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    PKC和ROCK對(duì)硝苯地平舒張血管作用的影響*

    2018-10-29 09:46:52胡晶晶張玉潔李榮巧梁泰剛楊彩紅李青山
    中國病理生理雜志 2018年10期
    關(guān)鍵詞:阻斷劑激動(dòng)劑硝苯地平

    胡晶晶, 張玉潔, 李榮巧, 梁泰剛, 楊彩紅, 李青山△

    (山西醫(yī)科大學(xué) 1藥學(xué)院, 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 山西 太原 030001)

    由于心腦血管疾病具有較高的死亡率和致殘率,近年來對(duì)心腦血管疾病的治療引發(fā)了更多的關(guān)注。硝苯地平(nifedipine)作為第一代鈣拮抗劑,是治療心血管疾病高血壓、頑固性充血性心力衰竭和心絞痛的一線藥。目前認(rèn)為硝苯地平的主要作用機(jī)制是阻止鈣內(nèi)流,抑制血管、支氣管和子宮平滑肌的興奮-收縮偶聯(lián),產(chǎn)生松弛血管平滑肌,擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、周圍小動(dòng)脈及降低外周血管阻力[1]。蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)及Rho相關(guān)激酶(Rho-associated kinase,ROCK)作為治療心血管疾病的新靶點(diǎn),均屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是細(xì)胞內(nèi)很重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。迄今為止,已從哺乳動(dòng)物中分離出至少12種PKC亞型和20余種Rho家族成員。PKC及ROCK通常以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)其激活后從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞膜,并經(jīng)歷一系列復(fù)雜的磷酸化過程引發(fā)相應(yīng)的生物學(xué)功能改變,參與多種生理和病理過程?;罨蟮腜KC及ROCK參與肌動(dòng)蛋白骨架的調(diào)節(jié)和平滑肌細(xì)胞收縮等細(xì)胞活動(dòng),其高表達(dá)和異常活化與許多心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān),如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭和肺動(dòng)脈高壓等[2-3]。PKC及ROCK作為治療心血管疾病的靶點(diǎn)其活性狀態(tài)是否會(huì)影響硝苯地平的舒張血管作用目前還不清楚,因此,本課題在大鼠離體血管環(huán)上研究PKC和ROCK是否與硝苯地平舒血管作用有關(guān)。

    材 料 和 方 法

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備 八通道離體組織器官恒溫灌流裝置(成都泰盟科技有限公司);高靈敏度張力傳感器及PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(埃德儀器國際貿(mào)易有限公司);HH-601超級(jí)恒溫水浴(常州市頂新實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);PHS-3C型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。

    1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠,體重均為250~300 g,由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)為SYXK(晉)2015-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)條件為溫度(22±2)℃,濕度45%~60%,自由攝食及飲水。

    1.3實(shí)驗(yàn)試劑 苯腎上腺素(phenylephrine,PE)、去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)、乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)、氯化鋇(barium chloride,BaCl2)、四乙胺(tetraethylammonium,TEA)、4-氨基吡啶(4- aminopyridine,4-AP)、格列本脲(glibenclamide,Gli)、星孢菌素(staurosporine,STA)、佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)、法舒地爾(fasudil)、血管緊張素 II(angiotensin II,Ang-II)和硝苯地平均購自Sigma。其余試劑均為分析純。

    2 方法

    2.1大鼠主動(dòng)脈血管環(huán)的制備[4]大鼠斷頭處死后,迅速游離主動(dòng)脈,置于4 ℃、100% O2飽和的生理鹽溶液(physiologic salt solution, PSS)中,將分離干凈的血管剪成3~4 mm的分段血管環(huán),用2個(gè)三角型掛鉤貫穿血管環(huán)管腔,將其水平置于10 mL浴槽中,浴槽內(nèi)裝有5 mL PSS溶液,37 ℃恒溫,并持續(xù)通以100%的O2,下端固定,上端連于張力傳感器,PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)記錄血管張力變化。將基礎(chǔ)張力調(diào)至2 g左右,浴槽內(nèi)每隔15 min換PSS 1次,平衡1 h。制備去內(nèi)皮血管環(huán)時(shí),使用與主動(dòng)脈內(nèi)徑相當(dāng)?shù)拿薨舸┤胙軆?nèi)摩擦其內(nèi)壁2次,以求完全去除血管內(nèi)皮細(xì)胞。

