人SLC25A13基因內(nèi)含子突變IVS6-11A>G導致轉(zhuǎn)錄子剪接異常

陳君霖， 李海清， 劉妍霖， 李冰肖， 張占會

(1.暨南大學 生物醫(yī)學轉(zhuǎn)化研究院, 廣東 廣州 510632; 2.暨南大學 附屬第一醫(yī)院臨床 醫(yī)學研究院, 廣東 廣州 510632)

人SLC25A13基因位于7號染色體長臂(7q21.3)，基因總長度約160 kb，包含18個外顯子，轉(zhuǎn)錄子長度約3.4 kb，基因編碼由675個氨基酸組成的Citrin蛋白[1].Citrin 是人線粒體載體蛋白家族(mitochondrial carrier family, MCF)天冬氨酸/谷氨酸載體 (aspartate/glutamate carrier, AGC)兩種亞型 (isoform)之一， Citrin又被稱為AGC2，是特異性表達于肝臟中的 AGC 蛋白亞型[1-2].Citrin功能單位為二聚體結(jié)構，可將線粒體基質(zhì)合成的天冬氨酸與細胞胞漿內(nèi)的谷氨酸進行交換，并向線粒體內(nèi)提供一個H+質(zhì)子[3-5].

SLC25A13 基因突變會導致Citrin 蛋白活性異常，導致一系列復雜的生化代謝紊亂和臨床表現(xiàn)，形成常染色體隱性遺傳病-Citrin 缺陷病(citrin deficiency, CD).目前CD包括3種臨床表型：Citrin 缺陷導致的新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥(neonatal intrahepatic cholestasis caused by Citrin deficiency, NICCD, OMIM#605814)；成人發(fā)病瓜氨酸血癥 Ⅱ 型(adult-onset type Ⅱ citrullinemia, CTLN2, OMIM #603471)與Citrin 缺陷導致的生長發(fā)育落后和血脂異常(failure to thrive and dyslipidemia caused by citrin deficiency, FTTDCD).NICCD 主要發(fā)病于新生兒或小嬰兒，以肝大、黃疸和肝功能異常為主要臨床表現(xiàn)，而 CTLN2 主要發(fā)病于成年人或較大兒童，意識障礙和行為異常等神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)比較突出[6-9]，F(xiàn)TTDCD 是介于上述兩者之間過渡狀態(tài)[6,10-11].有研究報道我國Citrin 缺陷病的臨床表型主要為NICCD[11-12].

由于NICCD缺乏臨床或生化診斷標準，SLC25A13基因分析是其確診的可靠手段.根據(jù)人類基因突變數(shù)據(jù)庫(The Human Gene Mutation Database)最新數(shù)據(jù)(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=SLC25A13), 目前已確認SLC25A13突變100多種.據(jù)統(tǒng)計，包括錯誤突變、無義突變、剪接突變在內(nèi)的點突變居多，而位于內(nèi)含子以內(nèi)導致剪接異常的突變有多種，多位于與內(nèi)含子相鄰的5個內(nèi)含子堿基內(nèi)[13-14].位于內(nèi)含子較深內(nèi)部的突變，目前僅發(fā)現(xiàn)1例IVS6-11A>G報道，且文獻未能確切證實該突變會引起異常剪接及剪接異常形式[15].本研究通過pSPL3外顯子捕獲質(zhì)粒設計實驗，確認SLC25A13基因IVS6-11A>G (c.615-11A>G) 會導致出現(xiàn)新的剪接位點.

1 材料與方法

1.1 材料

胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；TRIzolTMReagent試劑，青鏈霉素混合液，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 購自美國Invitrogen公司；高保真酶PrimeSTAR? HS DNA Polymerase，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)購自大連寶生物公司；膠回收試劑盒(PureLinkTMQuick Gel Extraction Kit)購自Thermo Fisher Scientific公司；T4連接酶，XhoI，NheI兩種內(nèi)切酶購自New England Biolabs公司.

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析

為了預測突變位點變異是否影響前體mRNA剪接，應用Human Splicing Finder(HSF, http://www.umd.be/HSF3/)、NetGene2(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2)等在線軟件工具進行分析[16].

