α-硫辛酸對(duì)糖尿病大鼠腎臟miR-21和Smad7表達(dá)及纖維化的影響*

毛彥穩(wěn)， 張小歡， 彭 偉， 劉慧銘， 劉玲伶, 王圓圓， 劉麗榮， 張瑩瑩， 張 帆， 石明雋， 肖 瑛， 湯 磊， 郭 兵△

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1病理生理學(xué)教研室， 2重大疾病發(fā)病機(jī)制及藥物防治特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025； 3貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科， 4貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 貴州 貴陽 550004)

在糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)可通過激活 Smads 信號(hào)通路誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)并促進(jìn)腎間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)(extracel lular matrixc，ECM)的合成，進(jìn)而造成廣泛的腎組織纖維化[1-3]。Smad7作為抑制性Smad蛋白，可以抑制 TGF-1/Smads信號(hào)通路介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)。本課題組在DN的纖維化進(jìn)程中發(fā)現(xiàn)，Smad7蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，且伴有miR-21表達(dá)上調(diào)及TGF-β1/Smads 信號(hào)通路過度激活[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可以通過上調(diào)miR-21表達(dá)而下調(diào)Smad7蛋白水平，進(jìn)而促進(jìn)纖維化的發(fā)生發(fā)展[5]。

α-硫辛酸(alpha-lipoic acid，ALA)是一種含硫的抗氧化劑，可以清除活性氧簇，對(duì)氧化應(yīng)激引起的組織損傷有治療作用。而氧化應(yīng)激也是DN的重要的發(fā)病因素之一，因此本研究通過觀察抗氧化劑ALA對(duì)糖尿病(diabetes mellitus，DM)大鼠腎臟纖維化病變的影響，以miR-21和Smad7為靶點(diǎn)，探討其可能的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重(180±20) g，共24只，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，批號(hào)為SCXK(京) 2009-0004。

1.2主要試劑 ALA(奧立寶公司)；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)及抗collagen I和collagen III單克隆抗體(Sigma)；抗Smad7和TGF-β1多克隆抗體(Santa Cruz)；抗β-actin抗體(Promed)；miR-21轉(zhuǎn)錄和real-time PCR試劑(廣州銳博生物公司)；I 抗稀釋液、ECL顯色劑和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物研究所)；Western blot用PVDF膜和3 mm Whatman濾紙(Millipore)。

1.3主要儀器 穩(wěn)步倍加型血糖儀(強(qiáng)生公司)；超低溫冰箱(Sanyo)；高速低溫離心機(jī)、Bayer1650全自動(dòng)生化分析儀(Beckman)；電泳系統(tǒng)及電轉(zhuǎn)移裝置(Amersham)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)；DP72顯微鏡(OLYPUMS)。

2 方法

2.1動(dòng)物模型復(fù)制及分組 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周后，尾靜脈注射溶于無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.5，0.01 mol/L)的STZ(55 mg/kg)，復(fù)制DM大鼠模型，72 h后測(cè)大鼠空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L且尿糖陽性認(rèn)為造模成功，隨機(jī)分成DM組和ALA組。成模后，采取灌胃方式給予ALA治療，ALA溶于5%的羧甲基纖維素鈉中，灌胃劑量為150 mg·kg-1·d-1，每周給藥6 d，每3 d配藥一次(4 ℃保存)；并設(shè)鼠齡相同的正常對(duì)照(normal control, NC)組，灌胃同等濃度同等劑量的羧甲基纖維素鈉；給藥6周后處死所有SD大鼠，期間所有大鼠予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，每周監(jiān)測(cè) 1 次血糖和體重。

2.2標(biāo)本收集 大鼠處死前1 d用代謝籠收集24 h尿，記錄尿量，取部分尿液離心后-20 ℃保存；處死前禁食6～8 h，乙醚麻醉后稱重，股動(dòng)脈穿刺采血，分離血清-20 ℃保存；開腹取雙側(cè)腎臟，去掉包膜及周圍脂肪組織，稱重記錄腎重/體重指數(shù)(kidney weight/body weight，KW/BW)，分別用4%多聚甲醛固定及-80 ℃保存。

2.3生化指標(biāo)測(cè)定 采用葡萄糖氧化酶法測(cè)血葡萄糖(blood glucose，BG)水平，酶分析法檢測(cè)血總膽固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)水平；鄰苯三酚紅比色法測(cè)尿蛋白(urine protein，UP)含量，均按試劑盒說明書操作，尿蛋白濃度與尿量乘積為24 h UP。