    2.2血管環(huán)內(nèi)皮功能的檢測(cè) 用60 mmol/L的KCl預(yù)收縮血管環(huán)2次,以誘發(fā)血管的最大收縮幅度,待血管穩(wěn)定達(dá)到坪值后(即連續(xù)2次同樣的刺激所引起的收縮幅度差別小于5%),加入PE(10-6mol/L)使血管收縮,穩(wěn)定后,加入ACh(10-5mol/L),觀察血管的舒張情況來檢驗(yàn)內(nèi)皮完整性。以PE刺激收縮后的穩(wěn)定張力為100%,最大舒張幅度大于70%的血管環(huán)即認(rèn)為血管內(nèi)皮完整,最大舒張幅度小于5%的血管環(huán)即認(rèn)為血管內(nèi)皮已去除完全。

    2.3硝苯地平對(duì)大鼠主動(dòng)脈環(huán)基礎(chǔ)張力的影響 基礎(chǔ)狀態(tài)大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)用PSS平衡1 h,后加入累積濃度(10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L)的硝苯地平或等體積溶劑,觀察血管張力變化。

    2.4硝苯地平對(duì)內(nèi)皮完整組和去內(nèi)皮組主動(dòng)脈環(huán)張力的影響 血管環(huán)穩(wěn)定后,內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮的大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)分別經(jīng)NE(10-6mol/L)和KCl(60 mmol/L)預(yù)收縮,張力平衡后,實(shí)驗(yàn)組加入累積濃度的硝苯地平,對(duì)照組加入等體積溶劑,以分別加入NE和KCl誘發(fā)的血管環(huán)的最大收縮幅度為100%,計(jì)算施加硝苯地平后血管舒張幅度占最大收縮幅度的百分比,建立濃度-效應(yīng)曲線。

    2.5不同K+通道阻斷劑、PKC阻滯劑/激動(dòng)劑和ROCK阻滯劑/激動(dòng)劑對(duì)硝苯地平舒張血管作用的影響 血管環(huán)穩(wěn)定后,分別使用不同的工具藥孵育30 min,用NE和KCl預(yù)收縮血管,張力平衡后,加入累積濃度的硝苯地平,對(duì)照組為不加工具藥直接加入累積濃度的硝苯地平,記錄相應(yīng)血管環(huán)張力并計(jì)算變化值。

    2.6硝苯地平對(duì)CaCl2量效曲線的影響[5]血管環(huán)穩(wěn)定后,用無鈣含EGTA的PSS沖洗20 min,后將浴液更換為無鈣不含EGTA的生理鹽溶液,10 min后,更換為含KCl(60 mmol/L)無鈣的生理鹽溶液5 mL,預(yù)孵10 min,加入累積濃度(0.1 mmol/L、0.3 mmol/L、1 mmol/L、3 mmol/L和10 mmol/L)的CaC12,觀察血管環(huán)張力變化。給藥組在加CaC12前10 min加入不同濃度(10-9mol/L、5×10-8mol/L、10-6mol/L)的硝苯地平,空白對(duì)照組同時(shí)加入溶劑。以空白對(duì)照組累計(jì)加入CaCl2(10 mmol/L)后引起的收縮張力最大值為100%,建立濃度-效應(yīng)曲線。

    2.7硝苯地平對(duì)內(nèi)鈣釋放引起血管收縮的影響 血管環(huán)穩(wěn)定后,用無鈣含EGTA的生理鹽溶液沖洗,20 min后,將浴液更換為無鈣不含EGTA的生理鹽溶液,10 min后,實(shí)驗(yàn)組分別加入硝苯地平(10-9mol/L、5×10-8mol/L、10-6mol/L)孵育20 min后,加入NE,空白對(duì)照組同時(shí)加入等量溶劑,觀察血管的收縮情況。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用 SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用GraphPad Prism 6 作濃度-舒張效應(yīng)曲線,多組間比較釆用one-way ANOVA,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 硝苯地平對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)血管環(huán)張力的影響

    累積濃度硝苯地平對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)血管環(huán)張力無明顯影響,實(shí)驗(yàn)組與溶劑組對(duì)比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見圖1。

    Figure 1.The effect of nifedipine on basic tension of aortic rings. Mean±SD.n=6.

