• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    Berthelot比色法測定γ-氨基丁酸含量的實驗條件優(yōu)化

    2020-05-21 04:19:12閆朝陽馬鈺柯金凱旋王元秀
    關(guān)鍵詞:冰浴顯色劑比色法

    閆朝陽,李 旭,馬鈺柯,金凱旋,王元秀

    (濟南大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東 濟南 250022)

    γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一種天然的非蛋白質(zhì)氨基酸,廣泛存在于動、植物和微生物中[1]。在哺乳動物體內(nèi),GABA作為重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[2],參與多種代謝活動,具有多種功效[3-4],因此與之相關(guān)的研究成果很多。

    GABA的檢測方法主要有高效液相色譜(HPLC)法、Berthelot比色法、紙電泳法、紙層析法、氨基酸分析法等[5-10]。國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的GABA檢測方法是HPLC法,主要是利用鄰苯二甲醛與GABA發(fā)生柱前衍生反應(yīng),再利用紫外反相HPLC來測定GABA的含量。HPLC法的檢測精度、準(zhǔn)確度都很高,但檢測過程繁瑣、費時,不適合大批量GABA樣品的檢測[11-12]。Berthelot比色法是利用苯酚(C6H5OH)和次氯酸鈉(NaClO)與GABA的游離氨發(fā)生顯色反應(yīng)來檢測GABA的含量,檢測的靈敏度較高,簡單易行,可快速檢測大批量GABA樣品[13-14]。相比之下,紙電泳法、紙層析法測定GABA含量的準(zhǔn)確度太低[15-17],氨基酸分析法與HPLC法優(yōu)、缺點類似[18-19],所以,Berthelot比色法是檢測GABA含量最方便、快捷、易操作的方法[20-21]。李秀娟等[22]對Berthelot比色法中苯酚、次氯酸鈉的用量進行了優(yōu)化,但未對加熱溫度、沸水浴時間、冰浴時間等因素進行研究。趙國群等[23]嘗試建立一種快速測定GABA濃度的方法,利用乙醛酸、琥珀酸和溴甲酚綠能夠與GABA的游離氨發(fā)生顯色反應(yīng)的原理,制成了由不同濃度的乙醛酸、琥珀酸、溴甲酚綠組成的混合顯色劑,在波長為617 nm處檢測GABA的濃度,但所使用的顯色劑毒性很大,且檢測精度較低。本文中通過顯色劑的組成含量、加熱時間、加熱溫度、冰浴時間的單因素與響應(yīng)面實驗優(yōu)化Berthelot比色法,并將優(yōu)化后的Berthelot比色法測定結(jié)果與HPLC法的測定結(jié)果進行t檢驗,比較二者數(shù)據(jù)的差異性。

    1 實驗材料與儀器

    1.1 實驗試劑

    實驗所用試劑包括:γ-氨基丁酸(GABA),分析純,上海麥克林生化科技有限公司;苯酚(C6H5OH),分析純,天津大茂化學(xué)試劑廠;次氯酸鈉(NaClO),分析純,天津市科密歐試劑有限公司;硼酸(H3BO3),分析純,天津大茂化學(xué)試劑廠;乙醇(C2H5OH),分析純,浙江中山化工集團有限公司;鄰苯二甲醛(OPA),分析純,天津市科密歐試劑有限公司;乙腈(C2H3N),色譜純,天津大茂化學(xué)試劑廠;乙酸鈉(CH3COONa),分析純,天津大茂化學(xué)試劑廠;甲醇(CH3OH),色譜純,天津大茂化學(xué)試劑廠;巰基乙醇(C2H6OS),分析純,天津市科密歐試劑有限公司。

    1.2 實驗儀器

    實驗所需儀器包括:UV2600型紫外可見分光光度計,日本島津公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋,上海百典儀器有限公司;PHS-3B型酸度計,上海雷磁儀器廠;YP2102型電子天平,上海光正醫(yī)療儀器有限公司;FA1104型分析天平,上海精科實業(yè)有限公司;Therm-3000型高效液相色譜儀,美國賽默飛公司。

