡萄糖之后的0、30、60、120 min血糖變化并按照公式計算曲線下面積（area under curve，AUC）。

式中：X1、X2、X3、X4分別代表 0、30、60、120 min 的血糖值。

1.4.4 血清中超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的測定[8-10]

各組小鼠末次灌胃后，禁食不禁水12 h，摘眼球取血，離心得到血清，按照試劑盒說明書測定血清中SOD、NO、ALT、AST 的含量。

1.4.5 肝臟中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）的測定[11-14]

脫頸處死小鼠后分離肝臟，用生理鹽水洗凈，而后用勻漿器研磨得肝勻漿，離心，取上清液，按照試劑盒說明書測定肝勻漿中MDA、GSH-Px、TC、TG的含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)檢驗

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計量用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 俄色葉水提物對糖尿病小鼠體重的影響

俄色葉水提物對糖尿病小鼠體重的影響結(jié)果見表1。

表1 俄色葉水提物對糖尿病模型小鼠體重的影響（±s，n=10）Table 1 Effect of water-extraction from Malus toringoides leaves on weight of diabetic mice（±s，n=10）

表1 俄色葉水提物對糖尿病模型小鼠體重的影響（±s，n=10）Table 1 Effect of water-extraction from Malus toringoides leaves on weight of diabetic mice（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05 顯著，**P＜0.01極顯著；與空白組比較，△P＜0.05顯著，△△P＜0.01 極顯著。

體重/g造模前 給藥0 d 給藥7 d 給藥14 d 給藥21 d空白組 22.30±1.30 25.93±1.55** 29.35±1.21** 33.22±1.41** 36.25±1.98**模型組 21.26±1.24 20.55±1.43△△ 23.58±1.39△△ 25.63±1.88△△ 27.23±1.80△△陽性對照組 0.26 21.38±1.03 21.03±1.84△△ 26.91±1.47*△ 29.40±1.97*△ 31.53±1.56*△△俄色葉低劑量 0.13 21.00±1.39 21.18±1.12△△ 26.08±1.82△ 28.35±1.17*△△ 30.08±1.06*△△俄色葉中劑量 0.26 20.86±1.53 20.90±1.29△△ 26.35±1.70*△ 29.13±1.75*△△ 31.43±2.16*△△俄色葉高劑量 0.52 20.53±1.04 20.35±0.65△△ 26.98±1.88* 29.15±1.91*△ 31.90±1.89*△組別劑量/[mg/（kg·d）]

表1結(jié)果表明，造模后，除空白組外，其余各組小鼠體重均增長緩慢，與空白組相比，有極顯著性差異（P＜0.01）。灌胃給藥后，俄色葉水提物各劑量組和陽性對照組體重增加較為明顯，與模型組比較，均呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。但給藥組體重仍低于空白組，與之對比，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或 0.01）。

說明俄色葉水提物可明顯改善糖尿病小鼠癥狀，體重增加明顯，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

2.2 俄色葉水提物對糖尿病小鼠空腹血糖的影響

俄色葉水提物對糖尿病小鼠空腹血糖的影響結(jié)果見表2。

由表2可知，灌胃給藥后，與模型組比較，俄色葉水提物低、中、高劑量組及陽性對照組的血糖值均呈現(xiàn)下降趨勢，有顯著性差異（P＜0.05或0.01）；與空白組比較，未降低至正常水平，且差異顯著（P＜0.05或0.01）。說明俄色葉水提物對糖尿病小鼠具有降低血糖作用。

2.3 俄色葉水提物對糖尿病模型小鼠口服糖耐受量的影響

俄色葉水提物對糖尿病模型小鼠口服糖耐受量的影響結(jié)果見表3。

表2 俄色葉水提物對糖尿病模型小鼠空腹血糖的影響（±s，n=10）Table 2 Effect of water-extraction from Malus toringoides leaves on fasting plasma glucose of diabetic mice（±s，n=10）

表2 俄色葉水提物對糖尿病模型小鼠空腹血糖的影響（±s，n=10）Table 2 Effect of water-extraction from Malus toringoides leaves on fasting plasma glucose of diabetic mice（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05 顯著，**P＜0.01 極顯著；與空白組比較，△P＜0.05 顯著，△△P＜0.01極顯著。

組別劑量/[mg/（kg·d）]血糖水平/（mmol/L）造模前 給藥0 d 給藥7 d 給藥14 d 給藥21 d空白組 7.75±1.22 7.96±1.18** 7.80±1.35** 7.90±1.36** 7.78±1.28**模型組 7.81±1.19 22.85±7.13△△ 23.94±3.79△△ 24.67±5.47△△ 24.01±4.51△△陽性對照組 0.26 7.91±1.26 20.43±6.36△△ 14.26±5.73**△△ 13.43±5.97**△ 11.88±4.79**△俄色葉低劑量 0.13 7.66±1.37 19.45±6.63△△ 18.32±6.96△△ 16.70±7.49*△△ 14.55±3.45*△△俄色葉中劑量 0.26 7.72±1.32 19.73±6.20△△ 16.87±6.27*△△ 15.02±5.89**△△ 12.90±2.44**△△俄色葉高劑量 0.52 7.82±1.28 21.06±7.16△△ 15.39±4.89**△△ 14.33±4.81**△△ 11.73±1.25**△△