1.2.2 minigene外顯子捕獲載體構建

為了探究SLC25A13基因IVS6-11A>G突變是否影響mRNA剪接，采用pSPL3外顯子捕獲質(zhì)粒進行驗證，能有效驗證內(nèi)含子突變對mRNA剪接的影響[17-19]，主要包括空載體pSPL3 (BioVector NTCC)，正常對照質(zhì)粒pSPL3-N，包含SLC25A13基因Exon7 139 bp，intron6 661 bp, intron7 285 bp，突變質(zhì)粒pSPL3-Mu，包含IVS6-11G(圖1).套式PCR構建正常對照質(zhì)粒，以100 ng正常人gDNA為模板，使用高保真酶(PrimeSTAR? HS DNA Polymerase)，以引物citrin-IVS6F1，citrin-IVS7R1進行第1次PCR擴增，94 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)，最后再72 ℃延伸10 min；再以1 μL上述第1步PCR產(chǎn)物為模板，引物IVS6F-XhoI，IVS7R-NheI擴增(擴增條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)，最后再72 ℃延伸10 min.膠回收1 105 bp PCR產(chǎn)物，其5′包含XhoI酶切位點，3′包含NheI酶切位點，用于質(zhì)粒構建. XhoI酶，NheI酶雙酶切37℃，2 h膠回收產(chǎn)物及pSPL3質(zhì)粒，兩種酶切產(chǎn)物膠回收后使用T4連接酶連接.連接液熱激轉(zhuǎn)染感受態(tài)細胞E.coliDH5α，在含質(zhì)量濃度為100 μg/mL 氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上涂板過夜培養(yǎng)，以引物IVS6F-XhoI，IVS7R-NheI進行菌落鑒定，陽性克隆送廣州天一輝遠基因科技有限公司進行質(zhì)粒測序.將構建好的正常對照質(zhì)粒命名為pSPL3-N.

圖1 pSPL3-N和pSPL3-Mu質(zhì)粒設計

重疊延伸PCR構建點突變質(zhì)粒過程(圖2)，以pSPL3-N作為模板，分別以引物組合IVS6F-XhoI+ IVS6-11MR和IVS6-11MF+ IVS7R-NheI擴增， 94℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，最后再72 ℃延伸10 min，進行切膠回收.然后各取100 ng產(chǎn)物混合進行PCR, 94 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，最后再72 ℃延伸10 min，產(chǎn)物作為第3次PCR的模板，再以引物組合IVS6F-XhoI+ IVS7R-NheI擴增，94 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，最后再72 ℃延伸10 min，擴增目的條帶為1 105 bp，再按上述步驟進行酶切連接反應，轉(zhuǎn)染的感受態(tài)細胞為E.coliDH5α，測序篩選構建成功質(zhì)粒，構建好含有IVS6-11A>G突變點的質(zhì)粒命名為pSPL3-Mu，上述引物序列(表1).

1.2.3 細胞培養(yǎng)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

HEK 293 T細胞(human epithelial kidney 293 T，購自中山大學動物實驗中心)，培養(yǎng)條件為使用含質(zhì)量濃度為10%胎牛血清，青霉素、鏈霉素質(zhì)量濃度均為100 mg/L，DMEM培養(yǎng)基37 ℃，體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng).轉(zhuǎn)染前1 d，6孔板接種細胞50 000/孔，過夜培養(yǎng)24 h.按照Lipofectamine 2000 說明書方法分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒3 μg/孔，Lipofectamine 2000溶液9 μL與質(zhì)粒3 μg，轉(zhuǎn)染后36 h，收集細胞，提取總RNA.

紅色表示引入的酶切位點

Fig.2 Construction fragment with IVS6-11A>G mutation by overlap extension PCR

表1 擴增插入片段和逆轉(zhuǎn)錄 PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)分析用引物序列Table 1 The primers used in amplification of insert fragments and RT-PCR analysis

1)下劃線堿基示引入的XhoI 和NheI酶切位點，小寫字母單堿基為定點引入突變位點.

1)The underlined bases indicated the introduced restriction enzyme sites of XhoI and NheI, and lowercase letters indicated the introduced mutation sites.

1.2.4 總RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄PCR

用Trizol法抽提轉(zhuǎn)染細胞總RNA，然后進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作方法詳見說明書.以cDNA為模板，利用引物SD6， SA2進行PCR，引物序列(表1).擴增產(chǎn)物Sanger測序，與SLC25A13正?；蛐蛄泻蚼RNA序列進行比對分析.

2 結(jié)果

2.1 IVS6-11A>G突變的生物信息學預測及結(jié)果分析

網(wǎng)上在線軟件HSF預測結(jié)果顯示，IVS6-11A>G突變導致原來的剪接位點可能被沉默，激活1個新的內(nèi)含子剪接受體位點.HSF Matrices數(shù)據(jù)庫預測顯示，產(chǎn)生1個新剪接位點的概率為47.74%，在數(shù)據(jù)庫中當預測概率大于10%說明極大可能產(chǎn)生1個新的剪接位點,其導致Exon7前段插入10 bp，即新的剪接位置在IVS6-11G.NetGene2 Server預測顯示IVS6-11A>G突變形成新的剪接受體位點，位置在IVS6-11G，原來Exon7 5′端位點被沉默，與HSF預測相一致.

2.2 包含IVS6-11A>G突變的pSPL3-N和pSPL3-Mu載體的構建和驗證

為了驗證IVS6-11A>G突變是否導致SLC25A13 mRNA剪接異常，利用pSPL3外顯子捕獲質(zhì)粒構建質(zhì)粒pSPL3-N和pSPL3-Mu(圖1).構建的質(zhì)粒pSPL3-N和pSPL3-Mu的酶切驗證結(jié)果(圖3)，其測序結(jié)果(圖4).通過酶切驗證以及測序鑒定，證實質(zhì)粒構建成功，pSPL3-Mu質(zhì)粒已經(jīng)引入突變位點11G，pSPL3-N該位點為11A.

