桂花黃酮類化合物體內(nèi)外抗氧化活性的研究

包騏林，王丹，陸葵青，申雨燕，周明明，李云，*

（1.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，四川成都610041；2.鄭州市中心醫(yī)院，河南鄭州450000）

桂花（Osmantus fragrans）是木犀科木犀屬小喬木，是我國特產(chǎn)的珍貴芳香觀賞花卉，其花氣味清香有很好的食用以及藥用價(jià)值[1]。四川地區(qū)是我國桂花的原產(chǎn)地之一，長期以來將桂花作為觀賞樹種用于園林綠化[2]。本次研究所使用的桂花為常見品種——日香桂，采摘自四川江油萬畝桂花產(chǎn)業(yè)園。該產(chǎn)業(yè)園桂花資源豐富，但對(duì)其的加工利用除傳統(tǒng)的曬制，泡制以外，在其它深加工方面有限。而桂花中含有黃酮、多糖、脂肪酸、酚類等多種生物活性成分[3-5]。其中黃酮化合物含量豐富[6-7]，根據(jù)多種研究表明，黃酮具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂、治療心血管疾病等多種生理活性作用[8-11]。目前對(duì)桂花中黃酮類化合物的研究大部分集中于提取、含量測(cè)定等方面，對(duì)其體內(nèi)外抗氧化活性的研究有限。本次研究以桂花黃酮清除自由基和對(duì)鐵離子的還原能力為指標(biāo)評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性水平，以建立D-半乳糖致亞急性衰老小鼠模型為研究對(duì)象，探究桂花黃酮類化合物在機(jī)體內(nèi)的抗氧化能力，為進(jìn)一步開發(fā)利用四川江油萬畝桂花產(chǎn)業(yè)園中桂花資源以及為當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展拓展新方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桂花：品種為日香桂，采摘于江油市萬畝桂花產(chǎn)業(yè)園。

亞硝酸鈉、過硫酸鉀：成都市科龍化工試劑廠；硝酸鋁：天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；蘆?。罕本┧魅R寶科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、D-半乳糖：美國Sigma公司；總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所；其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

SPF級(jí)雄性昆明種小鼠50只，體重25g～30 g，8周齡，購自成都達(dá)碩生物科技有限公司，動(dòng)物合格證：SCXK（川）2014-028。

HSY-SP電熱恒溫水浴箱：北京市永光明醫(yī)療器械廠；GZD-D400-BS-Ⅱ電熱恒溫干燥器：上海越近醫(yī)療器械廠；Multiskan GO自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀：美國Thermo Fisher科技有限公司；Thermo ST16低溫高速離心機(jī)：美國Thermo Fisher科技有限公司；ICC50HD顯微鏡：德國Leica Microsystems有限公司；HHSYZL-Ni電熱恒溫水浴箱：北京長風(fēng)儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 桂花黃酮的提取

新鮮桂花用烘箱烘干，粉碎，于干燥器中常溫保存。采用乙醇回流法提取桂花中的黃酮類化合物，稱取一定質(zhì)量的桂花干粉，按照料液比140（g/mL）加入60%的乙醇，回流提取3 h，提取溫度為70℃，過濾得濾渣后重復(fù)提取濾渣一次，合并濾液得到桂花黃酮提取液，于70℃在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回流乙醇并濃縮，得到桂花黃酮溶液。

1.2.2 桂花中黃酮化合物含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，用30%乙醇溶解，將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液 0、1、2、3、4、5 mL 分別移入 10 mL 容量瓶中，各加入0.4 mL的5%NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min后加入10%Al（NO3）3溶液0.4 mL，混勻，放置6 min；最后加入4%NaOH溶液4 mL，混勻，用30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，室溫放置10 min后在波長510 nm處測(cè)定吸光度，空白參比溶液為30%乙醇溶液。橫坐標(biāo)（X）為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度C，縱坐標(biāo)（Y）為吸光度A，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到回歸方程。取1 mL的桂花黃酮溶液置于10 mL容量瓶中，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的方法，測(cè)定吸光度，按照回歸方程計(jì)算出樣品桂花溶液中總黃酮的含量。

