基于單一分光棱鏡干涉儀的雙通路定量相位顯微術(shù)?

孫騰飛 盧鵬 卓壯 張文浩 盧景琦?

1)(山東大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院,山東省激光技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,濟(jì)南 250100)2)(山東大學(xué)物理學(xué)院,濟(jì)南 250100)

(2017年12月22日收到;2018年4月9日收到修改稿)

僅僅使用一個(gè)單獨(dú)的分光棱鏡(BS),實(shí)現(xiàn)了一種用于生物細(xì)胞三維成像的雙通路定量相位顯微術(shù).不同于傳統(tǒng)的使用方法,將BS傾斜放置,使中央半反射層與入射光光軸之間存在一個(gè)非常小的角度.這樣基于BS的分光特性,經(jīng)過BS后的透射光束和反射光束將會(huì)疊加在一起并形成干涉.調(diào)節(jié)樣品位置,利用相機(jī)拍攝同時(shí)獲得了存在π相移的雙通路干涉圖.這種離軸干涉模式,只需要記錄單幅干涉圖就可以獲得真實(shí)的相位信息,方法結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,易于操作,適用于微小透明樣品的三維形貌測(cè)量.

1 引 言

近年來(lái),用于識(shí)別檢測(cè)透明微結(jié)構(gòu)特征的技術(shù)愈發(fā)重要.相較于傳統(tǒng)光學(xué)顯微技術(shù),定量相位顯微術(shù)通過測(cè)量相位信息來(lái)間接地反映三維輪廓信息,這種技術(shù)無(wú)需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記即可觀察完整細(xì)胞的形態(tài)和光學(xué)性質(zhì),作為一種無(wú)損傷、非接觸式的光學(xué)測(cè)量技術(shù),其已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于微結(jié)構(gòu)(細(xì)胞等)的形態(tài)特征測(cè)量中[1?6].常見的馬赫爾-曾德干涉儀結(jié)構(gòu)經(jīng)常在定量相位顯微術(shù)中使用,然而這種結(jié)構(gòu)極易受到外部環(huán)境的干擾,最終會(huì)降低測(cè)量的精度.為解決上述問題,采用信號(hào)光束和參考光束共光路的結(jié)構(gòu)[7?14]是一種不錯(cuò)的選擇.除此之外,采用盡可能少的光學(xué)元件不僅可以實(shí)現(xiàn)信號(hào)光束和參考光束共光路結(jié)構(gòu)以提高系統(tǒng)的穩(wěn)定性,而且顯著地簡(jiǎn)化了系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)以及降低了系統(tǒng)的成本,目前對(duì)于這一方面的研究已取得了一定成果[15?21].例如,Anand等[15]及馮少彤等[16]分別描述了僅僅使用普通平面反射鏡——Lloyd鏡的自參考共光路數(shù)字全息顯微技術(shù),即利用反射鏡將光束的一部分反射與另一部分光束疊加形成干涉條紋;此外,Anand等[17]僅僅使用一片玻璃平板實(shí)現(xiàn)了橫向剪切干涉顯微術(shù),獲取了微小生物樣品的三維輪廓信息;Yaqoob等[18]則使用兩片方形平面反射鏡實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞的光學(xué)色散相位測(cè)量;Qu等[19],Gabai和Shaked[20]及馮國(guó)英等[21]使用單一的分光棱鏡(BS)實(shí)現(xiàn)了微結(jié)構(gòu)的干涉相位測(cè)量.本文僅僅通過使用一個(gè)BS,提出了一種新的雙通路定量相位顯微術(shù).利用這種方法,獲得了較高質(zhì)量的干涉圖樣,并成功實(shí)現(xiàn)了生物細(xì)胞的相位信息測(cè)量.

2 實(shí)驗(yàn)原理

2.1 相位提取方法

基于本文實(shí)驗(yàn)所采用的離軸干涉結(jié)構(gòu),只需要采集一幅干涉圖就可獲取樣品的相位信息,故此選擇應(yīng)用廣泛的快速傅里葉變換(FFT)法來(lái)恢復(fù)樣品相位信息.FFT法[22]的具體流程參見圖1.

圖1 FFT法處理干涉圖流程Fig.1.Flow diagram of FFT method for processing interferogram.