2.4腎組織病理檢查 多聚甲醛固定腎組織,制成3 μm厚的石蠟切片，行HE及Masson染色，用顯微鏡觀察并采集圖像，Masson染色結(jié)果運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0軟件掃描圖像并分析各圖積分吸光度。

2.5Western blot檢測(cè)蛋白水平 取-80 ℃保存的各組大鼠腎皮質(zhì)，每只樣本取200 mg， 分別加入組織蛋白提取液后勻漿離心取上清，用BCA試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度，按所測(cè)得濃度計(jì)算每泳道所需體積，加入加樣緩沖液煮沸10 min，經(jīng)8%的SDS-PAGE分離，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入抗β-actin、Smad7、TGF-β1、 collagen I和collagen III抗體(稀釋度分別為 1∶4 000、1∶300、1∶300、1∶1 000和1∶500)，4 ℃孵育過夜；次日，TBST洗膜后，加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗(稀釋度均為1∶4 000)室溫孵育1 h，加ECL熒光顯色液，凝膠成像儀曝光，Image Lab軟件分析各條帶調(diào)整體積值，每個(gè)樣本重復(fù)操作3次，以β-actin蛋白條帶作為內(nèi)參照，結(jié)果用目標(biāo)蛋白/β-actin值表示。

2.6RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 按天根公司試劑盒說明書，用 TRIzol法提取各組大鼠腎組織的總 RNA；以20 μL 反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)合成cDNA，miR-21引物由生物工程有限公司合成，miR-21的上游引物序列為5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物序列為5’-CAGCCCATCGACTGGTG-3’;U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，采用Bio-Rad CFX 96熒光定量 PCR分析系統(tǒng)進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果以2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)采用SNK-q檢驗(yàn)；不齊時(shí)采用Games-Howell檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

大鼠在注射STZ 72 h后，BG明顯升高并持續(xù)在高水平。給藥6周后，DM組的KW/BW、BG、TC、TG和24 h UP與NC組相比均顯著升高(P<0.05)；與DM組相比，ALA組的KW/BW、TC、TG和24 h UP均降低(P<0.05)，而BG無明顯變化，見表1。

表1各組大鼠腎重/體重指數(shù)和生化指標(biāo)的變化

Table 1.The changes of the kidney weight/body weight (KW/BW), blood glucose (BG), 24-h urine protein (24 h UP), total cholesterol (TC) and triglyceride (TG) in each group after treatment with alphalipoic acid (ALA) for 6 weeks (Mean±SD.n=8)

GroupKW/BW (mg/g)BG (mmol/L)24 h UP (mg)TC (mmol/L)TG (mmol/L)NC7.09±0.445.38±1.033.02±0.491.37±0.191.39±0.33DM12.11±0.90*26.90±1.56*20.96±0.88*2.37±0.31*2.50±0.57*ALA10.57±0.56*#25.56±1.72*16.12±0.71*#1.50±0.31#1.47±0.40#

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDM group.

2 腎組織的病理改變

HE及Masson染色可見NC組大鼠腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，基底膜完整，間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤；DM組大鼠腎小管腔擴(kuò)張明顯，腎小管基底膜不規(guī)則增厚，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡狀改變，間質(zhì)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，腎小管間質(zhì)Masson染色陽性物質(zhì)增多(P<0.05)；ALA組大鼠腎臟病變有不同程度的改善，腎小管間質(zhì)Masson染色陽性物質(zhì)明顯減少(P<0.05)，炎性細(xì)胞浸潤減輕，空泡狀改變不明顯，見圖1、2。

3 Western blot結(jié)果

NC組中，Smad7高表達(dá)，而TGF-β1蛋白表達(dá)和Smad2/3的活化水平較低，即TGF-β1/Smads信號(hào)活化較少，collagen I 和 collagen III 僅有少量表達(dá)；DM組中Smad7表達(dá)水平較NC組顯著下調(diào)(P<0.05)，而TGF-β1/Smads信號(hào)活化水平較正常組增加(P<0.05)，collagen I 和 collagen III 表達(dá)水平較NC組上調(diào)(P<0.05)；ALA組中Smad7表達(dá)水平與DM組相比上調(diào)(P<0.05)，TGF-β1/Smads信號(hào)活化水平較DM組降低(P<0.05)，collagen I 和 collagen III 表達(dá)水平較DM組下調(diào)(P<0.05)，見圖3。

Figure 1.The morphological changes of the kidney tissues in each group after treatment with ALA for 6 weeks (HE staining).