1.2.3 清除DPPH自由基的能力的測(cè)定[12]

準(zhǔn)確稱取20 mgDPPH，用少量無水乙醇溶解后，移至250 mL容量瓶中用無水乙醇定容，配置成濃度為2×10-4mol/L 的溶液。移取 100 μL 濃度為 2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液于96孔板中，之后加入不同濃度的桂花黃酮溶液100 μL。混勻后在室溫下避光反應(yīng)30 min于517 nm處測(cè)定各孔吸光度，以同樣濃度系列的抗壞血酸為陽性對(duì)照，以同樣的方法測(cè)定吸光度值。按照以下公式計(jì)算DPPH·的清除率。

式中：A0為 100 μLDPPH 溶液+100 μL 無水乙醇的吸光度值；A1為100 μLDPPH 溶液+100 μL 桂花黃酮溶液的吸光度值；A2為100 μL桂花黃酮溶液+100 μL無水乙醇的吸光度值。

1.2.4 清除ABTS+自由基的能力的測(cè)定[13]

將7.4 mmol/L的ABTS與2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合，于室溫下避光放置12 h～16 h制得ABTS+儲(chǔ)備液。使用前用無水乙醇稀釋，得在734 nm下測(cè)量吸光度在0.7±0.02之間的ABTS+工作液。以50%的乙醇為溶劑稀釋樣品，取2.4 mL ABTS+工作液與0.6 mL不同濃度樣品，混勻，室溫反應(yīng)6 min后迅速測(cè)定734 nm處各管的吸光度值。以抗壞血酸為陽性對(duì)照。根據(jù)以下公式計(jì)算ABTS+·的清除率。

式中：A0為50%的無水乙醇為空白加入ABTS+工作液后測(cè)定的吸光度值；A1為不同濃度的待測(cè)樣品與ABTS+工作液反應(yīng)后的吸光度值。

1.2.5 還原能力的測(cè)定[14]

在試管中依次加入1 mL不同濃度的桂花黃酮溶液，再加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液和2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽溶液（pH=6.6），混勻后于50℃恒溫水浴20 min后急速冷卻。加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻后在3 000 r/min離心10 min，取上清液5 mL，加入5 mL蒸餾水和1%氯化鐵溶液后震蕩混勻，靜置10 min，于700 nm波長處測(cè)定各管吸光度值。根據(jù)吸光度值大小評(píng)價(jià)物質(zhì)的還原能力，所測(cè)吸光度越大，還原能力越強(qiáng)。

1.2.6 桂花黃酮體內(nèi)抗氧化作用研究

將50只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，按體重隨機(jī)分為5組，分別為空白組、模型組、桂花黃酮高、中、低劑量組。除空白組以外，其余各組按照小鼠體重以500 mg/kg的劑量與頸背部皮下注射D-半乳糖，空白組小鼠注射等量生理鹽水。造模同時(shí)，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組經(jīng)口灌胃分別給予不同劑量的桂花黃酮溶液，空白組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。劑量設(shè)計(jì)與分組如表1所示。

表1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)及分組Table 1 Dose design and grouping in animal exprements

按照上述的方法，連續(xù)培養(yǎng)6周后，小鼠禁食不禁水24 h，摘取眼球取血后立即頸椎脫臼處死，迅速剖出肝臟、腎臟、脾臟、腦組織稱重并計(jì)算其臟器系數(shù)，計(jì)算公式為：

取小鼠部分肝臟，固定、進(jìn)行蘇木精-伊紅染色（Hematoxylin-eosin staining，HE），觀察肝細(xì)胞排列形態(tài)大小間隙等。按照相應(yīng)試劑盒說明，測(cè)定小鼠肝、腎組織勻漿中蛋白質(zhì)、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化物酶（GSH）的活力以及小鼠血清和肝、腎組織勻漿中丙二醛（MDA）的含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)蘆丁濃度和吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲，如圖1，得到濃度和吸光度值得回歸方程：Y=0.574 3X+0.004 9，（R2=0.999）。再測(cè)定桂花黃酮溶液的吸光度值，根據(jù)回歸方程得到其中桂花提取液中總黃酮的濃度。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standrad curve of rutin