    2 實驗方法

    2.1 GABA樣品溶液的配制

    用分析天平準(zhǔn)確稱取3.00 mg的GABA樣品,溶解后倒入100 mL容量瓶中定容,4 ℃下避光保存,作為GABA的待測樣品溶液。

    2.2 HPLC法測定[11-12]

    2.2.1 GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    準(zhǔn)確稱取1 mg的GABA標(biāo)準(zhǔn)樣品,配制成質(zhì)量濃度為0.1 g/L的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液,在4 ℃下避光保存。應(yīng)用時將該溶液稀釋至設(shè)定的濃度,將稀釋溶液過0.22 μm微孔濾膜后,在4 ℃下避光保存。

    2.2.2 衍生劑的配制

    向1 mL乙腈中加入0.1 mg OPA,溶解后再加入130 μL的C2H6OS,用濃度為0.4 mol/L的H3BO3緩沖溶液至10 mL容量瓶定容;將該溶液過0.22 μL微孔濾膜,4 ℃下避光保存。

    2.2.3 柱前衍生反應(yīng)

    取500 μL的GABA稀釋液,加入50 μL OPA衍生劑,振蕩后靜置10 s,然后將該溶液過0.22 μm微孔濾膜后進樣。

    2.2.4 色譜條件

    色譜柱采用C18柱。

    流動相A為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%、pH為(7.2±0.2)的乙酸鈉溶液。流動相B為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%、pH為(7.2±0.2)的乙酸鈉溶液、乙腈、甲醇(三者體積比為1 ∶2 ∶2)混合后過濾備用。梯度洗脫順序見表1。

    表1 色譜流動相梯度洗脫表

    以GABA稀釋液的響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    2.2.5 GABA樣品的測定

    取GABA樣品溶液過0.22 μm微孔濾膜后進樣,按照設(shè)置的色譜條件進行梯度洗脫,重復(fù)14次,得到HPLC法測試數(shù)據(jù)。

    2.3 Berthelot比色法測定

    2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    將配制的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g/L,然后各取0.5 mL加入pH為9.0、濃度為0.2 mol/L的H3BO3緩沖液0.2 mL, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的C6H5OH溶液1 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的NaClO溶液0.4 mL,充分振蕩后沸水浴加熱10 min,之后迅速在冰水浴中冷卻20 min,待出現(xiàn)藍綠色后再加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液2 mL,以GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白對照組,在波長為630 nm處測定吸光度(OD)。以測定的OD值為縱坐標(biāo),GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[24]。之后檢測GABA樣品溶液14次,并記錄實驗數(shù)據(jù)。

    采用t檢驗驗證2種方法的測定結(jié)果是否具有顯著性差異,比較測試數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差、方差、平均值。

    2.4 Berthelot比色法反應(yīng)條件的優(yōu)化

    為了避免溶液體積變化對實驗結(jié)果的影響,選用相同體積、不同濃度的C6H5OH、NaClO、乙醇溶液來探究顯色劑組成含量對比色反應(yīng)的影響,并且以GABA溶液的平均OD值作為優(yōu)化實驗的對照。

    2.4.1 單因素實驗

    采用單因素實驗[25-27]研究了C6H5OH質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%,NaClO質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%,乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%,加熱溫度分別為65、70、75、80、90、95、100 ℃,加熱時間分別為4、6、8、10、12、14、16 min,冰浴時間分別為5、10、15、20、25、30、35 min等實驗條件對Berthelot比色法顯色反應(yīng)的影響。

    2.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

    根據(jù)單因素實驗的結(jié)果,通過Plackett-Burman實驗,確定了加熱溫度、加熱時間、冰浴時間3個因素對比色反應(yīng)的影響較為顯著,所以選擇這3個因素,利用軟件Design-Expert 8.0,進行Box-Benhnken實驗設(shè)計,其因素水平見表2。

    表2 Box-Benhnken實驗因素水平表

    采用t檢驗驗證優(yōu)化后Berthelot比色法與HPLC法檢測數(shù)據(jù)是否具有顯著性差異,比較測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差、方差、平均值。

    3 結(jié)果分析

    3.1 HPLC法檢測結(jié)果

    HPLC法測定GABA含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=428.71x+0.927(相關(guān)系數(shù)的平方r2=0.999)。測試數(shù)據(jù)見表3。經(jīng)過計算,用HPLC法測試得到的γ-氨基丁酸的質(zhì)量濃度的平均值為0.029 5 g/L,方差為1.277×10-6g2/L2,標(biāo)準(zhǔn)差為0.003 53 g/L,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.22%。

