黃芪多糖對(duì)頸椎病模型大鼠頸椎間盤(pán)纖維環(huán)MMP2和MMP9表達(dá)的影響*

楊 彬， 黃俊卿， 張繼偉

(河南省中醫(yī)院骨病二科，河南 鄭州 450000)

椎間盤(pán)退變性疾病是骨科常見(jiàn)疾病，包括頸椎病和腰椎間盤(pán)突出癥等，其發(fā)生和進(jìn)展是一個(gè)多因素的復(fù)雜過(guò)程，目前對(duì)疾病發(fā)病機(jī)理和特異性治療藥物的研究仍十分缺乏。在椎間盤(pán)退變過(guò)程伴隨幾個(gè)連續(xù)事件，包括細(xì)胞凋亡的增加、細(xì)胞外基質(zhì)降解和生物力學(xué)的改變[1]，其中，椎間盤(pán)組織中細(xì)胞外基質(zhì)成分降解是椎間盤(pán)退變的主要表現(xiàn)，在椎間盤(pán)基質(zhì)降解中發(fā)揮主要作用的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在椎間盤(pán)退變疾病中起重要作用[2]。已有研究證實(shí)，椎間盤(pán)中MMPs表達(dá)異常是椎間盤(pán)退變的重要原因之一[3]。因此，針對(duì)MMPs與椎間盤(pán)退變性疾病的相關(guān)性研究成為頸椎病和腰椎間盤(pán)突出預(yù)防及干預(yù)治療的熱點(diǎn)。黃芪多糖(astragalus polysaccharides，AP)是從中藥黃芪根中提取的大分子活性成分，在免疫調(diào)節(jié)中的作用得到廣泛研究。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能通過(guò)調(diào)節(jié)MMPs水平在關(guān)節(jié)炎、肺疾病和神經(jīng)損傷等多種類(lèi)型的疾病中起作用。為探究黃芪多糖對(duì)椎間盤(pán)退變性疾病的作用，本研究通過(guò)建立頸椎病大鼠模型，研究黃芪多糖對(duì)頸椎間盤(pán)纖維環(huán)組織中MMP2和MMP9的影響，以期為椎間盤(pán)退變性疾病的干預(yù)治療提供新的治療方案。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)成年雄性SD大鼠40只，購(gòu)自北京生命科學(xué)研究所，許可證號(hào)為SYXK(京)2015-0002，體重280～320 g，8～10周齡。

2 藥品和試劑

黃芪多糖標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號(hào)：76296-72-5，純度99.9%)購(gòu)自青島捷世康生物科技有限公司?？俁NA提取試劑盒(批號(hào)PA115-03)購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；IP細(xì)胞裂解液(貨號(hào)P0013)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所； PCR引物購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；水合氯醛(貨號(hào)47335)及抗MMP2(貨號(hào)SAB2108458)、MMP9(貨號(hào)HPA001238)、金屬蛋白酶組織抑制物2(tissue inhibitor of metalloproteinase 2， TIMP2)(貨號(hào)SAB4502972)和Ⅳ型膠原(collagen Ⅳ，貨號(hào)C7999)抗體購(gòu)自Sigma-Aldrich；蛋白預(yù)染Marker(批號(hào)SM1811)購(gòu)自Fermentas；胎牛血清(批號(hào)1502284)購(gòu)自Gibco。

3 實(shí)驗(yàn)儀器

VD-650型超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備廠；HeracellTMVIOS型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo；BX51型光學(xué)顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus；Finesse 325型石蠟切片機(jī)購(gòu)自Shando；7500型Real-time PCR檢測(cè)儀購(gòu)自ABI；1658001型電泳儀購(gòu)自Bio-Rad。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1動(dòng)物造模 隨機(jī)選取14只SD大鼠作為假手術(shù)組，其余26只SD大鼠，參考黃萍萍等[4]的方法建立動(dòng)靜力失衡性頸椎間盤(pán)退變大鼠模型。大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，于大鼠頸背部正中縱向切口2 cm，暴露頸部肌肉層后，切斷淺肌群、深群頸夾肌、頭頸寰最長(zhǎng)肌，切除頸髂肋肌、頭半棘肌、C2-C7棘上和棘間韌帶后，逐層縫合。術(shù)后正常飼養(yǎng)3個(gè)月。假手術(shù)組僅切開(kāi)皮膚和皮下組織。

