熱與超聲波對多聚半乳糖醛酸酶的鈍化動力學(xué)

畢秀芳，陳麗伊，趙彩霞，車振明

（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川省食品生物技術(shù)重點實驗室，四川 成都 610039）

果汁是目前最受歡迎的飲料之一，尤其是一些復(fù)合果汁深得消費者喜愛[1-2]。隨著果汁逐漸成為市場的消費熱點，人們對其品質(zhì)的要求也越來越高，而一些內(nèi)源酶的存在會嚴(yán)重影響果汁的品質(zhì)[3]。多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）可以將脫酯果膠酸的α-（1-4）糖苷鍵隨機(jī)水解為小片段，從而降解植物組織，影響果蔬汁的黏度和濁度[4]。雖然傳統(tǒng)的熱處理能有效鈍酶，但同時會造成果蔬汁中一些熱敏性營養(yǎng)成分如VC的損失[5]。非熱處理技術(shù)能提高果蔬汁品質(zhì)并確保安全性，且不會對營養(yǎng)物質(zhì)造成不利影響[6]。如今，國內(nèi)外學(xué)者對食品加工的研究已經(jīng)從傳統(tǒng)的熱處理向非熱處理技術(shù)轉(zhuǎn)化[7]。

超聲波技術(shù)（ultrasound，US）是一項新型的非熱殺菌技術(shù)，能有效殺滅食品中的微生物，并且能保持食品的品質(zhì)[8-9]。其中高場強(qiáng)超聲波是指頻率在20～100 kHz，功率密度在10～1 000 W/cm2范圍內(nèi)的超聲波技術(shù)，在食品加工中最為常用，并受到各國學(xué)者的高度關(guān)注[10-11]，其主要作用原理是空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)[12-13]?，F(xiàn)今，超聲波鈍酶的研究已有較多報道，主要集中在多酚氧化酶[14-15]、過氧化物酶[16-17]、果膠甲基酯酶[18-19]和脂肪氧化酶[20-21]。Ma等[22]研究了不同超聲波條件對PG的激活效果。然而目前對超聲波對PG的鈍化動力學(xué)研究較少，且缺乏熱與超聲波對酶鈍化的相互關(guān)系的報道。因此，本研究以PG為研究對象，設(shè)計了熱與超聲波單獨處理、同時處理、先后處理3 組實驗，研究了不同溫度、不同超聲功率密度對PG的鈍化動力學(xué)。為超聲波鈍化PG提供理論數(shù)據(jù)，并為果蔬汁加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PG（8 600 PGNU/g） 諾維信（中國）投資有限公司；多聚半乳糖醛酸（生物技術(shù)級，純度85%） 源葉生物科技有限公司；D-半乳糖醛酸 北京索萊寶科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）為化學(xué)純，其余試劑均為分析純，購自成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；FMB40制冰機(jī) 上海豫明儀器有限公司；WFJ7200分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；MC-01000228 pH計 成都世紀(jì)方舟科技有限公司；HH-S4水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

DNS試劑：用400 mL蒸餾水溶解3.15 g DNS，逐步加入200 mL NaOH溶液（0.5 mol/L），再加入91 g四水酒石酸鉀鈉、2.5 g苯酚、2.5 g無水亞硫酸鈉，35 ℃溫水浴，不斷攪拌，直至溶液清澈透明。用蒸餾水定容至1 000 mL，保存在棕色瓶中。與二氧化碳隔絕，貯存期為6 個月。

0.5 mol/L的pH 5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液：先分別配制0.5 mol/L的醋酸溶液和醋酸鈉溶液，再將兩者混合至pH 5.0。

0.1 g/100 mL D-半乳糖醛酸溶液、0.5 g/100 mL多聚半乳糖醛酸溶液、PG稀釋液（原酶液稀釋4 000 倍）均用上述醋酸-醋酸鈉緩沖液配制。

1.3.2 酶活力測定

參考周立等[23]的方法，并略作修改。

樣品測定：將0.02 mL PG和0.3 mL 0.5 g/100 mL多聚半乳糖醛酸、0.68 mL醋酸緩沖液（pH 5.0）混合后，在50 ℃下反應(yīng)30 min，然后加入1 mL DNS試劑，在100 ℃下煮沸5 min，冷卻至室溫，再加入8 mL蒸餾水稀釋，用分光光度計測定540 nm波長處的吸光度。PG活力為每分鐘水解D-半乳糖醛酸的質(zhì)量，單位為mg/min。