表3 俄色葉水提物對糖尿病模型小鼠口服糖耐受量的影響（±s，n=10）Table 3 Effect of water-extraction from Malus toringoides leaves on glucose tolerance test of diabetic mice（±s，n=10）

表3 俄色葉水提物對糖尿病模型小鼠口服糖耐受量的影響（±s，n=10）Table 3 Effect of water-extraction from Malus toringoides leaves on glucose tolerance test of diabetic mice（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05 顯著，**P＜0.01 極顯著；與空白組比較，△P＜0.05 顯著，△△P＜0.01極顯著。

組別劑量/[mg/（kg·d）]血糖水平/（mmol/L）0 min 30 min 60 min 120 min 曲線下面積空白組 7.15±1.42** 12.90±2.57** 10.21±1.98** 7.55±1.38** 30.46±3.02**模型組 23.36±5.03△△ 31.68±1.61△△ 31.35±2.24△△ 26.96±5.82△△ 88.19±4.31△△陽性對照組 0.26 13.51±6.14**△ 22.00±4.76**△△ 19.23±6.51**△ 10.33±3.72** 53.15±4.56**△△俄色葉低劑量 0.13 16.17±6.32*△△ 26.73±5.70*△△ 27.25±5.98*△△ 18.10±9.15*△△ 71.12±17.21*△△俄色葉中劑量 0.26 14.42±5.06**△△ 27.32±2.95**△△ 22.82±4.02**△△ 16.60±2.97**△△ 65.65±10.65**△△俄色葉高劑量 0.52 16.90±4.70**△△ 26.10±4.06**△△ 22.08±5.30**△△ 14.92±5.32**△△ 64.09±14.00**△△

由表3可知，給予葡萄糖溶液后，各組血糖水平均有明顯上升，其中，30 min時，俄色葉水提物中、高劑量組血糖處于最高水平，而后血糖水平均有所下降；其中，俄色葉3個劑量組血糖水平均低于模型組，曲線下面積也小于模型組，均呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05或0.01），但仍極顯著高于空白組（P＜0.01）。說明俄色葉水提物可有效改善糖尿病小鼠的糖耐量。

2.4 俄色葉水提物對糖尿病模型小鼠血清SOD、NO、ALT、AST的影響

俄色葉水提物對糖尿病模型小鼠血清SOD、NO、ALT、AST的影響結(jié)果見表4。

表4 俄色葉水提物對糖尿病模型小鼠血清SOD、NO、ALT、AST的影響（±s，n=10）Table 4 Effect of water-extraction from Malus toringoides leaves on SOD，NO.ALT，AST in serum of diabetic mice（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05 顯著，**P＜0.01 極顯著；與空白組比較，△P＜0.05 顯著，△△P＜0.01極顯著。

組別劑量/[mg/（kg·d）]血清SOD/（U/mL）血清NO/（μmol/L）血清ALT/（U/gprot）血清AST/（U/gprot）空白組 79.05±7.77** 60.63±9.23** 31.90±5.85 39.14±5.06模型組 47.29±4.45△△ 113.08±7.83△△ 32.17±7.45 39.71±3.14陽性對照組 0.26 62.00±6.07**△ 60.21±8.32** 33.05±6.77 38.04±6.49俄色葉低劑量 0.13 59.91±4.82**△△ 81.86±6.97**△△ 34.36±5.31 40.28±5.78俄色葉中劑量 0.26 63.09±3.78**△ 76.84±4.68**△△ 33.28±6.69 37.28±6.14俄色葉高劑量 0.52 70.12±9.19** 64.02±4.03**△ 32.81±4.87 36.89±9.16

由表4可見，俄色葉水提物各劑量組及陽性對照組的SOD活性升高明顯，而NO含量顯著下降，與模型組比較，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），與空白組比較，未完全恢復(fù)至正常水平（P＜0.05或0.01）。ALT、AST結(jié)果顯示，各組兩個指標(biāo)均未出現(xiàn)顯著性差異。說明俄色葉水提物可提高SOD活性，降低NO含量，且對肝功無影響。

2.5 俄色葉水提物對糖尿病模型小鼠肝臟MDA、GSH-Px、TG、TC 的影響

俄色葉水提物對糖尿病模型小鼠肝臟MDA、GSH-Px、TG、TC 的影響見表 5。

表5 俄色葉水提物對糖尿病模型小鼠肝臟MDA、GSH-Px、TG、TC的影響（±s，n=10）Table 5 Effect of water-extraction from Malus toringoides leaves on MDA，GSH-Px，TG，TC in liver of diabetic mice（±s，n=10）

表5 俄色葉水提物對糖尿病模型小鼠肝臟MDA、GSH-Px、TG、TC的影響（±s，n=10）Table 5 Effect of water-extraction from Malus toringoides leaves on MDA，GSH-Px，TG，TC in liver of diabetic mice（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05 顯著，**P＜0.01極顯著；與空白組比較，△P＜0.05顯著，△△P＜0.01 極顯著。

