鹽酸小檗堿通過PI3K/Akt信號通路促進小鼠前成骨細胞MC3T3-E1的分化*

江 健， 廖莉婭， 容 嬋， 陳捷僑， Ashish SHRESTHA， 劉星琦， 蘇 雅， 舒曉春△

(1中山大學附屬第五醫(yī)院， 廣東 珠海 519000； 2南方醫(yī)科大學附屬順德醫(yī)院， 廣東 佛山 528300)

骨質疏松癥(osteoporosis)是最常見的代謝性骨骼疾病，其特點是骨量減低，骨質強度減弱，骨微結構破壞，從而骨折的風險增加[1]。隨著人口老齡化的不斷增加，我國作為世界上老年人口絕對數最大的國家，正面臨著骨質疏松癥高患病率的嚴峻的挑戰(zhàn)，據統(tǒng)計，我國50歲以上人群骨質疏松癥患病率女性為20.7%，男性為14.4%[2]。目前治療骨質疏松癥的藥物主要是抑制骨吸收藥物，包括雙膦酸鹽、降鈣素和雌激素[3]。然而，有研究表明這些藥物的使用可能引起一些副作用，包括骨壞死、非典型股骨骨折和食道癌等[4]。因此，探索更加安全、健康的天然藥物來治療骨質疏松顯得尤為重要，已有研究發(fā)現一些天然藥物，如骨碎補總黃酮、淫羊藿苷和鹽酸小檗堿等都有促進成骨分化和抗骨質疏松的潛能[5-7]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)通路是與新陳代謝、增殖、分化及凋亡關系密切的信號通路[8]，蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/Akt)是PI3K激活的主要信號分子，它隨后通過磷酸化對下游的多種物質產生作用[9]。此外，PI3K/Akt信號通路在成骨和破骨細胞的形成、分化以及氧化損傷的調節(jié)中起著重要作用[10-13]。鹽酸小檗堿(berberine，BBR)是一種生物堿，如今，關于BBR促進成骨細胞分化的作用機制仍不是十分清楚。本研究通過探討B(tài)BR對前成骨細胞分化與礦化的影響，檢測成骨細胞相關分化分子的表達情況，并探討其機制是否與BBR激活PI3K/Akt信號通路有關，為進一步促進黃連素的臨床應用提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細胞 小鼠前成骨細胞系MC3T3-E1由南方醫(yī)科大學提供。

1.2藥物和主要試劑 鹽酸小檗堿(純度>98%)購于東京化成工業(yè)株式會社；PI3K/Akt 信號通路特異性抑制劑LY294002(碧云天生物公司)；α-MEM細胞培養(yǎng)基(Gibco)；四季青胎牛血清(浙江天航生物科技有限公司)； CCK-8試劑盒(同仁化學研究所)；BCA蛋白檢測試劑盒(凱基生物公司)；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性檢測試劑盒(南京建成生物公司)；real-time PCR所用引物及定量檢測SYBR Green(上海生物工程公司);茜素紅S染液(翔博生物公司)；抗體β-actin (Santa Cruz);抗體p-Akt(CST)；羊抗小鼠及羊抗兔Ⅱ抗(Abclonal)；極超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(碧云天生物公司)。

2 主要方法

2.1前成骨細胞MC3T3-E1的培養(yǎng) 細胞復蘇后加入4 mL完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液一次，顯微鏡觀察細胞生長狀況，待細胞生長融合到80%后，PBS洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶2 mL，37 ℃靜置1 min, 加入4 mL完全培養(yǎng)基終止消化，800 r/min離心5 min，棄上清, 加入4 mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，接種到培養(yǎng)瓶中，37 ℃、CO2體積分數為5%的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

2.2細胞活性測定 細胞接種在96孔板中，密度為每孔3 000個細胞，待細胞基本融合后，采用不同濃度(0,1,5,10和20 mg/L)的鹽酸小檗堿進行干預，3 d后，使用CCK-8試劑盒檢測細胞活性。每孔加入含10% CCK-8試劑的培養(yǎng)基100 μL，37 ℃孵育4 h，酶標儀選擇450 nm波長檢測其吸光度(A)值。計算細胞活性，結果用與對照組的百分比表示。