    圖1 高效液相色譜法測定γ-氨基丁酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

    表3 高效液相色譜法測定γ-氨基丁酸數(shù)據(jù)

    3.2 未優(yōu)化的Berthelot比色法檢測結(jié)果

    3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

    未優(yōu)化的Berthelot比色法測定GABA含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=3.99x-0.021 5(r2=0.992)。測試數(shù)據(jù)見表4。經(jīng)過計算,該法測定的GABA質(zhì)量濃度的平均值為0.030 2 g/L; 方差為2.290×10-6g2/L2,標(biāo)準(zhǔn)差為0.001 13 g/L,RSD為3.74%。

    圖2 未優(yōu)化的Berthelot比色法測定γ-氨基丁酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

    表4 未優(yōu)化的Berthelot比色法測定γ-氨基丁酸數(shù)據(jù)

    該組數(shù)據(jù)的平均OD值為0.99,作為優(yōu)化實驗的對照OD值。

    3.2.2 HPLC法和未優(yōu)化的Berthelot比色法數(shù)據(jù)的比較

    首先對HPLC法和未優(yōu)化的Berthelot比色法測定的結(jié)果進行t檢驗。假設(shè)H0,2組數(shù)據(jù)存在顯著性差異,進行t檢驗,顯著性水平P值為0.551,遠遠大于0.05,拒絕H0,因此2組數(shù)據(jù)不存在顯著性差異,同時2組數(shù)據(jù)的質(zhì)量濃度平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、方差相近,說明數(shù)據(jù)的差異較小。

    3.3 單因素實驗優(yōu)化實驗

    3.3.1 顯色劑中C6H5OH含量對OD的影響

    圖3 顯色劑中苯酚含量對吸光度的影響

    顯色劑中C6H5OH含量對OD的影響如圖3所示。由圖可知,隨著C6H5OH含量的增大,GABA溶液的OD值增大,C6H5OH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%時對應(yīng)的OD值與0.99相近,因此確定C6H5OH的質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%。

    3.3.2 顯色劑中NaClO對OD的影響

    顯色劑中NaClO含量對OD的影響如圖4所示。由圖可知,隨著NaClO含量的增大,GABA溶液的OD值增大,NaClO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%時對應(yīng)的OD值與0.99相近,由此確定NaClO的質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%。

    圖4 顯色劑中次氯酸鈉含量對吸光度的影響

    3.3.3 顯色劑中乙醇含量對OD的影響

    顯色劑中乙醇含量對OD的影響如圖5所示。由圖可知,隨著乙醇含量的增大,GABA溶液的OD值在0.09~0.10之間波動變化,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時其OD值與0.99相近,由此確定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。

    圖5 顯色劑中乙醇含量對吸光度的影響

    3.3.4 加熱溫度對OD的影響

    加熱溫度對OD的影響如圖6所示。由圖可知,隨著加熱溫度的升高,GABA溶液的OD值先增大,后趨于平穩(wěn),當(dāng)溫度為90~100 ℃時,其OD值與0.99相近,由此確定最低加熱溫度為90 ℃。

    圖6 加熱溫度對吸光度的影響

    3.3.5 加熱時間對OD的影響

    加熱時間對OD的影響如圖7所示。由圖可知,隨著加熱時間的延長,GABA溶液的OD值先增大后減小,加熱時間為6~10 min時其OD值與0.99相近,由此確定最短加熱時間為6 min。

    3.3.6 冰浴時間對OD的影響

    冰浴時間對OD的影響如圖8所示。由圖可看出,隨著冰浴時間的延長,GABA溶液的OD值先增大后平緩,之后又減小,冰浴時間為10~25 min時其OD值與0.99相近,由此確定最短冰浴時間為10 min。

    3.4 響應(yīng)面實驗結(jié)果

    響應(yīng)面優(yōu)化實驗共設(shè)計了如表5所示的17個子實驗,中心試驗進行5次,用來估計實驗的誤差,其余的實驗點均為析因點。具體設(shè)計組合及實驗結(jié)果見表5。

    圖8 冰浴時間對吸光度的影響

    表5 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

    3.4.1 數(shù)據(jù)分析

    采用Design-Expert軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析,然后對數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,獲得加熱溫度T、加熱時間t1、冰浴時間t2的二次多項回歸方程為