D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：配制質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/mL的D-半乳糖醛酸溶液，將1 mL不同質(zhì)量濃度的D-半乳糖醛酸溶液與1 mL DNS溶液混合后，100 ℃煮沸5 min，冷卻至室溫，再加入8 mL蒸餾水稀釋。用分光光度計測定540 nm波長處的吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝0.861 4x（R2＝0.992 5）。

1.3.3 PG酶液處理

熱處理：取10 mL酶液于100 mL燒杯中，置于水浴鍋中保溫，當(dāng)酶液中心溫度達(dá)到指定溫度后開始計時，達(dá)到處理時間后取出。水浴溫度分別為35、45、55、65 ℃，水浴時間分別為0.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 min。

超聲波處理：取50 mL酶液于100 mL燒杯中，超聲功率密度分別為242、605 W/cm2和968 W/cm2。脈沖間隔為2 s開2 s關(guān)，超聲頻率為20 kHz，探頭（直徑10 mm）浸入液面深度為2 cm，并采用冰浴，超聲波處理時間分別為2、4、6、8、10、12、14 min。

熱與超聲波同時處理：固定水浴溫度為35 ℃，超聲功率密度分別為242、605 W/cm2和968 W/cm2，超聲波處理時間分別為2、4、6、8、10、12、14 min，其余參數(shù)同上；固定超聲功率密度為605 W/cm2，水浴溫度分別采用25、35、45 ℃，超聲波處理時間分別為2、4、6、8、10、12、14 min，其余參數(shù)同上。

熱與超聲波先后處理：第1組取50 mL酶液于100 mL燒杯中，在35 ℃的水浴鍋中保溫5 min，當(dāng)酶液中心溫度達(dá)到35 ℃開始計時，然后在冰浴條件下進(jìn)行超聲波處理，超聲功率密度為605 W/cm2，超聲時間分別為2、4、6、8、10 min；第2組取50 mL酶液于100 mL燒杯中，先在冰浴條件下進(jìn)行超聲波處理，超聲功率密度為605 W/cm2，超聲時間為5 min，再取10 mL超聲處理后的酶液于100 mL燒杯中，在35 ℃的水浴鍋中保溫2、4、6、8、10 min。

1.3.4 PG活力鈍化動力學(xué)分析

酶活力鈍化一般符合一級動力學(xué)模型（式（1））。

式中：A為處理t min后的酶活力/（mg/min）；A0為對照組酶活力/（mg/min）；k為設(shè)定溫度下的反應(yīng)速率常數(shù)/min－1。

部分轉(zhuǎn)化模型是一級動力學(xué)模型的特例，應(yīng)用于存在穩(wěn)定和不穩(wěn)定形式的物質(zhì)，隨著處理時間的延長，穩(wěn)定形式仍然不變的鈍化過程。其模型公式如式（2）所示。

式中：A∞為延長處理時間后的酶活力/（mg/min）。

均方誤差（mean square error，MSE）計算如式（3）所示。

式中：y為預(yù)測值；y1為實際值；n為觀測個數(shù)；p為參數(shù)個數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗重復(fù)兩次，使用Origin 8.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計并繪圖，數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析（analysis of variance，ANOVA），以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對PG活力的影響

圖 1 溫度對PG活力的影響Fig. 1 Effect of heat treatment temperature on PG activity

圖1為溫度對PG的鈍化效果，并用動力學(xué)模型擬合。PG對熱敏感，處理5 min時酶活力迅速下降，但在35 ℃下處理30 min仍有82.91%的殘留酶活力。而隨著溫度升高，PG的鈍化效果逐漸增強(qiáng)。55 ℃和65 ℃下處理30 min，PG殘留活力分別為18.54%、5.01%。在4 個溫度下，隨著處理時間從15 min延長至30 min，酶活力未發(fā)生顯著性變化。