圖1HE染色觀察各組大鼠腎組織形態(tài)的變化

Figure 2.The morphological changes of the kidney tissues in each group after treatment with ALA for 6 weeks (Masson staining). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDM group.

圖2Masson染色觀察各組大鼠腎組織形態(tài)的變化

4 RT-qPCR結(jié)果

與NC對(duì)照組相比，DM組大鼠腎組織的miR-21表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)；ALA干預(yù)后，miR-21的表達(dá)較DM組顯著減少(P<0.05)，見圖4。

討 論

DN病是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，已經(jīng)成為終末期腎病的首要病因，其主要病理改變特點(diǎn)為腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，可以表現(xiàn)為TGF-β1/Smads信號(hào)通路活化和ECM過度沉積[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腎組織中TGF-β1/Smads信號(hào)通路的活化水平與NC組比明顯增加，并且伴隨著膠原蛋白的大量沉積，腎臟纖維化明顯。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是造成糖尿病及其并發(fā)癥的重要原因之一[8]。ALA作為一種抗氧化劑，可與其他抗氧化劑共同作用，對(duì)腎臟起到保護(hù)作用，作者主要探討了ALA降低腎臟的氧化應(yīng)激水平從而達(dá)到保護(hù)腎臟的保護(hù)作用[9]，但其深入的機(jī)制并不明確。本研究將著重從分子機(jī)制層面探討ALA對(duì)腎臟的保護(hù)作用。

Figure 3.The protein levels of TGF-β1, Smad2/3, p-Smad2/3, Smad7, collagen III and collagen I in the kidney tissues of each group determined by Western blot. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDM group.

圖3Westernblot顯示各組大鼠腎組織中TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad7、collagenIII和collagenI蛋白表達(dá)水平的變化

Figure 4.The expression level of miR-21 in the kidney tissues of each group. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDM group.

圖4RT-qPCR結(jié)果顯示各組大鼠腎組織中miR-21的表達(dá)水平

本研究結(jié)果顯示，ALA組血糖沒有明顯變化，但病理學(xué)及生物化學(xué)檢查顯示纖維化病變程度顯著減輕，且TGF-β1/Smads信號(hào)通路的活化水平降低，ECM沉積減少，表明ALA可以減少DM大鼠腎臟TGF-β1/Smads信號(hào)通路活化和ECM沉積，對(duì)DN有一定的抑制作用。TGF-β1/Smads信號(hào)通路參與了腎臟纖維化病變的發(fā)生發(fā)展過程中，可以調(diào)節(jié)多種因子的表達(dá)，其中包括 miRNAs[10-12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在并發(fā) DN 的大鼠腎組織中，miR-21 表達(dá)顯著上調(diào)[13]。Smad7 蛋白作為抑制性Smad，一方面可以對(duì)抗TGF-β1信號(hào)通路的效應(yīng)[4]，另一方面Smad7又可以被TGF-β1信號(hào)通路所調(diào)控[5]。He等[5]在心肌纖維化疾病中發(fā)現(xiàn)，給予TGF-β1刺激之后，miR-21表達(dá)增多而Smad7表達(dá)減少，并進(jìn)一步驗(yàn)證出Smad7是miR-21的一個(gè)靶基因，且TGF-β1可以通過上調(diào)miR-21的表達(dá)而下調(diào)Smad7的蛋白表達(dá)，導(dǎo)致TGF-β1/Smads通路過度活化，從而促進(jìn)纖維化的發(fā)生發(fā)展。本研究中發(fā)現(xiàn)，與NC對(duì)照組相比，DM大鼠腎組織miR-21水平顯著上調(diào)，而Smad7蛋白表達(dá)減少，纖維化病變明顯；用ALA干預(yù)6周后，與DM組相比，miR-21表達(dá)下調(diào)，而Smad7隨著miR-21表達(dá)的減少反而表達(dá)增多，纖維化病變減輕。表明在DN中，miR-21的增多和Smad7的減少促進(jìn)了TGF-β1/Smads通路介導(dǎo)的膠原合成，加重纖維化病變程度；而ALA干預(yù)后，可以通過減少miR-21，恢復(fù)Smad7的蛋白表達(dá)，減少膠原的沉積，從而發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用。

綜上所述，ALA對(duì)DN的保護(hù)作用，可能是通過抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路的活化水平和miR-21的表達(dá)而上調(diào)Smad7蛋白表達(dá)，從而延緩腎臟纖維化的進(jìn)程，最終對(duì)腎臟起到保護(hù)作用。