    式中IOD為吸光度。

    由回歸方程的方差分析可知,比色反應(yīng)所得到的二次多項回歸方程的相關(guān)系數(shù)的平方r2=0.998,數(shù)值接近1,表明擬合良好,實驗誤差較小。該模型的P<0.000 4,說明模型的顯著性非常明顯,實驗可行; 同時失擬項的P=0.966遠大于0.100 0,構(gòu)建的響應(yīng)面模型失擬不顯著,能夠很好地描述比色反應(yīng)中反應(yīng)溫度、加熱時間、冰浴時間與OD的關(guān)系。當(dāng)模型的有效信號與噪聲的比值(RSN)大于4.00時即視為合理,本文中構(gòu)建模型的RSN為11.899,說明模型預(yù)測作用較好。在響應(yīng)面模型中,根據(jù)P值的大小,綜合各水平可以得出結(jié)論,即響應(yīng)面中3個水平因素對OD的影響由大到小的順序為加熱溫度、加熱時間及冰浴時間。

    3.4.2 響應(yīng)面立體圖分析

    對回歸方程方差進行分析,利用Design-Expert軟件畫出加熱時間、加熱溫度、冰浴時間對比色反應(yīng)OD影響的響應(yīng)面圖(見圖9—11),分析2個因素之間的交互作用對比色反應(yīng)OD的影響。比較各組響應(yīng)面及等高線可知,提取率所選范圍內(nèi)存在的極值就是響應(yīng)面的最高點,同時也是等高線橢圓的中心,同時利用等高線的形狀來反映各組條件交互作用強弱,等高線越趨向橢圓表示交互作用越強,越趨向圓形表示交互作用越弱。

    圖9 加熱時間和加熱溫度對吸光度的交互影響曲面圖

    圖10 冰浴時間和加熱溫度對吸光度的交互影響曲面圖

    圖11 冰浴時間和加熱時間對吸光度的交互影響曲面圖

    在加熱時間與加熱溫度之間的交互作用中,等高線為橢圓形,表明二者的交互作用較強。當(dāng)加熱溫度為98.04 ℃、加熱時間為6.44 min時,OD達到最大值,其中沿加熱時間方向的等高線密度大于沿加熱溫度方向的,說明加熱時間對OD的影響較大。在冰浴時間與加熱溫度之間的交互作用中,等高線為橢圓形,表明二者的交互作用較強。當(dāng)加熱溫度為98.04 ℃、冰浴時間為8.72 min時,OD達到最大值,其中沿冰浴時間方向的等高線密度大于沿加熱溫度方向的,說明冰浴時間對OD的影響較大。在冰浴時間與加熱時間之間的交互作用中,等高線為橢圓形,表明二者的交互作用較強。當(dāng)加熱時間為6.44 min、冰浴時間為8.72 min時,OD達到最大值,其中沿冰浴時間方向的等高線密度大于沿加熱時間方向的,說明冰浴時間對OD的影響較大。

    3.4.3 驗證實驗

    根據(jù)Design-Expert軟件優(yōu)化,得到的最佳測試條件是: 初始加熱溫度為98.04 ℃,加熱時間為6.44 min,冰浴時間為8.72 min,此時理論OD值為0.100。

    為了驗證方法的可靠性,同時又考慮實際操作的方便,本文中選取加熱溫度為98 ℃,加熱時間為7 min,冰浴時間為9 min進行驗證實驗,共進行3組平行試驗,獲得的比色反應(yīng)OD值為0.99,與預(yù)測值相比較僅小1.00%,說明優(yōu)化條件可行。

    3.4.4 優(yōu)化后Berthelot比色法與HPLC法測定結(jié)果的比較

    優(yōu)化后Berthelot比色法測定GABA含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖12,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=4.04x-0.017 8(r2=0.995)。測試數(shù)據(jù)見表6。由表中數(shù)據(jù)可知,采用優(yōu)化后Berthelot比色法測定GABA質(zhì)量濃度的平均值為0.029 4 g/L,方差為5.436×10-7g2/L2;標(biāo)準(zhǔn)差為0.000 738 g/L,RSD為2.48%。

    圖12 優(yōu)化后Berthelot比色法測定γ-氨基丁酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