部分轉(zhuǎn)化模型能夠較好擬合溫度對PG的鈍化效果（R2＞0.96，MSE＜5.0）。通過模型擬合計算得到PG的不可鈍化部分A∞的值分別為82.00%、79.23%、25.36%、5.29%（表1）。說明當(dāng)溫度大于45 ℃時，溫度對PG活力的影響很大。此外，處理15～30 min酶活力未發(fā)生顯著性變化，該結(jié)果表明PG存在兩個形式：不耐熱（PG2）和耐熱（PG1）形式。PG1是由PG2與熱穩(wěn)定糖蛋白β-亞基結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)形成的二聚體，具有較強(qiáng)的耐熱性，隨著處理溫度的升高，PG1可不同程度地向PG2轉(zhuǎn)化[24]。因此，殘留的PG活力可能是由于熱穩(wěn)定PG1的存在，而PG活力隨著處理溫度升高而下降可能是由于PG1轉(zhuǎn)化成了熱不穩(wěn)定的PG2。高溫雖能更好地鈍化PG，但可能導(dǎo)致果蔬汁中的營養(yǎng)成分流失。由于在35 ℃條件下酶活力變化不大，因此選擇35 ℃與超聲波結(jié)合作進(jìn)一步研究。

表 1 熱和超聲波對PG鈍化動力學(xué)參數(shù)Table 1 Estimation of inactivation kinetic parameters of PG under heat and ultrasonic treatment conditions

2.2 冰浴條件下不同超聲功率密度對PG活力的影響

圖 2 冰浴條件下不同超聲功率密度對PG活力的影響Fig. 2 Effect of ultrasonic power on PG activity under ice bath condition

如圖2所示，冰浴條件下，3 種超聲功率密度下，隨著處理時間延長，PG活力均呈下降的趨勢。在242 W/cm2和605 W/cm2超聲功率密度下處理PG稀釋液，對其活力影響不大，處理30 min后殘留酶活力分別為93.25%、95.49%。隨著處理功率密度提高到968 W/cm2，PG活力顯著下降，但968 W/cm2處理12 min后殘留酶活力仍有83.54%。單獨超聲波鈍化PG遵循部分轉(zhuǎn)化模型公式（R2＞0.90，MSE＜0.1），求得PG的不可鈍化部分A∞的值在78%～96%之間（表1）。

超聲波對酶的鈍化作用主要歸因于空化效應(yīng)，是指液體中的微小氣泡（氣泡或氣穴）在聲場的作用下被激活，表現(xiàn)為這些氣泡（空化核）的振蕩、生長、收縮及崩潰等一系列動力學(xué)過程[25]。氣泡收縮及崩潰瞬間，呈現(xiàn)出局部高溫（＞5 000 K）和高壓（50 MPa），因而導(dǎo)致酶失活[26]。超聲功率密度的增加也增強(qiáng)了空化效應(yīng)，但可能由于冰浴條件抑制了這一情況的發(fā)生，因而鈍化效果不明顯。由圖2可知，605 W/cm2條件下酶活力變化最小，因此選擇605 W/cm2功率密度做進(jìn)一步的研究。

2.3 熱與超聲波同時處理對PG活力的影響

2.3.1 35 ℃下不同超聲功率密度對PG活力的影響

圖 3 35 ℃下不同超聲功率密度對PG活力的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic power on PG activity at 35 ℃

圖3為35 ℃下不同超聲功率密度對PG的鈍化效果，隨著處理時間延長，PG殘留活力逐漸下降，超聲功率密度由242 W/cm2增加到605 W/cm2，PG活力發(fā)生顯著性下降（P＜0.05），但從605 W/cm2上升至968 W/cm2時，PG活力差異不顯著（P＞0.05）。242、605、968 W/cm23 種功率密度處理PG稀釋液16 min，PG活力分別下降了29.56%、86.28%、93.10%。一級動力學(xué)模型能夠較好擬合此條件下對PG的鈍化效果（R2＞0.94，MSE＜8.3），但242 W/cm2處理PG的鈍化曲線則符合部分轉(zhuǎn)化模型（R2＝0.972，MSE＝0.38）。相對冰浴條件下的超聲波處理，與35 ℃水浴結(jié)合明顯增強(qiáng)了超聲波對PG的鈍化效果，表明兩者結(jié)合處理對PG的鈍化有協(xié)同作用。超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)使酶的二級、三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致酶失活[27-28]。王文宗等[14]也研究表明，超聲波產(chǎn)生的能量可能導(dǎo)致維持酶分子二級結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂，導(dǎo)致構(gòu)象變化，從而抑制酶促反應(yīng)。溫度的結(jié)合可能促進(jìn)了這一作用，但具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步進(jìn)行研究探索。另外，考慮到實際生產(chǎn)成本以及儀器使用壽命，可選用605 W/cm2功率密度結(jié)合熱處理。