假設(shè)信號(hào)光波O(x,y)和參考光波R(x,y)均為平面光波,干涉條紋的光強(qiáng)分布可表示為

式中令O(x,y)=A(x,y)cos[φ0+φ(x,y)],R(x,y)=A(x,y)cosφ0.設(shè)A(x,y)和φ(x,y)分別為光波的振幅和樣品相位分布,φ0為初始相位,“*”代表共軛.對(duì)(1)式進(jìn)行FFT,然后用合適的濾波器提取出+1級(jí)頻譜:

坐標(biāo)(μ,ν)為與空域坐標(biāo)(x,y)相對(duì)應(yīng)的頻域坐標(biāo).(2)式與(1)式中各項(xiàng)對(duì)應(yīng),分別為背景(0級(jí))、實(shí)像(+1級(jí))和共軛像(?1級(jí)).濾波后將+1級(jí)頻譜移至譜域中心,然后對(duì)(3)式進(jìn)行逆FFT得到c(x,y).利用反正切計(jì)算,從c(x,y)求解相位信息:

式中“Im”和“Re”分別代表復(fù)函數(shù)的虛部和實(shí)部.

利用求解反正切的方法來(lái)獲取相位信息時(shí),提取的相位值被限制在[?π,π],即得到的是相位被“包裹”的圖像.需要對(duì)其進(jìn)行相位解包裹以便得到真實(shí)的連續(xù)相位分布

式中U[]為解包裹計(jì)算,下標(biāo)“u”和“w”分別代表解包裹和包裹,k為整數(shù).

2.2 BS干涉原理

利用BS將一束光分成兩束.不同于文獻(xiàn)[19,20]中的用法,調(diào)節(jié)光束的入射位置,使其僅僅入射到BS的左(右)半部分(中央半反射層一側(cè)),平行光束入射到BS時(shí)的光線追跡如圖2所示.將一個(gè)分光比為5:5的普通BS傾斜放置,在最初狀態(tài)使BS的中央半反射層與平行入射光束光軸方向平行.以BS的中央半反射層所處方向?yàn)榛鶞?zhǔn),定義θ為平行入射光束光軸與BS中央半反射層之間的夾角,按照幾何光學(xué)中的符號(hào)規(guī)則(以銳角度量,順時(shí)針轉(zhuǎn)為正,逆時(shí)針轉(zhuǎn)為負(fù))來(lái)表示入射光的入射狀態(tài).假設(shè)BS位置不變,當(dāng)入射光束方向發(fā)生變化時(shí),出射光束(經(jīng)中央半反射層的透射光束和反射光束)的方向也隨之發(fā)生變化.當(dāng)θ=0時(shí),兩出射光束平行;當(dāng)θ>0時(shí),兩出射光束匯聚;當(dāng)θ<0時(shí),兩出射光束發(fā)散.可以很容易發(fā)現(xiàn),當(dāng)處于θ>0的情況下(圖2(b)),經(jīng)過BS之后的兩出射光束(兩出射光束之間存在夾角2θ)將相遇疊加在一起并發(fā)生離軸干涉.本文實(shí)驗(yàn)即利用這一性質(zhì).

圖2 平行光束以不同方向入射到BS時(shí)的光線追跡(a)θ=0;(b)θ>0;(c)θ<0Fig.2.Ray tracing of parallel beam incident to BS with Different directions:(a)θ=0;(b)θ>0;(c)θ<0.

本文提出的定量相位顯微術(shù)有幾個(gè)有利條件:第一,使用單一的BS可以簡(jiǎn)化光學(xué)系統(tǒng),降低光學(xué)系統(tǒng)的成本及調(diào)節(jié)難度;第二,調(diào)節(jié)入射光束距離BS中央半反射層盡可能遠(yuǎn),這樣兩出射光束之間的距離越近,這種自參考近共光路模式使得系統(tǒng)的抗干擾能力較好;第三,如圖2(b)所示,通過調(diào)節(jié)樣品的位置,使樣品盡可能只占據(jù)入射光束的一半位置,這樣經(jīng)過BS的兩出射光束就是入射光束的復(fù)制像,并且彼此相反.因此,當(dāng)這兩出射光束相互疊加時(shí),其對(duì)應(yīng)位置彼此干涉,形成雙通路干涉形式;第四,兩干涉光束之間存在一個(gè)非常小的夾角,這就形成了離軸干涉,并且干涉光束之間的夾角可以自由地調(diào)節(jié),從而實(shí)現(xiàn)頻譜中實(shí)像和共軛像完全分離,因此只需要記錄一幅干涉圖并且可以很好地提取出樣品的相位信息.對(duì)于文獻(xiàn)[19,20]中的方法,需要盡可能調(diào)節(jié)BS中央半反射層與入射光光軸共面,使得每一干涉通路中參考光束和信號(hào)光束的截面積相近,以期獲得大的干涉區(qū)域.而本文方法只需使入射光束入射到BS中央半反射層的一側(cè)即可實(shí)現(xiàn)同樣目標(biāo),這一調(diào)節(jié)相對(duì)簡(jiǎn)單.此外,本文方法利用的是通過BS后兩束光束的匯聚性質(zhì)(圖2(b)),而文獻(xiàn)[20]利用了通過BS后兩束光束的發(fā)散性質(zhì)(圖2(c)),比較兩種方法,可以較容易地發(fā)現(xiàn)在獲取同樣的雙通路干涉圖樣時(shí),本文方法只需要更小的探測(cè)器面積.

