超聲預(yù)處理對(duì)大豆蛋白酶解物結(jié)構(gòu)及抗氧化活性的影響

許 晶，韓 東，王昱婷，趙青山，張曉松，金 花*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆常被人們稱為“綠色牛乳”，這是因?yàn)榇蠖怪泻胸S富的蛋白質(zhì)和油脂。大豆蛋白因其提取成本低、含量高、營(yíng)養(yǎng)效價(jià)好，并且含有多種人體必需氨基酸，已成為人們所青睞的優(yōu)質(zhì)植物蛋白，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[1]。同時(shí)，大豆蛋白經(jīng)酶水解后的產(chǎn)物——大豆肽具有較強(qiáng)的還原能力、清除自由基能力、金屬離子螯合能力和抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用，能在一定程度上清除機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的多余自由基，延緩機(jī)體的衰老，降低各種老年性疾病發(fā)生的概率[2]。

蛋白質(zhì)水解改性常用的方法包括酸水解法、堿水解法和酶水解法。其中蛋白質(zhì)酶解改性法反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)、安全無(wú)毒，且不影響蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，被認(rèn)為是蛋白質(zhì)改性的最佳方法[3-8]。而且研究表明經(jīng)適度酶解改性后，大豆蛋白的生物活性會(huì)較原始蛋白明顯增強(qiáng)[9]。因此，如何調(diào)控酶解條件，實(shí)現(xiàn)適宜水解，進(jìn)而獲得最佳生物活性的大豆蛋白水解產(chǎn)物成為近些年人們研究的熱點(diǎn)。Lamsal等[10]發(fā)現(xiàn)大豆蛋白酶解物的生物活性主要受其水解度、蛋白酶酶切位點(diǎn)和底物蛋白特性的影響。張宇昊等[11]則利用堿性蛋白酶水解花生蛋白，對(duì)酶解溫度、時(shí)間、pH值和底物濃度等酶解條件進(jìn)行調(diào)控，制備出理想水解度的蛋白酶解物。然而大豆蛋白的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)緊密，這使得大豆蛋白酶解效率降低，酶解物水解度不高。所以，科學(xué)家們采用了多種預(yù)處理手段以提高大豆蛋白酶解效率[12-14]。超聲預(yù)處理法是利用高頻聲波的剪切力和機(jī)械能所產(chǎn)生的空穴作用，對(duì)球狀蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行修飾，進(jìn)而提高球狀蛋白的酶解效率[15]。據(jù)報(bào)道，高強(qiáng)度超聲預(yù)處理會(huì)提高大豆分離蛋白的乳化性[16]。Wu Jinju等[17]還發(fā)現(xiàn)經(jīng)超聲預(yù)處理后，大豆分離蛋白酶解物的抗氧化活性較未處理樣品有所增強(qiáng)。

大豆蛋白按生理功能的差別分為貯藏蛋白（約占90%）和生物活性蛋白，其中兩種主要的貯藏蛋白分別為大豆球蛋白（11S）和β-伴大豆球蛋白（7S），約占大豆蛋白總貯藏蛋白的70%。本課題組前期已經(jīng)探索完善了大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的超聲預(yù)處理及酶解工藝，確定了制備高抗氧化活性大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的最佳超聲酶解工藝條件[18]。本研究則以大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白為原料蛋白，采用超聲預(yù)處理和酶解改性相結(jié)合的方法，以最佳工藝條件制備大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析和表征，探討超聲預(yù)處理對(duì)蛋白酶解物結(jié)構(gòu)的影響，初步分析超聲預(yù)處理提高大豆蛋白酶解物抗氧化活性的原因，以期為大豆蛋白的有效利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂豆粕 黑龍江省哈高科大豆食品有限責(zé)任公司。

堿性蛋白酶（酶活力為2.0×105U/g） 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；EL20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；RLPHR 1-4 LSC小型冷凍干燥機(jī) 北京博勱行儀器有限公司；SC-3610型低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；ALPHA-T傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Bruker公司；LS55熒光分光光度計(jì) 英國(guó)PerkinElmer公司；S-3400掃描電子顯微鏡 日本日立高新技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白超聲預(yù)處理工藝