2.3.2 605 W/cm2的超聲功率密度下不同溫度對PG活力的影響

不同溫度結(jié)合605 W/cm2的超聲波處理對PG的鈍化效果如圖4所示。可以看出，隨著時間延長，PG殘留活力顯著下降（P＜0.05），處理16 min后殘留活力均在30%以下。并且隨著溫度升高，鈍化效果逐漸增強(qiáng)。相比單獨的熱處理，與超聲波結(jié)合可以觀察到兩種形式的PG均發(fā)生失活，表明兩者結(jié)合使用顯著增強(qiáng)了對PG的鈍化效果。

圖 4 605 W/cm2的超聲功率密度下不同溫度對PG活力的影響Fig. 4 Effect of treatment temperature on PG activity with ultrasonic treatment at 605 W/cm2 powder density

此條件下的鈍化曲線可用一級動力學(xué)進(jìn)行擬合（R2＞0.91，MSE＜6.7）。動力學(xué)參數(shù)如表1所示，隨著溫度升高，鈍化速率常數(shù)k從0.05 min-1增加到0.15 min-1，鈍化效果逐漸增強(qiáng)。前人也報道過熱與超聲波結(jié)合對PG的鈍化效果。Terefe等[29]研究顯示，在20 kHz，60～75 ℃，80%能量條件下，蕃茄汁PG的失活率增加了2.3～4.0倍。Vercet等[30]發(fā)現(xiàn)20 kHz、振幅117 μm、200 kPa、70 ℃處理1 min使PG的活力降低62%。這種現(xiàn)象可以歸因于熱與超聲波的協(xié)同效應(yīng)，在實驗條件下，單獨的熱或超聲處理只導(dǎo)致PG2失活。而在加熱過程中，超聲處理可能導(dǎo)致PG1分解成不穩(wěn)定的PG2和熱穩(wěn)定的β-亞基，隨后通過加熱和超聲處理的協(xié)同作用使PG2失活[29,31]。

2.4 熱與超聲波先后處理對PG活力的影響

熱與超聲波結(jié)合處理顯著增強(qiáng)了對PG的鈍化效果，因此，為進(jìn)一步研究熱與超聲波兩者之間對PG鈍化的相互關(guān)系，本實驗研究了先熱處理再超聲波處理及先超聲波處理再熱處理對PG活力的影響。圖5a為35 ℃水浴5 min后用605 W/cm2冰浴超聲處理對PG活力影響，圖5b為605 W/cm2冰浴超聲5 min后35 ℃水浴處理對PG活力的影響。兩組處理對PG活力影響不大，其殘留活力均在85%以上。在本研究中，35 ℃水浴和605 W/cm2超聲波單獨處理分別造成18.00%、3.90%的PG失活，兩者同時處理能鈍化70%～90%的PG，并且隨著時間延長能使其完全鈍化，而兩者先后處理只能使PG活力降低15%左右。說明熱與超聲波先后處理只能表現(xiàn)出兩者中對PG最大的鈍化效果，僅使PG2失活。因此，只有在熱與超聲波同時作用的前提下，才能表現(xiàn)出兩者的協(xié)同效應(yīng)，使PG1轉(zhuǎn)化成PG2與β-亞基，從而達(dá)到更好的鈍化效果。

圖 5 熱與超聲波先后處理對PG活力的影響Fig. 5 Effect of combination sequence of heat and ultrasonic treatment on PG activity

3 結(jié) 論

實驗結(jié)果表明，單獨的熱（≤45 ℃）或超聲波處理對PG鈍化效果不明顯，其殘留活力均在80%以上。而兩者同時處理PG酶液，表現(xiàn)出顯著的協(xié)同效應(yīng)，能更好鈍化PG。在20 kHz、35 ℃、605 W/cm2功率密度條件下處理16 min可使酶活力降至13.72%。通過熱與超聲波先后處理酶液的實驗結(jié)果得出，只有在兩者同時作用的前提下，才能表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，達(dá)到更好的鈍化效果。以上實驗結(jié)果不僅為超聲波鈍化PG提供了理論數(shù)據(jù)，也為果蔬汁加工提供了參考。