3 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)及測(cè)量結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)裝置及細(xì)節(jié)

本文提出的雙通路定量相位顯微術(shù)實(shí)驗(yàn)光路如圖3所示.首先,按照傳統(tǒng)倒置型顯微鏡配置搭建了光路的基礎(chǔ)部分.使用He-Ne激光(波長(zhǎng)λ為632.8 nm)作為照明光源,采用英國(guó)Andor公司的Zyla 5.5科研型CMOS相機(jī)拍攝干涉圖,像素尺寸?x為6.5μm×6.5μm,最大有效像素?cái)?shù)為2560 pixel×2160 pixel(5.5 M像素).圖3左側(cè)插圖顯示了樣品放置情況,右側(cè)插圖為雙通路離軸干涉示意圖,其中O(O′)代表信號(hào)光束,R(R′)代表參考光束.

圖3 雙通路定量相位顯微術(shù)實(shí)驗(yàn)光路示意圖Fig.3.Experimental optical path diagram of dual-channel quantitative phase microscopy.

將BS安裝在旋轉(zhuǎn)臺(tái)上,精細(xì)調(diào)節(jié)入射光束光軸與BS中央半反射層之間的夾角θ(根據(jù)幾何關(guān)系,可以得到兩干涉光束之間存在夾角為2θ),以便獲取條紋對(duì)比度高的高質(zhì)量干涉圖.通過調(diào)節(jié)夾角θ的大小,發(fā)現(xiàn)干涉條紋的空間頻率也隨之發(fā)生變化.隨著夾角θ逐漸增大,干涉圖條紋變得越來(lái)越細(xì)密,干涉條紋的空間頻率逐漸增大,如圖4(a)所示.對(duì)應(yīng)于圖4(a)中不同夾角下記錄的干涉條紋,計(jì)算了相應(yīng)的傅里葉頻譜,如圖4(b)所示.從傅里葉頻譜圖中可以清晰地發(fā)現(xiàn),隨著夾角θ逐漸增大,背景(0級(jí))頻譜、實(shí)像(+1級(jí))頻譜和共軛像(?1級(jí))頻譜之間彼此遠(yuǎn)離.基于此,可以適當(dāng)增大夾角θ,實(shí)現(xiàn)頻譜中實(shí)像(+1級(jí))和共軛像(?1級(jí))徹底分開.這使得在濾出實(shí)像(+1級(jí))頻譜時(shí)更容易,最終只需記錄單幅干涉圖來(lái)重構(gòu)相位,顯著降低系統(tǒng)的復(fù)雜程度.需要注意的是必須調(diào)節(jié)夾角θ,使其滿足2θ 6 sin?1(λ/2?x),以便于滿足探測(cè)器的采樣條件[23].在本文實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)滿足2θ 6 2.8?.

由于BS產(chǎn)生的透射光束和反射光束均為入射光束的復(fù)制像,參考光束和信號(hào)光束均來(lái)自同一入射光束,所以這種方法實(shí)質(zhì)上是一種共光束自干涉系統(tǒng).對(duì)測(cè)試樣品而言,希望被測(cè)試的樣品中細(xì)胞稀疏分布,僅僅包含幾個(gè)細(xì)胞就可滿足需要.為了更好地實(shí)現(xiàn)雙通路成像,在調(diào)節(jié)樣品時(shí),需要注意樣品的位置,盡可能使樣品只接觸照明光束的一半.透射光束中攜帶樣品信息的部分和反射光束中未攜帶樣品信息的部分分別作為信號(hào)光束和參考光束形成干涉,反之亦然,這樣就形成了雙通路干涉模式.最后,只使用一臺(tái)CMOS相機(jī)就可單次拍攝到雙通路離軸干涉圖.

圖4 夾角θ逐漸增大時(shí)干涉條紋的變化 (a)記錄的干涉條紋;(b)對(duì)應(yīng)于(a)的傅里葉頻譜Fig.4.Variation of interference fringes with increasing angle θ:(a)Recorded interference fringes;(b)Fourier spectra corresponding to(a).