4.2模型評(píng)價(jià) 造模1個(gè)月后，隨機(jī)選取假手術(shù)組和模型組大鼠各4只進(jìn)行放射影像學(xué)鑒定造模成功與否。

4.3動(dòng)物分組及藥物干預(yù) 造模1個(gè)月后，取18只造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型(model， M)組、低劑量黃芪多糖處理(low-dose AP， L-AP)組和高劑量黃芪多糖處理(high-dose AP, H-AP)組，每組6只；另取假手術(shù)組大鼠6只作為陰性對(duì)照(negative control， NC)組。低劑量和高劑量黃芪多糖處理組分別給予腹腔注射黃芪多糖10 mg/kg和30 mg/kg[5]，每天1次，連續(xù)給藥14 d；M組和NC組腹腔注射生理鹽水。

4.4標(biāo)本采集及處理 在給藥結(jié)束后，腹腔注射過(guò)量水合氯醛處死后，沿頸椎上、下軟骨終板與椎體交界面完整取下C4～C5頸椎間盤(pán)組織，一部分纖維環(huán)組織置于-80 ℃保存，用于Western blot檢測(cè)；另一部分纖維環(huán)組織經(jīng)PBS洗滌后，于4%多聚甲醛中固定、脫鈣、脫水、透明、浸蠟及包埋，行組織學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)分析。

4.5組織學(xué)觀察 椎間盤(pán)組織于4%多聚甲醛固定、脫鈣、脫水、透明、浸蠟及包埋后，用切片機(jī)(Microm International GmbH)連續(xù)切片(6 μm)，用HE染色和藏紅(Safranin) O染色后，于顯微鏡下觀察組織學(xué)變化，并進(jìn)行定性分析。

4.6免疫組織化學(xué)檢測(cè) 將纖維環(huán)組織蠟塊(4 μm)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水合后，于0.01 mol/L檸檬酸鈉(pH 6.0)中孵育20 min，3%過(guò)氧化氫中孵育10 min，10%正常山羊血清中孵育30 min,將切片與NLRP3的 I 抗于4 ℃孵育過(guò)夜,以PBS孵育的切片作為陰性對(duì)照。于室溫下，將切片與堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG孵育1 h。PBS洗滌3后，加入100 μL DAB溶液，于顯微鏡下觀察。自來(lái)水沖洗后，蘇木精復(fù)染，氨水反藍(lán)后用自來(lái)水沖洗。切片于乙醇中脫水并于二甲苯中透明。蛋白表達(dá)定位于纖維環(huán)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，染色后陽(yáng)性表達(dá)呈深棕色或棕黃色顆粒。

4.7纖維環(huán)細(xì)胞原代培養(yǎng)及處理 分別在各組隨機(jī)抽取大鼠2只，脊椎脫臼處死后，于無(wú)菌條件下取出椎間盤(pán)，于顯微鏡下剝除凝膠狀髓核組織，取得纖維環(huán)組織后，置于含PBS的培養(yǎng)皿中剪碎為1 mm×1 mm×1 mm的組織塊后，加入5 mL 0.2%膠原酶消化1 h后，1 400 r/min離心5 min后棄上清。加入2 mL 0.2%胰蛋白酶消化5 min后，再次離心棄上清。PBS洗滌后，棄PBS,收集原代細(xì)胞，接種至含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液的96孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。于倒置顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)情況。