參考本課題組前期研究方法[18-19]，從低溫脫脂豆粕中提取的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白，并分別以大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的最佳超聲工藝進(jìn)行預(yù)處理。將大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白分別與蒸餾水以3∶100（m/V）的比例混合，置于錐形瓶中，室溫（25 ℃）持續(xù)攪拌1 h。然后放入超聲波處理器探頭（φ＝0.636 cm），以20 kHz分別對(duì)大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白進(jìn)行超聲預(yù)處理，具體超聲條件如下：大豆球蛋白超聲功率200 W、超聲時(shí)間30 min、超聲溫度45 ℃；β-伴大豆球蛋白超聲功率100 W、超聲時(shí)間30 min、超聲溫度50 ℃。超聲時(shí)間2 s，間隔時(shí)間2 s，將超聲預(yù)處理后的樣品冷凍干燥，存儲(chǔ)于密閉容器中備用。

1.3.2 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解工藝

分別準(zhǔn)確稱取一定量經(jīng)超聲預(yù)處理和未經(jīng)超聲預(yù)處理的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白于圓底燒瓶中，加水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的底物溶液。將底物溶液置于水浴鍋中，調(diào)節(jié)溶液至堿性蛋白酶最適酶解pH值（pH 9.0），并調(diào)節(jié)水浴鍋至最適酶解溫度45 ℃。持續(xù)磁力攪拌的情況下，加入堿性蛋白酶開(kāi)始酶解，加酶量為24 000 U/g底物。酶解進(jìn)行過(guò)程中，不斷滴加0.50 mol/L的NaOH溶液，從而維持酶解樣品pH 9.0。酶解4 h后，酶解液于沸水浴中滅酶活性10 min，然后將其冷卻至室溫，再向酶解液中加入1.0 mol/L HCl溶液，調(diào)pH值為4.3。之后，將酶解液4 000 r/min離心15 min，取上清液冷凍干燥，得產(chǎn)物粉末，粉末于4 ℃下密封保存?zhèn)溆谩Ｋ舛鹊臏y(cè)定采用pH-stat法[20]。

1.3.3 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的熒光光譜測(cè)定

參考Bonomi[21]和Zhang Qiuting[22]等的測(cè)定方法，并稍加修改，以蛋白質(zhì)中內(nèi)源性熒光基團(tuán)（色氨酸基團(tuán)）為探針，測(cè)定大豆蛋白酶解物熒光光譜。將超聲預(yù)處理、未處理的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）配制成質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL的溶液。以λex＝290 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，在300～460 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，選擇5 nm為激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫，進(jìn)行熒光光譜測(cè)定。

1.3.4 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的傅里葉變換紅外光譜測(cè)定

采用KBr壓片法，準(zhǔn)確稱取超聲預(yù)處理和未處理的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物2 mg，加入0.2 g左右的KBr，充分研磨混勻、壓片，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)測(cè)定傅里葉變換紅外光譜[23-25]。

1.3.5 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的紫外光譜測(cè)定

將超聲預(yù)處理、未處理的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的溶液。在240～360 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，測(cè)定分辨率為0.1 nm[26]。

1.3.6 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的掃描電子顯微鏡觀察

參照文獻(xiàn)[27]方法，在5 kV加速電壓下進(jìn)行大豆蛋白酶解物微觀形貌表征。測(cè)定前，用離子噴射器對(duì)超聲預(yù)處理、未處理的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物干燥粉末表面鍍一層15 nm左右的金箔。

1.3.7 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物游離巰基含量測(cè)定

參考Shimada[28]和Ellman[29]等的測(cè)定方法，并略加改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取5,5’-二硫雙-2-硝基苯甲酸400 mg，加Tris-甘氨酸緩沖液（0.086 mol/L Tris-0.09 mol/L甘氨酸-4 mmol/L Na2EDTA，pH 8.0）稀釋定容至100.0 mL，配制成濃度為0.01 mol/L的Ellman試劑。準(zhǔn)確移取2.00 mL大豆蛋白酶解液與5 mL Tris-甘氨酸緩沖液均勻混合，再加入0.100 mL配制好的Ellman試劑，快速充分混勻溶液。室溫（25 ℃）靜置15 min，然后測(cè)定樣品412 nm波長(zhǎng)處吸光度A412nm。設(shè)定不加Ellman試劑的混合溶液為空白參比，測(cè)定空白組吸光度。游離巰基含量的計(jì)算如式（1）所示。

式中：D為稀釋系數(shù)；ρ為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.8 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的抗氧化活性測(cè)定