2.2 DPPH自由基清除試驗(yàn)

DPPH自由基清除能力見圖2。

圖2 對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.2 Scavenging ability of DPPH radical

由圖2可知，桂花總黃酮清除DPPH自由基的能力在0～0.08 mg/mL濃度范圍內(nèi)，隨濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)濃度大于0.08 mg/mL時(shí)，清除率增長較緩慢，逐漸趨于穩(wěn)定接近于抗壞血酸清除DPPH自由基的能力。說明桂花總黃酮具有一定清除DPPH自由基的能力。DPPH·是一種以氮為中心的自由基，易溶于醇溶液并呈紫色，當(dāng)加入自由基清除劑時(shí)，DPPH自由基與其發(fā)生反應(yīng)，可以通過在517 nm處比較溶液吸光值的變化評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力。劉軍海等[15]在評(píng)價(jià)桂花殘?jiān)锌傸S酮抗氧化能力時(shí)發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)桂花總黃酮清除DPPH自由基的能力逐漸增強(qiáng)并且趨于穩(wěn)定與本試驗(yàn)相同，但當(dāng)桂花殘?jiān)傸S酮的質(zhì)量濃度達(dá)到0.06 mg/mL時(shí)其抗氧化能力優(yōu)于抗壞血酸與本試驗(yàn)不同，推測(cè)是因?yàn)楣鸹ㄆ贩N不同，提取黃酮的條件方式不同，提取原料不同所造成。郭嬌嬌等[16]研究表明桂花總黃酮提取物有良好的DPPH自由基清除能力與本試驗(yàn)所得結(jié)果一致。

2.3 ABTS+自由基清除試驗(yàn)

ABTS+自由基清除能力見圖3。

圖3 對(duì)ABTS+自由基的清除能力Fig.3 Scavenging ability of ABTS+radical

由圖3可知，桂花黃酮對(duì)ABTS+自由基的清除效果與其濃度大小緊密相關(guān)，隨著桂花黃酮濃度的升高，對(duì)ABTS+自由基的清除能力也迅速增強(qiáng)。當(dāng)桂花黃酮濃度低于0.12 mg/mL，隨著濃度的增加，對(duì)ABTS+自由基的清除能力也迅速增加，當(dāng)濃度大于0.12 mg/mL時(shí)，桂花總黃酮對(duì)ABTS+自由基的清除能力增長緩慢逐漸接近于抗壞血酸清除ABTS+自由基的能力，并趨于穩(wěn)定。說明桂花總黃酮化合物能夠有效清除ABTS+自由基。

2.4 還原能力

還原能力與氧化活性之間有顯著的相關(guān)性，物質(zhì)的還原能力越強(qiáng)，越不容易被氧化，表示抗氧化能力越強(qiáng)，結(jié)果見圖4。

圖4 桂花總黃酮的還原能力Fid.4 Reducing capacity of TFOF

由圖4可知，桂花總黃酮化合物在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨桂花黃酮濃度的增加，對(duì)鐵離子的還原能力越強(qiáng)，說明桂花黃酮具有良好的還原能力。

2.5 體內(nèi)抗氧化作用研究

2.5.1 桂花黃酮對(duì)小鼠體征和臟器系數(shù)的影響

與正常小鼠對(duì)比，模型組小鼠明顯毛色稀疏且無光澤毛發(fā)易脫落，行動(dòng)遲緩，有嗜睡現(xiàn)象；而正常小鼠毛發(fā)濃密有光澤，行動(dòng)更敏捷。其余3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，高、中劑量組與正常組無明顯差別，而低劑量組毛色明顯稀疏灰暗。