4.8細(xì)胞-膠原黏附實(shí)驗(yàn) 培養(yǎng)24 h后，取貼壁細(xì)胞，用0.2%胰蛋白酶消化后，以1×104個(gè)接種至經(jīng)膠原蛋白包被的36孔板中，每組6孔，37 ℃孵育1 h。PBS洗滌后，黏附細(xì)胞用0.5%甲苯胺藍(lán)染色后，于4%多聚甲醛中固定15 min，加入1%十二烷基磺酸鈉中溶解。于590 nm波長(zhǎng)下讀取吸光度(A)值。

4.9RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 使用Ultrapure RNA試劑盒從組織及細(xì)胞中提取總RNA，并使用HiFi-MMLV cDNA試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA,用SYBR Green試劑盒和Applied Biosystems 7500快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。以β-actin作為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)水平。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列

4.10Western blot實(shí)驗(yàn) 使用PMSF裂解組織和細(xì)胞，根據(jù)蛋白質(zhì)提取試劑盒制造商說(shuō)明書(shū)提取總蛋白。使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白質(zhì)行12%SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將I抗[MMP2、MMP9、TIMP2、collagen Ⅳ(1∶500)和內(nèi)參照β-actin(1∶200)]與膜一起于4 ℃孵育過(guò)夜。將膜用HRP綴合的 II 抗于室溫下孵育1 h。使用Quantity One軟件評(píng)估相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用F檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 椎間盤(pán)退變模型大鼠放射影像學(xué)的鑒定

假手術(shù)組大鼠X線(xiàn)片正常，未見(jiàn)椎間隙狹窄、骨質(zhì)增生和頸椎曲度變直等頸椎退變等情況，見(jiàn)圖1A、B；模型組大鼠X線(xiàn)片可見(jiàn)椎間隙狹窄、曲度變直，椎體邊緣觀察到骨贅形成，關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)出現(xiàn)增生硬化等頸椎退變，見(jiàn)圖1C、D。

2 椎間盤(pán)退變模型大鼠組織學(xué)檢查

2.1HE染色結(jié)果 NC組大鼠頸椎椎間盤(pán)高度正常，纖維環(huán)表現(xiàn)為正常纖維軟骨層組織，軟骨細(xì)胞排列整齊，分布較多，細(xì)胞呈橢圓形;M組大鼠椎間盤(pán)高度明顯下降，出現(xiàn)椎間盤(pán)退變，髓核塌陷，纖維環(huán)纖維軟骨層組織減少，纖維環(huán)組織發(fā)生破裂、膠原纖維呈波浪排列;L-AP和H-AP組大鼠髓核和纖維環(huán)組織間界限逐漸清晰，纖維環(huán)組織中纖維排列顯示出較少破裂和紊亂，椎間盤(pán)退行性變化有所減輕,見(jiàn)圖2。

Figure 1.Radiographic changes in rats with disc degeneration. A: spine front view in NC group; B: spine side view in NC group; C: spine front view in M group; D: spine side view in M group.

圖1椎間盤(pán)退變模型大鼠放射影像學(xué)變化

Figure 2.The histological observation of rat cervial intervertebral discs by HE staining.

圖2各組大鼠頸椎間盤(pán)HE染色結(jié)果

2.2Safranin O染色結(jié)果 對(duì)照組軟骨終板(cartilaginous endplate, CEP)經(jīng)Safranin O染色后呈紅色，提示CEP主要由細(xì)胞外基質(zhì)組成;M組椎間盤(pán)中紅色區(qū)域明顯減少，提示蛋白多糖含量減少，細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生降解; L-AP組和H-AP組紅色區(qū)域逐漸增加，細(xì)胞外基質(zhì)降解改善,見(jiàn)圖3。

Figure 3.The histological observation of rat cervical intervertebral discs by Safranin O staining.