2.3堿性磷酸酶活性的測定 MC3T3-E1細胞按1×108cells/L的密度接種2 mL于6孔板中，待細胞融合至80%，加不同濃度(0、1、5、10和20 mg/L)的鹽酸小檗堿分別培養(yǎng)3 d和7 d，每2 d更換一次培養(yǎng)基。測定步驟參照ALP檢測試劑盒提供的方法：棄除培養(yǎng)基后，PBS清洗2遍，加入含有1% Triton X-100的細胞裂解200 μL，冰上裂解30 min，低溫離心機4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取上清液用BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度，用ALP檢測試劑盒在酶標儀波長520 nm處檢測其A值，計算堿性磷酸酶活性。

2.4成骨細胞分化相關因子mRNA水平表達情況的測定 成骨細胞分化相關因子ALP、骨鈣素(osteocalcin， OCN)、骨橋蛋白(osteopontin， OPN)及Runt相關轉錄因子2(Runt-related transcription factor 2， Runx2)是成骨分化實驗重要的檢測指標。本實驗將前成骨細胞按1×108cells/L密度接種2 mL于6孔板中培養(yǎng)，待細胞基本融合后，實驗分為對照(control)組，BBR組，BBR+LY249002組和LY249002組，BBR+LY249002組及LY249002組加入含抑制劑(10 mmol/L LY294002)的無血清培養(yǎng)基預處理1 h，吸凈培養(yǎng)液，后分別加入含藥(5 mg/L BBR)培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，后用PBS洗2遍，加入200 μL TRIzol reagent提取細胞總RNA。逆轉錄試劑盒購于TaKaRa，每10 μL的逆轉錄體系含總RNA 600 ng。Real-time PCR分析采用SYBR Green real-time PCR試劑盒，引物如表1所示，反應條件： 95 ℃ 3 min; 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。GAPDH作為內參照，數據使用2-ΔΔCt方法進行分析。

表1 Real-time PCR引物序列

2.5Western blot檢測PI3K/Akt通路相關蛋白的表達 細胞按1×108cells/L的密度接種4 mL于直徑為60 mm的培養(yǎng)皿中，待細胞融合至80%后，對各實驗組(對照組、BBR組、BBR+LY249002組和LY249002組)做相應的處理，藥物干預48 h后，用PBS洗2遍，加入200 μL的細胞蛋白裂解液(含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑)，冰上裂解30 min。4 ℃、12 000×g離心15 min，收集上清液。用BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液在100 ℃加熱10 min進行蛋白變性。每孔加入等量的蛋白質(10 μg)進行10% SDS-PACE，200 mA轉膜120 min。QuickBlockTM封閉液封閉30 min，加入Ⅰ抗4 ℃條件下孵育過夜，TBST洗膜3次，首次15 min，其余10 min，加入Ⅱ抗孵育1 h,TBST清洗3次。用ECL進行發(fā)光顯影，通過蛋白條帶灰度分析進行定量測定。

2.6茜素紅S染色及半定量測定 MC3T3-E1細胞按2×107cells/L的密度接種1 mL于24孔板中，普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分為4個處理組(對照組、BBR組、BBR+LY249002組和LY249002組)，經過藥物和抑制劑處理以后加入細胞誘導分化培養(yǎng)基(10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和50 mg/L抗壞血酸)培養(yǎng)21 d，培養(yǎng)基每2 d換一次，誘導分化完成后，PBS沖洗2遍，用70%乙醇固定1 h，后PBS沖洗3遍，用茜素紅S染液(40 mmol/L,pH 4.2)37 ℃染色1 h。染色完成后用無鈣、鎂離子的PBS沖洗5遍，顯微鏡下觀察礦化結節(jié)形成情況。用100 nmol/L的氯化十六烷基吡啶溶液溶解染色后的礦化結節(jié)，并用酶標儀在波長為540 nmol/L處測定各實驗組的A值。

3 統(tǒng)計處理

采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，結果以均值±標準差(mean±SD)表示。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 鹽酸小檗堿在一定濃度內對MC3T3-E1細胞活性無影響

CCK-8實驗結果顯示，與對照組比較，不同濃度鹽酸小檗堿干預后，細胞活性沒有明顯差異，見圖1。

Figure 1.Effects of BBR at different concentrations on the viabi-lity of MC3T3-E1 cells. Mean±SD.n=3.