    表6 優(yōu)化后Berthelot法檢測γ-氨基丁酸濃度數(shù)據(jù)

    對HPLC法和優(yōu)化后Berthelot比色法測定結(jié)果進行t檢驗驗證。P=0.807 6,遠遠大于0.05,表明2組數(shù)據(jù)不存在顯著性差異,同時優(yōu)化后Berthelot比色法的質(zhì)量濃度平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、方差與HPLC法的t檢驗值更加接近。

    優(yōu)化后的Berthelot比色法相比于未優(yōu)化方法RSD值減小了1.26%,說明優(yōu)化后的方法的檢測結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差更小,穩(wěn)定性、重復(fù)性更好。

    4 結(jié)論

    優(yōu)化后的Berthelot比色法與未優(yōu)化的方法相比,顯色反應(yīng)時間縮短了46%,RSD值減小了1.26%,穩(wěn)定性、重復(fù)性更好,更加簡便快捷,并且與HPLC法無顯著性差異,是一種方便、簡潔、準(zhǔn)確的GABA含量檢測方法。

    猜你喜歡
    冰浴顯色劑比色法
    光電比色法測定瀝青黏附性的計算原理與誤差分析
    石油瀝青(2023年4期)2023-09-21 07:18:12
    分光光度法檢測污水中重金屬六價鉻的改進研究
    安徽化工(2022年4期)2022-08-02 06:35:02
    環(huán)境監(jiān)測中六價鉻分析方法的改進與優(yōu)化分析
    無碳復(fù)寫紙及其顯色劑市場現(xiàn)狀及趨勢
    熱死了
    醬油中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定
    分光光度法測定鉻(VI)實驗教學(xué)方法的改進*
    廣州化工(2016年6期)2016-09-05 09:56:21
    比色法測定礦物中銻含量的方法創(chuàng)新與研究
    微波消解-抗壞血酸-鑰藍比色法測定油脂中磷含量
    比色法測定肉豆蔻八味膠囊中總黃酮含量
    在线观看一区二区三区| 欧美xxⅹ黑人| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲性久久影院| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲成色77777| 91狼人影院| 激情 狠狠 欧美| 国产一区二区三区av在线| 三级国产精品欧美在线观看| 99久久九九国产精品国产免费| 久久久久久久久久人人人人人人| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 精品国产露脸久久av麻豆| 免费大片黄手机在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 一个人看视频在线观看www免费| 久久精品国产亚洲av涩爱| 高清视频免费观看一区二区| 免费av观看视频| 国产精品国产av在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产又色又爽无遮挡免| 日韩欧美一区视频在线观看 | 有码 亚洲区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 午夜激情福利司机影院| 人妻一区二区av| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 大码成人一级视频| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲精品aⅴ在线观看| 一本色道久久久久久精品综合| 久久韩国三级中文字幕| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产av不卡久久| 国产精品熟女久久久久浪| 观看免费一级毛片| 午夜福利网站1000一区二区三区| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲高清免费不卡视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 午夜免费观看性视频| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲一区二区三区欧美精品 | av在线老鸭窝| 欧美激情国产日韩精品一区| 大香蕉久久网| 精品久久久噜噜| 91狼人影院| 亚洲性久久影院| 国产伦在线观看视频一区| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲av二区三区四区| 成人亚洲精品一区在线观看 | 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产淫语在线视频| 国产毛片在线视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国产免费一级a男人的天堂| 色吧在线观看| 春色校园在线视频观看| 成人欧美大片| 日本与韩国留学比较| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | h日本视频在线播放| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 99久久九九国产精品国产免费| 插逼视频在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产精品国产av在线观看| 亚洲性久久影院| 99视频精品全部免费 在线| 国产一区二区三区综合在线观看 | 少妇的逼水好多| 日本熟妇午夜| 日日啪夜夜撸| 激情五月婷婷亚洲| 一本一本综合久久| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 九九爱精品视频在线观看| 99热这里只有精品一区| 国产乱人偷精品视频| 欧美潮喷喷水| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | av免费在线看不卡| 免费电影在线观看免费观看| 精品久久国产蜜桃| 嫩草影院精品99| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 中国国产av一级| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久久午夜福利片| 偷拍熟女少妇极品色| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 