圖3 pSPL3-N和pSPL3-Mu質(zhì)粒XhoI、NheI酶切驗證圖

Fig.3 Verification of constructed plasmidspSPL3-NandpSPL3-Muby double-digestion with XhoI、NheI

2.3 IVS6-11A>G突變對SLC25A13基因表達剪接產(chǎn)物的影響

為了研究IVS6-11A>G突變對SLC25A13基因表達剪接產(chǎn)物的影響，將構建的pSPL3-N和pSPL3-Mu質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入HEK293T細胞，然后利用引物SD6和SA2進行RT-PCR擴增目標cDNA，從而分析mRNA剪接情況.測序結(jié)果顯示對照組pSPL3質(zhì)粒在293T細胞中SD與SA兩個外顯子正確拼接，擴增驗證片段大小為263 bp (圖5).正常對照pSPL3-N質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)HEK293T細胞后，插入的Exon 7與SD及SA正確的拼接，擴增片段大小為402 bp；而pSPL3-Mu擴增片段大小與pSPL3-N相接近，通過測序分析發(fā)現(xiàn)，在SD與Exon7中有突變點后原內(nèi)含子6的10 bp(-TTTATTTGAG-)堿基保留.可見，IVS6-11A>G突變導致SLC25A13基因內(nèi)含子6的3′端10個堿基保留于轉(zhuǎn)錄子中(r.615_616ins615-10_615-1)，分析顯示會導致蛋白翻譯提前終止(p. Ala206 Phefs*3).

圖4 pSPL3-N和pSPL3-Mu質(zhì)粒測序結(jié)果

pSPL3: 263 bp; pSPL3-N: 402 bp(263+139 bp); pSPL3-Mu: 412 bp(263+149)

3 討論

林壹明等[15]報道的人SLC25A13基因內(nèi)含子突變IVS6-11A>G是目前發(fā)現(xiàn)的唯一1例位于內(nèi)含子內(nèi)部的可疑剪接突變[13-15].本研究中借助于minigene剪接實驗，證實IVS6-11A>G導致剪接位點發(fā)生改變，Exon7原來的剪接位點被沉默，在突變點IVS6-11G位置形成新的剪接位點，致使內(nèi)含子6的3′ 10個堿基保留在成熟mRNA中，導致蛋白翻譯在插入堿基后不遠處終止 (p.Ala206Phefs*3)，使得citrin蛋白的部分N 端部分EF-hands基序(第1～319位氨基酸)、中部的整個跨膜的載體結(jié)構域(第320～612位氨基酸)，和C端兩性分子螺旋結(jié)構(第613～675位氨基酸)丟失[4]，citrin蛋白的AGC功能完全喪失，結(jié)果可明確突變IVS6-11A>G是致病突變.以往，常規(guī)分析SLC25A13致病突變時，包括二代全外顯子測序，多與外顯子和與其相鄰的內(nèi)含子序列的5個堿基相關，導致內(nèi)含子中的致病突變被忽視遺漏.因此，在臨床診斷過程中，對于臨床和生化指標高度疑似citrin缺陷病的患者，如果不能在外顯子和相鄰內(nèi)含子序列中發(fā)現(xiàn)致病突變時，要考慮通過mRNA分析或者蛋白分析來篩查可導致剪接異常的內(nèi)含子突變.

分析位于內(nèi)含子內(nèi)部的突變，尤其是剪接位點保守序列GT-AG以外的突變是否影響前體mRNA (pre-mRNA)剪接，是判定內(nèi)含子突變是否致病的難點之一.對于SLC25A13基因來說，借助于活檢肝組織或培養(yǎng)患者皮膚組織進行mRNA分析即可分析判斷[1,13].在我國因為肝組織活檢和皮膚成纖維細胞培養(yǎng)較難被患者接受，較為容易可以進行剪接分析的替代方法之一就是分析攜帶者外周血淋巴細胞(peripheral blood lymphocytes,PBLs)中SLC25A13 cDNA[20].分析可以在常規(guī)DNA分析未能找到突變的情況下，借助于mRNA的異常剪接情況提供的線索，結(jié)合內(nèi)含子突變的家系遺傳方式、人群攜帶率以及內(nèi)含子變異的生物信息學分析等綜合評估內(nèi)含子突變對剪接的影響方式.本研究利用患者的PBMC的mRNA分析確認SLC25A13基因突變IVS6+5G>A (c.615+5G>A)[14]；而由于未能及時采集到患者血液或肝活檢組織時，如果發(fā)現(xiàn)可疑的內(nèi)含子突變，則采用本研究使用的minigene剪接分析檢測是一種可靠的替代方法.