臟器系數(shù)能初步反應(yīng)動(dòng)物機(jī)體受到氧化損傷的程度，臟器系數(shù)與機(jī)體的衰老程度相關(guān)[17]。桂花黃酮對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響見表2。從表2可知，與空白組比較，模型組小鼠肝臟、腎臟、胸腺、腦系數(shù)都略有下降，其中肝臟、脾和胸腺系數(shù)與空白對(duì)照組相比均顯著降低（P＜0.05），說明D-半乳糖抑制了小鼠各臟器組織的生長并且使肝臟、脾、胸腺受到一定程度的損傷。與模型組相比，桂花黃酮高、中、低劑量組的各臟器系數(shù)略高于模型組，其中桂花黃酮高劑量組的肝臟和胸腺系數(shù)顯著增高，具有極顯著性差異（P＜0.01）。由此可以說明桂花黃酮在一定程度上可以修復(fù)D-半乳糖所致的損傷作用，或可以阻止D-半乳糖對(duì)小鼠生長的抑制作用。

表2 桂花黃酮對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響Table 2 Effects of TFOF on organs indexes in mice %

2.5.2 桂花黃酮對(duì)小鼠血清及臟器中MDA含量的影響

MDA是生物體內(nèi)最具有代表性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，MDA的含量能夠反應(yīng)生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度[18]。桂花黃酮對(duì)小鼠血清及臟器中MDA含量的影響見表3。

表3 桂花黃酮對(duì)小鼠血清及臟器中MDA含量的影響Table 3 Effects of TFOF on MDA contents in mice’s serum，liver and kidney

從表3中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以得出，與空白組相比較，模型組小鼠血清及肝臟組織中MDA的含量升高具有極顯著差異（P＜0.01），并且腎臟組織中MDA含量升高具有顯著差異（P＜0.05）；與模型組相比較，小鼠血清中，桂花高、中、低劑量組MDA含量均低于模型組且具有極顯著性差異（P＜0.01），在肝臟組織中，桂花黃酮中、高劑量組MDA含量較模型組低且具有極顯著性差異（P＜0.01），在腎臟組織中，桂花黃酮高劑量組的MDA含量較模型組極顯著降低（P＜0.01），說明桂花黃酮能降低D-半乳糖致衰小鼠體內(nèi)MDA的含量，降低機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，從而保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性，并且隨桂花黃酮濃度增大，對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用增強(qiáng)。

2.5.3 桂花黃酮對(duì)小鼠血清、肝臟及腎臟組織中SOD活性的影響

SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。SOD在機(jī)體內(nèi)主要清除超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基是自由基鏈鎖反應(yīng)的前生物，SOD可將其除去是避免機(jī)體活性氧大量生成的第一道防線[19]。桂花黃酮對(duì)小鼠血清、肝臟及腎臟組織中SOD活性的影響見表4。

表4 桂花黃酮對(duì)小鼠血清、肝臟及腎臟組織中SOD活性的影響Table 4 Effects of TFOF on the activity of SOD in mice’s serum，liver and kidney

從表4實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，與空白組相比，模型組小鼠的血清，肝臟和腎臟中SOD活性明顯降低，有極顯著性差異（P＜0.01）；與模型組相比，血清中，桂花黃酮高劑量組小鼠SOD活性高于模型組，有極顯著性差異（P＜0.01）；在在肝臟組織中，桂花黃酮中、高劑量組SOD活性較模型組具有顯著差異（P＜0.05）；在腎臟組織中桂花黃酮高劑量組的SOD活性較模型組具有極顯著差異（P＜0.01）。本實(shí)驗(yàn)表明，D-半乳糖可以通過降低小鼠血清、肝臟和腎臟中SOD的活性造成超氧陰離子等自由基在小鼠體內(nèi)大量累積，導(dǎo)致小鼠機(jī)體衰老損傷，而一定濃度的桂花黃酮可以提高小鼠體內(nèi)SOD的活性，清除機(jī)體中的有害物質(zhì)，修復(fù)D-半乳糖對(duì)小鼠機(jī)體造成損傷。

2.5.4 桂花黃酮對(duì)小鼠肝臟和腎臟中GSH的影響

GSH是組織中一種非蛋白的硫基化合物，可以通過硫基和自由基結(jié)合，穩(wěn)定含硫基的酶和防止血紅蛋白等受到氧化損傷[20]。桂花黃酮對(duì)小鼠肝臟和腎臟中GSH的影響見表5。