久久久久久久精品精品| 中国三级夫妇交换| 一级毛片我不卡| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产在线男女| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 老司机影院毛片| 一区二区三区精品91| 久久精品国产自在天天线| 久久人人爽人人爽人人片va| 嫩草影院新地址| 午夜福利视频1000在线观看| 一级黄片播放器| 18禁动态无遮挡网站| 99热这里只有是精品50| 伊人久久精品亚洲午夜| 91久久精品电影网| 亚洲精品视频女| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲图色成人| 观看免费一级毛片| 久久久久久久久久久免费av| 日本免费在线观看一区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 丝袜美腿在线中文| 久久国内精品自在自线图片| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 亚洲精品,欧美精品| 精品国产三级普通话版| 亚洲自偷自拍三级| 午夜亚洲福利在线播放| 免费观看的影片在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 日日啪夜夜爽| 国产精品不卡视频一区二区| 成年女人看的毛片在线观看| 免费av毛片视频| 久久久久久久精品精品| av国产久精品久网站免费入址| 日日撸夜夜添| 嫩草影院入口| 国产综合懂色| 麻豆成人av视频| 国产极品天堂在线| 国产亚洲91精品色在线| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美3d第一页| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 日本wwww免费看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 天堂俺去俺来也www色官网| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 日韩三级伦理在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 大片免费播放器 马上看| 国产精品熟女久久久久浪| 少妇 在线观看| 观看免费一级毛片| 黄色一级大片看看| 久久精品人妻少妇| av国产免费在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 亚洲经典国产精华液单| 日本色播在线视频| 男插女下体视频免费在线播放| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲综合色惰| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产欧美亚洲国产| 97在线视频观看| 国产一级毛片在线| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 一个人观看的视频www高清免费观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲精品久久午夜乱码| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久99精品国语久久久| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 日日撸夜夜添| 久久久久性生活片| 国产午夜福利久久久久久| 高清av免费在线| 观看美女的网站| 亚洲欧美日韩无卡精品| 舔av片在线| 国产精品熟女久久久久浪| 99热这里只有精品一区| 两个人的视频大全免费| 色播亚洲综合网| 国产色婷婷99| eeuss影院久久| 亚洲最大成人手机在线| 国产精品三级大全| 熟妇人妻不卡中文字幕| 久久精品人妻少妇| 久久韩国三级中文字幕| 色5月婷婷丁香| 少妇人妻久久综合中文| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 少妇高潮的动态图| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲av在线观看美女高潮| 久久精品人妻少妇| 久久国内精品自在自线图片| 成人免费观看视频高清| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 伊人久久精品亚洲午夜| 成人特级av手机在线观看| 午夜精品国产一区二区电影 | 在线观看免费高清a一片| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲综合色惰| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲精品亚洲一区二区| 最近手机中文字幕大全| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲精品色激情综合| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 欧美人与善性xxx| 久久这里有精品视频免费| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国内精品宾馆在线| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 大陆偷拍与自拍| 精品国产三级普通话版| 欧美一区二区亚洲| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 欧美潮喷喷水| 看非洲黑人一级黄片| 成人无遮挡网站| 国产日韩欧美亚洲二区| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲精品成人久久久久久| 禁无遮挡网站| kizo精华| 少妇人妻一区二区三区视频| 久久久精品欧美日韩精品| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久久久久久大尺度免费视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 丰满乱子伦码专区| 国产日韩欧美在线精品| 一区二区av电影网| 亚洲成人一二三区av| 国产免费一级a男人的天堂| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 少妇人妻久久综合中文| 午夜精品国产一区二区电影 | 日本av手机在线免费观看| 天堂网av新在线| 国产精品无大码| 久久久色成人| 