    圖1硝苯地平對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)主動(dòng)脈張力的影響

    2 硝苯地平對(duì)NE/KCl預(yù)收縮血管環(huán)張力的影響

    在NE(10-6mol/L)/KCl(60 mmol/L)誘導(dǎo)的血管環(huán)收縮反應(yīng)中,累積濃度硝苯地平對(duì)內(nèi)皮完整組與去內(nèi)皮組的主動(dòng)脈血管環(huán)均有濃度依賴性舒張作用。內(nèi)皮完整組最高累積濃度硝苯地平對(duì)血管環(huán)舒張百分比可達(dá)(96.47±6.00)% 和(97.84±2.78)%,去內(nèi)皮組中的舒張百分比為(94.87±4.28)%和(98.44±1.06)%,兩組數(shù)據(jù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見圖2。

    Figure 2.The relaxation effect of nifedipine on endothelium-intact (E+) and endothelium-denuded (E-) aortic rings precontracted with 10-6mol/L NE (A) or 60 mmol/L KCl (B). Mean±SD.n=6.**P<0.01vsvehicle group.

    圖2硝苯地平對(duì)NE和KCl預(yù)收縮血管環(huán)張力的影響

    3 K+通道阻斷劑對(duì)硝苯地平舒張血管作用的影響

    預(yù)孵Kir通道阻斷劑BaCl2(10-4mol/L)、KCa通道阻滯劑TEA(10-3mol/L)、KATP通道阻斷劑Gli(10-5mol/L)和KV通道阻斷劑4-AP(10-3mol/L),在NE(10-6mol/L)誘導(dǎo)的血管環(huán)收縮反應(yīng)中,最高累積濃度硝苯地平對(duì)血管環(huán)舒張百分比分別為(93.19±1.88)%、(97.05±1.86)%、(95.84±2.68)%和(94.77±2.39)%,與未加阻斷劑的硝苯地平組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性;在KCl(60 mmol/L)誘導(dǎo)的血管環(huán)收縮反應(yīng)中,最高累積濃度硝苯地平的最大舒張率分別為(95.04±3.79)%、(98.29±2.32)%、(98.29±2.32)%和(98.74±0.76)%,與未加阻斷劑的硝苯地平組比較,差異亦均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見圖3。

    Figure 3.The effects of pretreatment with BaCl2(10-4mol/L), TEA (10-3mol/L), Gli (10-5mol/L) and 4-AP (10-3mol/L) on the vasodilation effect of nifedipine in endothelium-intact aortic rings contracted by 10-6mol/L NE (A) or 60 mmol/L KCl (B). Mean±SD.n=6.

    圖3鉀通道阻斷劑對(duì)硝苯地平舒張血管作用的影響

    4 PKC對(duì)硝苯地平舒張血管作用的影響

    在NE(10-6mol/L)/KCl(60 mmol/L)誘導(dǎo)的血管環(huán)收縮反應(yīng)中,使用PKC抑制劑STA(10-8mol/L)后,最高累積濃度硝苯地平作用增強(qiáng)對(duì)血管環(huán)舒張百分比可達(dá)(101.99±0.81)%和(112.04±4.05)%,而PKC激動(dòng)劑PMA(10-7mol/L)則能減弱硝苯地平對(duì)血管的舒張作用,最高累積濃度硝苯地平對(duì)血管環(huán)舒張百分比降低為(61.38±8.15)%和(84.92±2.65)%,與硝苯地平組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖4。

    Figure 4.The effects of pretreatment with STA (10-8mol/L) and PMA (10-7mol/L) on the vasodilation effect of nifedipine in endothelium-intact aortic rings contracted by 10-6mol/L NE (A) or 60 mmol/L KCl (B). Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsnifedipine group.