1.3.8.1 還原能力

參照You Lijun等[30]的測(cè)定方法，取1 mL酶解液與2.50 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和2.50 mL 10 mg/mL的K3(Fe(CN)6)溶液混合搖勻。將混合溶液50 ℃水浴20 min。然后，向溶液中加入2.5 mL體積分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸溶液，3 500 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，與2.5 mL超純水和0.5 mL體積分?jǐn)?shù)0.1%的三氯化鐵溶液混和均勻，室溫靜置10 min。以超純水為空白，測(cè)定700 nm波長(zhǎng)處吸光度，吸光度與樣品還原能力呈正相關(guān)，以吸光度表征還原能力。

1.3.8.2 羥自由基清除能力

參照Amarowicz等[31]的測(cè)定方法，以Fenton反應(yīng)測(cè)定大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物羥自由基清除率。取1.00 mL酶解液和1.00 mL FeSO4溶液（3 mmol/L），與1.00 mL H2O2溶液（3 mmol/L）均勻混合，避光靜置10 min，然后向混合液中加入1.00 mL水楊酸乙醇溶液（3 mmol/L），繼續(xù)避光靜置30 min，測(cè)定混合樣液510 nm波長(zhǎng)處吸光度Ai。本實(shí)驗(yàn)以超純水為空白組，超純水替換水楊酸乙醇為對(duì)照組，分別測(cè)定空白組吸光度A0和對(duì)照組吸光度Aj，計(jì)算大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物羥自由基清除率（式（2））。

1.3.8.3 Fe2+螯合能力

參照Wang Xiansheng等[32]的測(cè)定方法。取1 mL酶解液與3.7 mL超純水和0.1 mL FeCl2溶液（20 mmol/L）混合均勻，室溫靜置3 min。然后向混合液中加入0.2 mL菲洛嗪（5 mmol/L），攪拌10 min，測(cè)定562 nm波長(zhǎng)處吸光度Ai。同時(shí)，以超純水為空白，測(cè)定空白組吸光度A0，計(jì)算大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物Fe2+螯合能力（式（3））。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲預(yù)處理對(duì)大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的熒光光譜分析

如圖1所示，圖中λ＝360 nm的特征峰為色氨酸殘基特征峰，熒光光譜峰位、峰強(qiáng)的改變都反映了色氨酸所處環(huán)境的變化[33-34]。本實(shí)驗(yàn)中，超聲預(yù)處理后大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的熒光光譜峰位無(wú)明顯改變，但熒光強(qiáng)度均有所增加，這表明超聲預(yù)處理后兩種蛋白酶解物中的色氨酸所處的微環(huán)境極性增加，即內(nèi)部色氨酸更多地暴露出來(lái)，說(shuō)明蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)有所展開(kāi)[35]。并且，蛋白質(zhì)活性基團(tuán)的暴露會(huì)有效增強(qiáng)其抗氧化活性[36]，這對(duì)大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的應(yīng)用有積極作用。

圖 1 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的熒光光譜Fig. 1 Fluorescence spectra of glycinin and β-conglycinin hydrolysates

2.1.2 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的傅里葉變換紅外光譜分析

圖 2 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的傅里葉變換紅外光譜分析Fig. 2 Fourier transform infrared spectra of glycinin and β-conglycinin hydrolysates

圖2為超聲預(yù)處理前后大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的傅里葉變換紅外光譜圖，其中波數(shù)1 600～1 700 cm-1的酰胺Ⅰ帶頻率與C＝O鍵伸縮振動(dòng)及肽鍵的C—N伸縮振動(dòng)有關(guān)，可反映蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。校正傅里葉變換紅外光譜基線、去卷積，對(duì)蛋白酶解物的酰胺Ⅰ帶圖譜作二階導(dǎo)數(shù)擬合、Gauss峰形擬合，完全分辨重疊在一起的不同譜帶（圖3）。各子峰與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)歸屬關(guān)系為：α-螺旋結(jié)構(gòu)1 650～1 660 cm-1；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)1 660～1 680 cm-1和1 690～1 700 cm-1；β-折疊結(jié)構(gòu)1 610～1 638 cm-1和1 680～1 690 cm-1；無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)1 640～1 648 cm-1。

圖 3 超聲預(yù)處理前后大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物傅里葉變換紅外光譜的酰胺Ⅰ帶擬合圖譜Fig. 3 Second-derivative Fourier transform infrared spectra in the amide I region and Gaussian curve fitting of glycinin and β-conglycinin hydrolysates

表 1 超聲預(yù)處理前后大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 1 Contents of secondary structures of glycinin and β-conglycinin hydrolysates%