国产高清不卡午夜福利| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产伦精品一区二区三区视频9| 狂野欧美激情性bbbbbb| 欧美xxⅹ黑人| 一区二区三区免费毛片| 免费大片黄手机在线观看| 精品久久久久久久久av| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产黄色免费在线视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 色综合色国产| 成人特级av手机在线观看| 国产综合懂色| 久久国产乱子免费精品| 久久久久性生活片| av网站免费在线观看视频| 亚洲高清免费不卡视频| 看免费成人av毛片| 久久久精品欧美日韩精品| 精品久久久噜噜| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产美女午夜福利| 人体艺术视频欧美日本| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 中文在线观看免费www的网站| 成人黄色视频免费在线看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 黄片wwwwww| 精品人妻熟女av久视频| 大话2 男鬼变身卡| 99久久精品国产国产毛片| 黄色一级大片看看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 午夜免费观看性视频| 国产精品一及| 久久精品国产亚洲av天美| 久久99精品国语久久久| 免费在线观看成人毛片| 日韩av不卡免费在线播放| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲色图av天堂| 99九九线精品视频在线观看视频| 另类亚洲欧美激情| 国产男女内射视频| 免费人成在线观看视频色| 国产成人91sexporn| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产淫片久久久久久久久| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 一区二区三区免费毛片| 欧美最新免费一区二区三区| 色播亚洲综合网| 99re6热这里在线精品视频| 97在线视频观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲美女视频黄频| 国产精品蜜桃在线观看| 日韩中字成人| 国产v大片淫在线免费观看| 国产亚洲5aaaaa淫片| 在线免费十八禁| 高清午夜精品一区二区三区| 一区二区三区乱码不卡18| 国产一区二区三区综合在线观看 | 久久精品夜色国产| 国产爱豆传媒在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 热99国产精品久久久久久7| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 午夜免费鲁丝| 国产一区二区三区综合在线观看 | 精品人妻熟女av久视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 夫妻性生交免费视频一级片| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 精品一区在线观看国产| 久久这里有精品视频免费| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 日韩三级伦理在线观看| 国产成人a区在线观看| 亚洲国产精品专区欧美| av线在线观看网站| 精品久久久久久电影网| 别揉我奶头 嗯啊视频| 26uuu在线亚洲综合色| 干丝袜人妻中文字幕| 久久久午夜欧美精品| 精品久久久精品久久久| av福利片在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| av福利片在线观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 成人亚洲精品一区在线观看 | 国产亚洲av嫩草精品影院| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 免费看光身美女| 我要看日韩黄色一级片| 国产精品99久久久久久久久| 国产精品女同一区二区软件| 内射极品少妇av片p| 一级二级三级毛片免费看| 中文资源天堂在线| 中国国产av一级| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲熟女精品中文字幕| 毛片女人毛片| 日韩在线高清观看一区二区三区| 精品久久久久久久久亚洲| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产毛片在线视频| 一级毛片 在线播放| 国产美女午夜福利| 亚洲色图av天堂| 有码 亚洲区| 中文字幕亚洲精品专区| 身体一侧抽搐| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 午夜精品一区二区三区免费看| 日本色播在线视频| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲在久久综合| 97超视频在线观看视频| 欧美3d第一页| 精品熟女少妇av免费看| 一级毛片久久久久久久久女| 国产色爽女视频免费观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲va在线va天堂va国产| 日韩成人伦理影院| 免费电影在线观看免费观看| 国产视频内射| 亚洲av国产av综合av卡| 色视频www国产| 国产黄频视频在线观看| 欧美3d第一页| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲美女搞黄在线观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 精品一区在线观看国产| 91精品一卡2卡3卡4卡| 青春草亚洲视频在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 日本与韩国留学比较| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产精品福利在线免费观看| 成人亚洲精品av一区二区| 一区二区三区精品91| 亚洲精品456在线播放app| 精华霜和精华液先用哪个| 特大巨黑吊av在线直播| 国产伦精品一区二区三区视频9| 久久精品国产亚洲av天美| 国产精品一及| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 夫妻午夜视频| 日韩成人伦理影院| 69av精品久久久久久| 国产精品99久久久久久久久| 