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用草履蟲樣品來(lái)驗(yàn)證上述方法的可行性.考慮到草履蟲的實(shí)際大小(通常為180—280μm),選用一個(gè)數(shù)值孔徑為0.12,放大倍數(shù)為5倍的顯微物鏡來(lái)放大樣品.拍攝的干涉圖如圖5(a)所示,圖5(b)和圖5(c)分別顯示了圖5(a)中方框標(biāo)記部分的放大圖像.干涉圖的傅里葉頻譜分布如圖5(d)所示,用方框標(biāo)記出了+1級(jí)頻譜.圖5(e)和圖5(f)分別為圖5(b)對(duì)應(yīng)的二維解包裹相位圖及三維相位分布,圖5(g)為圖5(c)對(duì)應(yīng)的二維解包裹相位圖.

從圖5可以觀察到雙通路干涉情況.圖5(b)兩通路完全分離,而圖5(c)顯示兩干涉通路有重疊.從圖5(b)和圖5(c)可知,草履蟲的形狀清晰可見,干涉條紋的彎曲情況非常清晰并且方向相反,這揭示出兩干涉通路之間存在π相移.圖5(d)頻譜圖中0級(jí)、+1級(jí)和?1級(jí)頻譜徹底的分離,這說明本文方法可以很好地提取出實(shí)像.圖5(e)—圖5(g)再次清楚地顯示出兩通路、π相移和草履蟲的形貌.圖5(g)顯示雙通路重疊部分影響了相位信息的提取,這提醒在實(shí)驗(yàn)調(diào)節(jié)時(shí)要注意樣品位置.重要的是,基于雙通路干涉圖的π相移鏡像特性,可以對(duì)重構(gòu)的樣品相位信息進(jìn)行校正,實(shí)現(xiàn)定量分析.由于BS的對(duì)稱結(jié)構(gòu),兩個(gè)干涉通路也是彼此對(duì)稱的,則一個(gè)干涉通路中的相位最大值對(duì)應(yīng)另一干涉通路中的相位最小值.以不同干涉通路中相位最大值和最小值的對(duì)應(yīng)坐標(biāo)為基準(zhǔn),兩通路的對(duì)應(yīng)相位值相減后取平均值,該平均值即為所需的精確相位值(圖5(h)).圖5(h)中紅色和藍(lán)色曲線分別顯示了圖5(e)中左側(cè)和右側(cè)白色虛線標(biāo)記的豎直方向(分別包含了相位最大值和最小值)的相位分布,黑色曲線表示兩干涉通路的平均相位分布.可以看出,雙干涉通路可獲得更多的相位信息,樣品相位信息得到了較好的校正并且一定程度上降低了背景影響,這反映了本文方法的較好特性.綜上所述,利用本文方法成功實(shí)現(xiàn)了透明微小樣品的相位測(cè)量,揭示了樣品的三維形貌,證明了本文雙通路定量相位顯微術(shù)的可行性.

圖5 雙通路定量相位顯微術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (a)干涉圖;(b)和(c)分別為(a)中方框標(biāo)記部分的放大圖;(d)傅里葉頻譜圖,紅色方框標(biāo)記了+1級(jí)頻譜;(e)和(f)分別對(duì)應(yīng)(b)的二維解包裹相位圖及三維相位分布;(g)對(duì)應(yīng)(c)的二維解包裹相位圖;(h)對(duì)應(yīng)(e)中白色虛線標(biāo)記的豎直方向的相位輪廓分布曲線Fig.5.Experimental results:(a)Interferogram;(b)and(c)are the enlarged images of parts of the interferogram marked by box in(a);(d)Fourier spectrum,the+1 order spectrum marked with the red box;(e)and(f)are the 2D and 3D unwrapped phase maps corresponding to(b),respectively;(g)2D unwrapped phase map corresponding to(c);(h)Different vertical direction phase profile curves of cross-section at the location marked by the white dashed lines shown in(e),respectively.

4 結(jié) 論

利用BS的分光特性,通過調(diào)節(jié)BS中央半反射層和入射光束光軸之間的夾角,實(shí)現(xiàn)了一種雙通路定量相位顯微術(shù),并通過測(cè)量微小透明樣品的相位信息對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了驗(yàn)證.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本文方法具有雙通路干涉特性,兩通路均能夠成功地獲取樣品的相位信息.本文方法只需要一個(gè)單獨(dú)的BS,顯著地降低了系統(tǒng)的復(fù)雜程度,降低了成本并提高了系統(tǒng)穩(wěn)定性,容易操作,拓展了使用范圍.在將來(lái)的發(fā)展中,考慮將光源、顯微物鏡、BS和相機(jī)集成開發(fā),形成一種便攜式易于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)量的定量相位顯微裝置.