計(jì)算各子峰和總峰峰面積，求得各二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量（表1）。對(duì)比各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量發(fā)現(xiàn)大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物中β-轉(zhuǎn)角、β-折疊結(jié)構(gòu)含量最高，與已有報(bào)道一致[37-38]。超聲預(yù)處理后，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物中α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量顯著升高，而無(wú)規(guī)卷曲和β-折疊結(jié)構(gòu)含量顯著降低。其中大豆球蛋白酶解物β-折疊結(jié)構(gòu)含量降低1.66%，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量升高1.89%；β-伴大豆球蛋白酶解物β-折疊結(jié)構(gòu)含量降低1.83%，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量升高1.93%，說(shuō)明超聲預(yù)處理能夠使得蛋白質(zhì)有序結(jié)構(gòu)向無(wú)序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)受局部氨基酸排列順序以及蛋白質(zhì)分子與其他分子交互作用的影響，在超聲波空穴效應(yīng)作用下，蛋白分子與其他分子的交互作用遭到破壞，從而發(fā)生解聚和重排，造成大豆蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量發(fā)生變化。因此，超聲預(yù)處理的大豆蛋白酶解后，其酶解物的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量也發(fā)生相應(yīng)改變。超聲預(yù)處理后酶解物β-折疊結(jié)構(gòu)含量降低導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水相關(guān)位點(diǎn)暴露，暴露的疏水性氨基酸能促進(jìn)抗氧化肽與疏水性多不飽和脂肪酸相互作用，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而提高蛋白質(zhì)酶解物的抗氧化活性[39]。

2.1.3 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的紫外光譜分析

圖 4 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的紫外光譜Fig. 4 Ultraviolet spectra of glycinin and β-conglycinin hydrolysates

由于蛋白質(zhì)中的色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、組氨酸和苯丙氨酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)對(duì)紫外光有吸收作用，不同的氨基酸有不同的生色基團(tuán)。其中，色氨酸和酪氨酸的紫外吸收峰在280 nm波長(zhǎng)附近，苯丙氨酸的紫外吸收峰在257 nm波長(zhǎng)附近[40]。所以，采用紫外光譜來(lái)研究蛋白側(cè)鏈的變化（如酪氨酸殘基的裸露程度），以探討超聲對(duì)大豆蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。由圖4可知，經(jīng)超聲預(yù)處理后，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的紫外吸收峰的峰型、峰位雖然沒(méi)發(fā)生太大變化，但是相應(yīng)吸收峰的強(qiáng)度明顯增大。這可能是因?yàn)槌曨A(yù)處理的剪切力和空穴效應(yīng)會(huì)破壞蛋白質(zhì)的緊密結(jié)構(gòu)，增加水解度，具有紫外吸收的芳香族氨基酸殘基，如酪氨酸殘基等暴露至蛋白質(zhì)分子的表面，發(fā)色基團(tuán)所處的環(huán)境由非極性向極性變化，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的三級(jí)結(jié)構(gòu)部分展開(kāi)[41]。

2.2 超聲預(yù)處理對(duì)大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物微觀形態(tài)的影響

圖 5 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的顯微結(jié)構(gòu)Fig. 5 Microstructure of glycinin and β-conglycinin hydrolysates

如圖5所示，未經(jīng)超聲預(yù)處理酶解物具有疏松結(jié)構(gòu)，尺寸較大。而經(jīng)超聲預(yù)處理后酶解產(chǎn)物尺寸明顯減小，樣品質(zhì)地更加疏松，緊密性有效降低。結(jié)果表明超聲預(yù)處理能夠有效破壞蛋白質(zhì)緊密結(jié)構(gòu)，獲得結(jié)構(gòu)疏松的處理產(chǎn)物，利于酶解反應(yīng)進(jìn)行，提高蛋白質(zhì)水解度。

2.3 超聲預(yù)處理對(duì)大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解特性影響

表 2 超聲預(yù)處理大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的水解度、游離巰基含量和抗氧化活性Table 2 Degree of hydrolysis, free free sulfhydryl group contents and antioxidant activity of glycinin and β-conglycinin hydrolysates