    圖4PKC對(duì)硝苯地平舒張血管作用的影響

    5 ROCK對(duì)硝苯地平舒張血管作用的影響

    在NE(10-6mol/L)/ KCl(60 mmol/L)誘導(dǎo)的血管環(huán)收縮反應(yīng)中,ROCK抑制劑fasudil(10-6mol/L)能增強(qiáng)硝苯地平對(duì)血管的舒張作用,使用后最高累積濃度硝苯地平對(duì)血管環(huán)舒張百分比可達(dá)(103.67±2.36)%和(100.22±4.12)%,其激動(dòng)劑Ang-II(10-9mol/L)則能降低硝苯地平對(duì)血管的舒張作用,其最大舒張率分別為(63.34±4.35)%和(70.61±3.17)%,與硝苯地平組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖5。

    6 硝苯地平對(duì)CaCl2量效曲線的影響

    在含KCl(60 mmol/L)的無鈣生理鹽溶液中累計(jì)加入CaCl2,得到CaCl2的量效曲線。實(shí)驗(yàn)組預(yù)先用硝苯地平(10-9mol/L、5×10-8mol/L和10-6mol/L)分別預(yù)孵可濃度依賴性地減弱CaCl2對(duì)血管環(huán)的收縮效應(yīng),與對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖6。

    Figure 5.The effects of pretreatment with fasudil (10-6mol/L) and Ang-II (10-9mol/L) on the vasodilation effect of nifedipine in endothelium-intact aortic rings contracted by 10-6mol/L NE (A) or 60 mmol/L KCl (B). Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsnifedipine group.

    圖5ROCK對(duì)硝苯地平舒張血管作用的影響

    Figure 6.Inhibitory effect of nifedipine (10-9mol/L, 5×10-8mol/L and 10-6mol/L) on the contraction curves dependent on extracellular Ca2+addition (0.1~10 mmol/L) in endothelium-denuded, KCl-stimulated aortic ring preparations incubated in the Ca2+-free medium. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group.

    圖6硝苯地平對(duì)CaCl2量效曲線的影響

    7 硝苯地平對(duì)內(nèi)鈣釋放引起血管收縮的影響

    在無鈣生理鹽溶液中,用硝苯地平(10-9mol/L、5×10-8mol/L和10-6mol/L)預(yù)處理不能減弱NE對(duì)血管的收縮作用,與對(duì)照組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見圖7。

    討 論

    PKC和ROCK作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,與許多心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān),如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭、肺動(dòng)脈高壓等[6-7]。目前認(rèn)為這2種激酶在心血管系統(tǒng)的多種作用,是治療心血管管疾病的新靶點(diǎn)。硝苯地平可用于多種疾病,如高血壓、心絞痛、心肌梗塞、充血性心力衰竭等心血管疾病,也可用于呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)疾病[1,8]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究PKC及ROCK作為心血管疾病的治療靶點(diǎn),其活性是否會(huì)影響硝苯地平對(duì)血管的舒張作用。

    Figure 7.The effects of nifedipine (10-9mol/L, 5×10-8mol/L and 10-6mol/L) on contraction via NE (10-6mol/L) in Ca2+-free solution. Mean±SD.n=6.