国产精品久久久久久av不卡| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲av一区综合| 国产色婷婷99| 3wmmmm亚洲av在线观看| 午夜爱爱视频在线播放| 网址你懂的国产日韩在线| 成人特级av手机在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲精品第二区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 嫩草影院精品99| 国产色婷婷99| 日日撸夜夜添| 香蕉精品网在线| 男人舔奶头视频| 亚洲国产精品成人久久小说| av天堂中文字幕网| 天美传媒精品一区二区| 国产精品人妻久久久久久| xxx大片免费视频| 中文字幕免费在线视频6| 国产精品偷伦视频观看了| 国产人妻一区二区三区在| 大陆偷拍与自拍| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| www.色视频.com| 91精品国产九色| 22中文网久久字幕| videossex国产| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久久久a久久爽久久v久久| 美女主播在线视频| 国产69精品久久久久777片| 欧美精品一区二区大全| 插阴视频在线观看视频| 三级经典国产精品| 久久久久久久精品精品| 免费av观看视频| 欧美国产精品一级二级三级 | 国产综合精华液| 赤兔流量卡办理| 大片电影免费在线观看免费| 91精品一卡2卡3卡4卡| 丝袜美腿在线中文| 国产av码专区亚洲av| 水蜜桃什么品种好| 亚洲天堂av无毛| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产一区亚洲一区在线观看| 丝袜喷水一区| 国产精品一及| 高清在线视频一区二区三区| av国产免费在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 女人被狂操c到高潮| 26uuu在线亚洲综合色| 99热这里只有是精品50| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 丝袜喷水一区| 国产高清国产精品国产三级 | 乱码一卡2卡4卡精品| 日韩av不卡免费在线播放| 欧美xxxx性猛交bbbb| av在线蜜桃| 亚洲国产色片| 久久久久国产网址| 91在线精品国自产拍蜜月| 十八禁网站网址无遮挡 | 亚洲在久久综合| 精品一区在线观看国产| 国产欧美日韩精品一区二区| 一边亲一边摸免费视频| 黄色欧美视频在线观看| 精品午夜福利在线看| 久久这里有精品视频免费| 日日撸夜夜添| 老女人水多毛片| 国产精品人妻久久久影院| 国产精品久久久久久久久免| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 色视频www国产| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 51国产日韩欧美| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 看免费成人av毛片| 国产综合精华液| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产精品精品国产色婷婷| 91精品一卡2卡3卡4卡| 天美传媒精品一区二区| 国产黄片美女视频| 美女内射精品一级片tv| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 毛片女人毛片| 国产高潮美女av| 麻豆成人午夜福利视频| 久久精品人妻少妇| 成人二区视频| 少妇人妻 视频| 又爽又黄a免费视频| 久久久久久久久大av| 精品亚洲乱码少妇综合久久| av免费在线看不卡| 日韩一区二区视频免费看| 青青草视频在线视频观看| 国产伦在线观看视频一区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲在久久综合| 一二三四中文在线观看免费高清| 九草在线视频观看| 午夜老司机福利剧场| 大话2 男鬼变身卡| 久久久久性生活片| 国产一区二区在线观看日韩| 欧美成人午夜免费资源| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 高清在线视频一区二区三区| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产午夜精品一二区理论片| 一级二级三级毛片免费看| 久久鲁丝午夜福利片| 一区二区三区免费毛片| 交换朋友夫妻互换小说| 色视频www国产| 日本wwww免费看| 男人添女人高潮全过程视频| 久久久精品欧美日韩精品| 麻豆成人av视频| 丝袜美腿在线中文| 亚洲第一区二区三区不卡| 免费在线观看成人毛片| 国产精品福利在线免费观看| 欧美 日韩 精品 国产| 最新中文字幕久久久久| 晚上一个人看的免费电影| 少妇人妻 视频| 日本三级黄在线观看| 高清av免费在线| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲精品色激情综合| 日韩欧美一区视频在线观看 | 国产成人精品久久久久久| 三级国产精品片| 欧美日韩视频精品一区| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲怡红院男人天堂| 国产日韩欧美亚洲二区| 在线观看三级黄色| 亚洲丝袜综合中文字幕| 2018国产大陆天天弄谢| 18+在线观看网站| 偷拍熟女少妇极品色| 国产毛片a区久久久久| 六月丁香七月| 老司机影院毛片| 成年人午夜在线观看视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 人妻少妇偷人精品九色| 日韩伦理黄色片| 人妻 亚洲 视频| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲熟女精品中文字幕| 久久这里有精品视频免费| 六月丁香七月| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲高清免费不卡视频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 久久久久久久亚洲中文字幕| 69人妻影院| 熟女电影av网| 精品人妻熟女av久视频| 国产一区二区三区av在线| 香蕉精品网在线| 国产一区二区在线观看日韩| av线在线观看网站| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 日韩电影二区| 免费观看性生交大片5| 精品国产露脸久久av麻豆| 亚洲最大成人手机在线| 国产精品成人在线|