如表2所示，與未超聲預(yù)處理的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物相比，超聲預(yù)處理后蛋白酶解物水解度顯著升高（P＜0.05），說(shuō)明超聲預(yù)處理能夠有效提高酶解效率。本課題組前期研究結(jié)果表明過(guò)長(zhǎng)的超聲時(shí)間（30 min）、過(guò)高的超聲溫度（45 ℃）和超聲功率（200 W）反而對(duì)提高水解度不利[18]。這是由于超聲波的機(jī)械作用能夠破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，暴露更多蛋白酶結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)蛋白酶解?？墒沁^(guò)高的超聲功率、過(guò)長(zhǎng)的超聲時(shí)間會(huì)進(jìn)一步破壞蛋白酶結(jié)合位點(diǎn)和蛋白酶自身結(jié)構(gòu)，使得蛋白酶活性下降，影響酶解效果，從而降低水解率[42]。同樣，過(guò)高的超聲溫度也會(huì)破壞蛋白酶活性，所以適當(dāng)升高超聲溫度才有利于蛋白水解度的提高。研究表明，蛋白質(zhì)水解度與其抗氧化活性有一定關(guān)系，但不呈正相關(guān)[43-44]。因此，有效控制超聲預(yù)處理?xiàng)l件和酶解工藝，才能獲得適宜水解度的高抗氧化活性酶解產(chǎn)物。

超聲預(yù)處理后大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的游離巰基含量較未經(jīng)超聲預(yù)處理樣品有顯著升高。據(jù)報(bào)道，高靜水壓力會(huì)使大米蛋白結(jié)構(gòu)部分展開(kāi)，促使大米蛋白酶解物的游離巰基含量顯著升高[45]。與之相似，超聲-酶水解復(fù)合改性會(huì)使大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白結(jié)構(gòu)疏松，水解度增大，酶解產(chǎn)物聚合度下降，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的巰基暴露出來(lái)，增加體系游離巰基的含量[46]。

經(jīng)超聲預(yù)處理后的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的抗氧化活性顯著提高（P＜0.05）。酶解物抗氧化活性提高的可能原因是超聲波的空化效應(yīng)使液體中產(chǎn)生氣泡，氣泡被擠壓破裂后，瞬間產(chǎn)生強(qiáng)大的物理剪切力，這種作用力可以使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變，促使某些基團(tuán)與酶切位點(diǎn)暴露出來(lái)，有利于和堿性蛋白酶的結(jié)合，水解得到具有較高抗氧化活性的肽段。超聲預(yù)處理導(dǎo)致酶解物的空間構(gòu)象改變，使得氨基酸基團(tuán)與自由基接觸變得容易，更多的電子與自由基未成對(duì)電子配對(duì)，使得羥自由基清除率有所增加。同時(shí)，酶解物結(jié)構(gòu)上的改變，也使得抗氧化活性氨基酸更易與反應(yīng)體系中Fe2+結(jié)合，組氨酸上的α-氨基和羧基與Fe2+形成五元環(huán)，α-氨基和咪唑基與Fe2+形成六元環(huán)，羧基和咪唑基與Fe2+形成七元環(huán)，F(xiàn)e2+與組氨酸生成穩(wěn)定的螯合物，提高了Fe2+的螯合能力[40]。

綜上所述，超聲-酶解復(fù)合改性是簡(jiǎn)單有效的蛋白質(zhì)改性方法。在超聲作用下，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵和二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，緊密度下降。因此，超聲預(yù)處理后，蛋白質(zhì)聚集度下降，空間結(jié)構(gòu)更加疏松，活性基團(tuán)暴露，蛋白酶與底物結(jié)合位點(diǎn)增多，酶解反應(yīng)更易進(jìn)行，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)高抗氧化活性大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的制備。

3 結(jié) 論

本研究采用超聲-酶解復(fù)合改性的方法，利用堿性蛋白酶，對(duì)大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白進(jìn)行酶解，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和抗氧化性進(jìn)行初步分析和表征，主要結(jié)論如下：

傅里葉變換紅外光譜表征發(fā)現(xiàn)在超聲波空穴作用下，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物中α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量明顯升高，而無(wú)規(guī)卷曲和β-折疊結(jié)構(gòu)含量明顯降低，說(shuō)明蛋白質(zhì)分子發(fā)生解聚和重排，使其二級(jí)結(jié)構(gòu)含量發(fā)生變化，疏水相關(guān)位點(diǎn)暴露。另外，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的熒光峰強(qiáng)和紫外峰強(qiáng)明顯增加也進(jìn)一步說(shuō)明酶解物三級(jí)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水活性基團(tuán)暴露出來(lái)[35,41]，這對(duì)提高酶解物的抗氧化活性有積極意義。

超聲預(yù)處理暴露酶解活性位點(diǎn)，有效提高酶解效率，使蛋白酶解物的水解度和游離巰基的含量較未處理樣品大大升高。

超聲預(yù)處理后，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的還原能力、羥自由基清除能力和Fe2+螯合能力均有顯著提高，為大豆蛋白高效酶解改性提供技術(shù)參考和理論依據(jù)。