組別劑量/[mg/（kg·d）]肝臟MDA/（nmol/gprot）肝臟GSH-Px/（U/gprot）肝臟TG/（mmol/gprot）肝臟TC/（mmol/gprot）空白組 0.49±0.15** 157.97±18.52** 0.063±0.022** 0.037±0.018**模型組 0.79±0.16△△ 120.66±21.75△△ 0.152±0.050△△ 0.188±0.020△△陽性對照組 0.26 0.53±0.16** 145.71±14.10* 0.084±0.021** 0.045±0.029**俄色葉低劑量 0.13 0.58±0.15* 141.25±13.69* 0.126±0.019△△ 0.077±0.015**俄色葉中劑量 0.26 0.53±0.09** 146.17±12.58* 0.094±0.017*△ 0.067±0.012**俄色葉高劑量 0.52 0.41±0.14** 157.88±19.86** 0.079±0.013** 0.063±0.008**

表5結(jié)果可知，與模型組比較，俄色葉水提物各劑量組及陽性對照組的MDA、TG、TC含量均顯著降低，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或0.01），除TG外，其余兩個指標(biāo)均接近空白組。而GSH-Px測定結(jié)果顯示，俄色葉水提物各劑量組及陽性對照組含量明顯升高，與模型組比較，有顯著性差異（P＜0.05或0.01），且與空白組無顯著性差異。說明俄色葉水提取物可提高GSH-Px，降低MDA、TG、TC等指標(biāo)水平。

3 結(jié)論與討論

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一組以高血糖為特征的慢性非傳染性代謝性疾病，主要與遺傳及生活習(xí)慣等因素相關(guān)。糖尿病發(fā)病率高、病程較長，易誘發(fā)冠心病、動脈粥樣硬化及多器官功能衰竭等并發(fā)癥[15-16]。隨著生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病已成為高發(fā)疾病，嚴(yán)重威脅著人類健康。血糖控制不佳的糖尿病晚期患者常伴有多器官的并發(fā)癥，是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因。研究表明氧化應(yīng)激及其所誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化是糖尿病發(fā)展并加重的主要因素[17-18]。此外，糖尿病患者往往伴發(fā)高血脂癥，極易引起血液黏稠度增高和動脈粥樣硬化，進(jìn)而誘發(fā)各種血管病變，也是導(dǎo)致并發(fā)癥發(fā)生的關(guān)鍵因素之一[19-21]。肝組織作為機體調(diào)節(jié)血脂的重要器官，對氧化應(yīng)激反應(yīng)十分敏感。因此，糖尿病患者除了很好地控制血糖外，還應(yīng)抑制自由基損傷、調(diào)節(jié)血脂并保護(hù)肝功能。

氧化應(yīng)激反應(yīng)會加劇糖尿病病情的發(fā)展，并進(jìn)一步導(dǎo)致相應(yīng)并發(fā)癥的發(fā)生。研究表明，過高的氧化應(yīng)激壓力會使細(xì)胞膜上生成大量有高度毒性作用的脂質(zhì)過氧化物MDA，并對胰腺β細(xì)胞的功能造成不同程度的損傷，加劇胰島組織的破壞[22-23]。另一方面，內(nèi)源性抗氧化物酶體系對患者機體又可起到保護(hù)作用，例如，SOD和GSH-Px可以通過清除體內(nèi)過多的自由基，來降低有毒有害自由基在機體內(nèi)的堆積，防止產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)對機體組織所造成的損傷，從而防止糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展[24-25]。此外，NO對于糖尿病胰島素抵抗和胰腺β細(xì)胞功能障礙的發(fā)生發(fā)展，也可發(fā)揮重要作用，其會導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡，減少胰島素的分泌[26]。因此，增加 SOD、GSH-Px含量，并抑制 MDA、NO在體內(nèi)的生成，可起到預(yù)防和治療糖尿病的作用。此外，糖尿病患者多有血脂升高的癥狀，而TG、TC含量可反映機體內(nèi)血脂水平，有效控制二者含量，能夠防止糖尿病及并發(fā)癥的惡化，故降低二者水平可反應(yīng)藥物對糖尿病的治療效果[27-28]。以上氧化應(yīng)激指標(biāo)和血脂指標(biāo)的改善均能說明藥物對糖尿病模型的治療作用。

本論文研究顯示，俄色葉水提物可有效恢復(fù)糖尿病小鼠體重增長，降低血糖水平，提高糖耐受量，且呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系，還可提高SOD、GSH-Px活性，降低 NO、MDA、TG、TC 含量，對 AST、ALT 等指標(biāo)無影響。說明俄色葉水提物對糖尿病模型小鼠有降血糖作用，其作用與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，且對肝功無影響。

本研究樣品采用常規(guī)茶飲方式制備所得，降血糖效果良好且劑量較低，說明俄色葉作為日常茶飲，具有輔助糖尿病患者降血糖的潛力，可為下一步俄色葉資源的開發(fā)與利用提供試驗依據(jù)及廣闊前景。