表5 桂花黃酮對(duì)小鼠肝臟和腎臟中GSH的影響Table 5 Effects of TFOF on the activity of GSH in mice’s liver and kidney μmol/gprot

從表5實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，與空白組相比，模型組小鼠肝臟中GSH活性具有顯著差異（P＜0.05），腎臟中的GSH活性具有極顯著差異（P＜0.01）；與模型組相比較，桂花黃酮高劑量組小鼠肝臟和腎臟組織中GSH活性較模型組增加，且具有顯著性差異（P＜0.05）。表明一定濃度的桂花黃酮可以提高衰老小鼠體內(nèi)GSH的活性，清除機(jī)體內(nèi)多余的自由基，保護(hù)蛋白質(zhì)及相關(guān)抗氧化酶不受自由基的損害，從而維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性。

2.5.5 桂花黃酮對(duì)小鼠肝臟和腎臟組織中GSH-Px活力的影響

GSH-Px在機(jī)體內(nèi)能特異的催化GSH對(duì)過氧化氫的分解，從而阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低MDA的生成從而起到保護(hù)細(xì)胞膜功能和結(jié)構(gòu)的作用[21]。桂花黃酮隨小鼠肝臟和腎臟中GSH-Px的影響見表6。

表6 桂花黃酮隨小鼠肝臟和腎臟中GSH-Px的影響Table 6 Effects of TFOF on the activity of GSH-Px in mice’s liver and kidney U/gprot

如表6所示，與空白組相比，模型組小鼠肝臟組織中的GSH-Px活力下降且具有極顯著差異（P＜0.01），腎臟組織中GSH-Px活性下降且具有顯著差異（P＜0.05）；與模型組小鼠相比，桂花黃酮高劑量組小鼠肝臟組織中GSH-Px活性增加且具有極顯著差異（P＜0.01），桂花黃酮中劑量組小鼠腎臟組織中GSH-Px活性增高具有顯著差異（P＜0.05）并且高劑量組小鼠腎臟組織中GSH-Px活性增高具有極顯著差異（P＜0.01）。表明一定濃度的桂花黃酮可以提高D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠體內(nèi)GSH-Px的活性，增強(qiáng)GSH的功能，減少機(jī)體內(nèi)有害物質(zhì)的堆積，一定程度上修復(fù)D-半乳糖對(duì)小鼠造成的損傷。

2.5.6 小鼠肝組織病理學(xué)觀察

小鼠肝組織病理切片見圖5。

圖5 小鼠肝組織病理切片（100×）Fig.5 Pathological sections of liver in mice（100×）

空白對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞無明顯變化，而模型組小鼠肝臟細(xì)胞形態(tài)排列紊亂，細(xì)胞間隙較大，可見脂肪變性，說明D-半乳糖破壞了小鼠的肝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)。與模型組比較，桂花黃酮中、低劑量組小鼠肝細(xì)胞仍可見脂肪細(xì)胞變性，而桂花黃酮高劑量組小鼠肝細(xì)胞排列整齊，未見脂肪變性。表明桂花黃酮可以改善D-半乳糖致衰老小鼠肝細(xì)胞的形態(tài)，減輕氧化反應(yīng)對(duì)細(xì)胞造成的損害，保護(hù)細(xì)胞正常生理功能，其修復(fù)能力與桂花黃酮的濃度有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究中體外試驗(yàn)采用了DPPH法和ABTS法兩種最常用的評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化性的試驗(yàn)體系以及對(duì)鐵離子的還原能力的測(cè)定，證明了桂花黃酮類化合物具有良好的抗氧化活性，據(jù)此可以將桂花黃酮作為天然抗氧化劑加以開發(fā)利用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，桂花黃酮類化合物能夠修復(fù)D-半乳糖對(duì)小鼠的損傷作用，提高機(jī)體的抗氧化能力，其機(jī)制與清除自由基，提高機(jī)體內(nèi)抗氧化酶活性和降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。本次研究通過較為系統(tǒng)的對(duì)桂花黃酮類化合物在體內(nèi)外抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)為其以后在食品、藥品及保健品方面的應(yīng)用提供了理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。