    圖7硝苯地平對(duì)內(nèi)鈣釋放的影響

    研究發(fā)現(xiàn),PKC與ROCK共存于同一細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路,且在ROCK上游發(fā)揮作用[9]。ROCK的經(jīng)典底物是肌球蛋白輕鏈20(myosin light chain 20,MLC20)和肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP),它們是參與細(xì)胞舒縮運(yùn)動(dòng)的重要蛋白分子。在血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)中,ROCK能夠直接激活MLC20,也能抑制MLCP的活性,間接增加MLC20磷酸化水平,進(jìn)而使VSMCs收縮[10]。本研究結(jié)果顯示,ROCK抑制劑fasudil(10-6mol/L)及PKC抑制劑STA(10-8mol/L)可以明顯增大硝苯地平的舒血管作用,表明ROCK和PKC可能協(xié)同介導(dǎo)血管收縮作用;而預(yù)孵ROCK激動(dòng)劑Ang-II(10-9mol/L)及PKC激動(dòng)劑PMA(10-7mol/L)能夠使硝苯地平的舒血管作用減弱,表明硝苯地平的舒張血管作用可能與抑制PKC-ROCK信號(hào)通路有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),平滑肌所特有的分子量17 kD的PKC增強(qiáng)蛋白磷酸酶1抑制物(PKC-potentiated protein phosphatase 1 inhibitor of 17 kD,CPI-17)也是ROCK的重要底物之一,活化狀態(tài)的ROCK能磷酸化CPI-17,后者與MLCP結(jié)合,掩蓋MLCP的靶亞基1從而抑制MLCP的活性,促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的收縮,這種收縮與Ca2+濃度無關(guān),為鈣非依賴性調(diào)節(jié),即Ca2+敏化過程[11]。由PKC介導(dǎo)的Ca2+增敏機(jī)制也不依賴于Ca2+的內(nèi)流[12]。PKC主要通過直接激活MLCK及ROCK參與血管的收縮反應(yīng),CPI-17作為鈣離子敏感性的潛在介質(zhì),亦能被PKC磷酸化,進(jìn)而抑制MLCP的活性,間接增加MLC20的磷酸化水平,進(jìn)而促進(jìn)血管收縮。也就是說CPI-17作為ROCK和PKC的共同底物參與激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞收縮,與鈣敏感性有關(guān)[13]。ROCK激動(dòng)劑Ang-II(10-9mol/L)及PKC激動(dòng)劑PMA(10-7mol/L)能夠使硝苯地平的舒血管作用減弱,可能干擾了ROCK及PKC介導(dǎo)的收縮蛋白對(duì)Ca2+增敏的過程。

    血管的舒張不僅與PKC、ROCK等信號(hào)密切相關(guān),也與血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌上的鉀通道、鈣通道等密切相關(guān),為排除相關(guān)因素的影響,我們進(jìn)一步研究了硝苯地平對(duì)內(nèi)皮、離子通道的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),硝苯地平對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)下血管環(huán)的靜息張力無明顯作用,對(duì)KCl及NE預(yù)收縮內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)具有明顯的舒張作用,且呈濃度依賴性,內(nèi)皮完整組與去內(nèi)皮組比較無明顯差異。因此,硝苯地平對(duì)血管的舒張作用可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞無關(guān),而是直接作用于血管平滑肌。

    血管平滑肌的舒縮活動(dòng)跟其上的鉀通道活性密切相關(guān),鉀通道活性的改變可引起血管平滑肌細(xì)胞膜電位的去極化或超極化,從而改變VSMCs的膜電位及興奮性[14-15]。為排除鉀通道在硝苯地平舒血管中的作用,我們使用了Kir阻斷劑(BaCl2,10-4mol/L)、 KCa阻斷劑(TEA,10-3mol/L)、 KATP阻斷劑(Gli,10-5mol/L)和KV阻斷劑(4-AP,10-3mol/L),結(jié)果發(fā)現(xiàn)均不能抑制硝苯地平的舒張血管作用,提示硝苯地平的舒血管作用可能與4種鉀通道無關(guān)。

    血管平滑肌上的電壓依賴性鈣通道和受體操縱性鈣通道,可分別被高鉀和NE激活。在無鈣環(huán)境中,用高濃度的KCl使血管去極化,硝苯地平能夠濃度依賴性地抑制該情況下由CaCl2引起的血管收縮。由此表明,硝苯地平可以抑制Ca2+通過電壓依賴鈣通道內(nèi)流,從而使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度降低,進(jìn)而引起血管舒張。在無鈣的生理鹽溶液中,用硝苯地平預(yù)處理不能減弱NE對(duì)血管的收縮作用,而在有鈣的環(huán)境下硝苯地平能夠明顯抑制NE刺激主動(dòng)脈環(huán)引起的收縮,表明硝苯地平可拮抗外鈣內(nèi)流,介導(dǎo)其對(duì)血管的舒張作用,其舒張血管的作用與內(nèi)鈣釋放無關(guān)。

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