圖1不同濃度鹽酸小檗堿對MC3T3-E1細胞活性的影響

2 鹽酸小檗堿增加前成骨細胞ALP活性

MC3T3-E1細胞經不同濃度的鹽酸小檗堿培養(yǎng)3 d后，5 mg/L BBR組的ALP活性明顯高于對照組(P<0.01)；加藥培養(yǎng)7 d，與對照組相比，不同濃度BBR組的ALP活性都有增加，其中5 mg/L BBR組的ALP活性最高，因此，后續(xù)實驗中BBR組均采用5 mg/L這一濃度，見圖2。

Figure 2.Effects of BBR at different concentrations on ALP activity in MC3T3-E1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vs0 mg/L group at the same time.

圖2不同濃度鹽酸小檗堿對MC3T3-E1細胞ALP活性的影響

3 鹽酸小檗堿促進MC3T3-E1細胞成骨分化相關因子的表達，其作用被LY249002抑制

與對照組相比，BBR處理顯著提高MC3T3-E1細胞ALP、OCN、OPN和Runx2的mRNA表達(P均<0.01)；與BBR處理組相比，BBR+LY294002組與LY294002組的成骨分化相關因子的mRNA表達均明顯減低(P<0.01)，見圖3。

4 鹽酸小檗堿促進MC3T3-E1細胞p-Akt蛋白的表達，其作用被LY249002抑制

Western blot分析顯示，與對照組相比，BBR組p-Akt蛋白表達顯著增加(P<0.01)，而BBR+LY294002組與LY294002組p-Akt的表達均明顯降低(P<0.01),見圖4。說明鹽酸小檗堿能促進Akt磷酸化，激活PI3K/Akt信號通路，而LY294002能抑制鹽酸小檗堿對PI3K/Akt信號通路的激活作用。

Figure 3.Effects of BBR and PI3K/Akt pathway inhibitor LY249002 (LY) on the mRNA expression of the molecules related to osteogenic differentiation in MC3T3-E1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05，##P<0.01vsBBR group.

圖3鹽酸小檗堿與PI3K/Akt信號通路抑制劑LY249002對MC3T3-E1細胞成骨分化相關因子mRNA表達的影響

5 鹽酸小檗堿促進MC3T3-E1細胞的礦化，其作用被LY249002抑制

經礦化誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)21 d，茜素紅S染色后礦化結節(jié)呈紅色。與對照組相比，BBR組鈣結節(jié)形成明顯；與BBR處理相比，BBR+LY294002組及抑制劑LY294002處理組細胞鈣沉積面積明顯減少。溶解礦化結節(jié)進行定量分析，檢測數據表明，BBR組礦化結節(jié)溶解液的吸光度明顯高于對照組；BBR+LY294002組及LY294002處理組礦化結節(jié)溶解液的吸光度明顯低于BBR組(P<0.01)，見圖5。這說明鹽酸小檗堿能促進前成骨細胞的礦化，而LY294002能抑制鹽酸小檗堿促進前成骨細胞的礦化作用。

Figure 4.Effects of BBR and PI3K/Akt pathway inhibitor LY249002(LY) on the expression of p-Akt protein associated with PI3K/Akt signaling pathway in MC3T3-E1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsBBR group.

圖4鹽酸小檗堿與PI3K/Akt信號通路抑制劑LY249002對MC3T3-E1細胞PI3K/Akt信號通路相關蛋白p-Akt表達的影響

Figure 5.Effects of BBR and PI3K/Akt pathway inhibitor LY249002(LY) on mineralization of MC3T3-E1 cells (alizarin red S staining, ×40). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsBBR group.

圖5鹽酸小檗堿與PI3K/Akt信號通路抑制劑LY249002對MC3T3-E1細胞礦化的影響

討 論

骨質疏松癥是全球范圍內日益嚴重的公共健康問題，其防治與愈后也受到國內外學者的高度關注，然而，目前用于治療骨質疏松的藥物存在一定的副作用，以及療效受其他藥物影響，從而一定程度上限制其使用。因此尋求和研發(fā)安全，有效的抗骨質疏松藥物是目前亟待解決的問題。

BBR是一種從中草藥中分離出來的異喹啉類生物堿[14]，具有多種藥理作用，包括抗菌[15]、抗腫瘤[16]、抗炎[17]、抗氧化及抗凋亡[18]等，最新研究發(fā)現BBR可在抗骨質疏松中發(fā)揮重要作用[19]。有研究表明BBR可通過介導p38 MAPK/Runx2信號通路直接促進骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的成骨分化[5]。另一項研究指出，BBR不僅可以通過增強Runx2的表達，還可以通過激活經典的Wnt/β-catenin信號通路來刺激MSCs的成骨分化[20]。在本研究中，我們發(fā)現BBR可能通過激活前成骨MC3T3-E1細胞中的PI3K/Akt信號通路，從而促進前成骨細胞的分化和鈣化。為闡明BBR對前成骨細胞分化的調控作用，我們檢測了不同濃度BBR對前成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響，此外，本實驗還對成骨細胞分化相關分子ALP、OCN、OPN和Runx2進行了研究。成骨細胞分化相關分子中, Runx2屬于轉錄因子Runx家族成員，是成骨細胞分化和骨形成最關鍵的轉錄因子之一[21],它可以有效地啟動主要骨基質蛋白基因的表達。

據報道,Runx2能夠改善PI3K信號通路的活性,增加p85、p110β和Akt的蛋白表達，同時PI3K/Akt信號通路又可以改善Runx2和Runx2轉錄所依賴的DNA分子結合[22]，它們在成骨細胞分化調控中相互依賴。此外，Runx2可以通過與啟動子結合，上調成骨基因OPN和OCN的表達來調控成骨細胞的分化[23]。成骨細胞分化過程分為2個階段，在第一階段，ALP的表達促進細胞分化，ALP是成骨細胞分化早期最常用的標志物之一，同時它也是一種重要的酶，能催化和上調成骨細胞分化基因OPN的表達[24]；在第二階段，通過鈣沉積而使基體礦化，在原始軟骨周圍形成一層海綿狀的骨組織，然后海綿狀骨充滿骨基質，成為致密骨，從而增進骨的鈣化使硬度增加[25]。因此，ALP活性作為早期分化標志物，OCN是成骨細胞分化的終末標志，代表成骨細胞的成熟和基質礦化過程。本研究發(fā)現，BBR有明顯增強MC3T3-E1細胞ALP活性與增加MC3T3-E1細胞鈣結節(jié)形成的作用，在藥物濃度為5 mg/L時作用最為明顯。Real-time PCR分析顯示，BBR增加了ALP、OPN、OCN和RUNX2的mRNA表達。然而，PI3K/Akt抑制劑LY294002抑制了該藥物的促進作用，表明BBR刺激MC3T3-E1成骨分化的能力可能通過PI3K/Akt信號通路參與調節(jié)。

PI3K/Akt信號通路在細胞增殖、分化、黏附和凋亡中起著重要作用[26]。Akt是PI3K/Akt信號通路的關鍵蛋白之一，作為PI3K下游關鍵的激酶，是細胞增殖、生長和存活的主要介導因子[27]。p-Akt作為Akt激活后的介導物質，通過激活PI3K/Akt信號通路下游的動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)，從而干擾細胞凋亡并促進增殖和運動[28]。PI3K/Akt信號通路在神經細胞以及心肌細胞缺血保護中起著重要作用[29]。此外，許多研究表明PI3K/Akt信號通路與骨組織代謝之間存在密切關系, 在成骨細胞中，活化PI3K/Akt信號通路能刺激細胞的增殖和分化，同時也能抑制細胞凋亡[30]。在治療骨質疏松癥的藥物中，很多藥物的作用通過對PI3K/Akt通路的調控來完成，如丹參素通過活化P13k/Akt通路減少骨質疏松大鼠中成骨細胞的凋亡[31]；淫羊藿苷通過調節(jié)PI3K/Akt通路對糖皮質激素引起的骨質疏松癥具有一定的防治作用[6]。為了探究PI3K/Akt通路是否在BBR促進MC3T3-E1細胞分化和礦化過程中起著重要作用，我們在MC3T3-E1細胞干預中使用PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002,Western blot結果表明與對照組相比，BBR組促進了MC3T3-E1細胞p-Akt蛋白的表達，而LY294002預處組p-Akt蛋白的表達明顯下降。同樣，LY294002預處理組，ALP、OCN、OPN和Runx-2的mRNA表達也有明顯下降趨勢，但BBR組的mRNA表達明顯增加。這些結果表明PI3K/Akt通路可能在BBR對MC3T3-E1細胞的分化和鈣化的調控中起著重要作用。

綜上所述，BBR具有促進前成骨細胞分化和礦化的作用，其作用機制可能是通過激活PI3K/Akt信號通路來完成。因此，BBR有治療骨質疏松癥的潛能，為臨床使用BBR治療骨質疏松提供相應的實驗依據，但該信號通路下游的調節(jié)機制尚有待進一步研究。