圖3大鼠頸椎間盤(pán)藏紅O染色結(jié)果

3 纖維環(huán)組織中MMP2、MMP9、TIMP2和collagen Ⅳ蛋白的免疫組織化學(xué)觀察

各組大鼠頸椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞中MMP2、MMP9、TIMP2和collagen Ⅳ蛋白的陽(yáng)性表達(dá)主要定位于胞漿內(nèi)，呈深棕色為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，淺棕黃色為弱陽(yáng)性表達(dá)，無(wú)著色為陰性表達(dá)。NC組中，MMP2和MMP9陽(yáng)性細(xì)胞少，散在分布，為弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)；M組中MMP2和MMP9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加，分布密集，著色深，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；L-AP組和H-AP組MMP2和MMP9陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)逐漸減少。NC組和M組中TIMP2呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，L-AP組和H-AP組TIMP2陽(yáng)性表達(dá)數(shù)逐漸增加，分布密集，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。NC組collagen Ⅳ呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，分布密集，M組collagen Ⅳ陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)顯著降低，散在分布，呈弱陽(yáng)性表達(dá)，而L-AP組和H-AP組TIMP2陽(yáng)性表達(dá)數(shù)逐漸增加，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖4。

4 Western blot檢測(cè)纖維環(huán)組織中MMP2、MMP9、TIMP2和collagen Ⅳ蛋白的表達(dá)

與NC組相比，M組大鼠纖維環(huán)組織中MMP2和MMP9蛋白表達(dá)水平顯著增加，而TIMP2和collagenⅣ蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；與M組相比，L-AP組和H-AP組MMP2和MMP9蛋白表達(dá)水平顯著降低，而TIMP2和collagen Ⅳ蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)圖5、表2。

Figure 4.The protein expression of MMP2, MMP9, TIMP2 and collagen Ⅳ in fibrous ring tissues detected by immunohistochemistry (×400).

圖4免疫組化染色檢測(cè)各組大鼠纖維環(huán)組織中MMP2、MMP9、TIMP2和collagenⅣ蛋白表達(dá)

Figure 5.The protein expression of MMP2, MMP9, TIMP2 and collagen Ⅳ in fibrous ring tissues detected by Western blot.

圖5Westernblot法檢測(cè)纖維環(huán)組織MMP2、MMP9、TIMP2和collagenⅣ的蛋白表達(dá)

表2MMP2、MMP9、TIMP2和collagenⅣ蛋白相對(duì)表達(dá)水平的變化

Table 2.Changes of relative expression levels of MMP2, MMP9, TIMP2 and collagen IV proteins in fibrous ring tissues of rats (Mean±SD.n=6)

GroupMMP2MMP9TIMP2Collagen ⅣNC 1.001.001.001.00M3.56±0.09*3.63±0.11*0.34±0.03*0.09±0.01*L-AP2.31±0.05*#2.84±0.08*#0.56±0.05*#0.52±0.06*#H-AP1.06±0.04*#△1.57±0.06*#△0.86±0.04*#△0.88±0.04*#△

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsM group;△P<0.05vsL-AP group.

5 纖維環(huán)組織中MMP2、MMP9、TIMP2和collagen Ⅳ的mRNA表達(dá)水平

與NC組相比，M組大鼠纖維環(huán)組織中MMP2和MMP9的mRNA表達(dá)水平顯著增加，而TIMP2和collagen Ⅳ的mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；與M組相比，L-AP組和H-AP組MMP2和MMP9的mRNA表達(dá)水平顯著降低，而TIMP2和collagen Ⅳ的mRNA表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3各組大鼠纖維環(huán)組織中MMP2、MMP9、TIMP2、collagenⅣmRNA相對(duì)表達(dá)水平

Table 3.Changes of relative expression levels of MMP2, MMP9, TIMP2 and collagen IV mRNA in fibrous ring tissues of rats (Mean±SD.n=6)

GroupMMP2/β-actinMMP9/β-actinTIMP2/β-actinCollagen Ⅳ/β-actinNC0.94±0.031.06±0.041.24±0.061.31±0.08M2.06±0.04*2.21±0.05*0.51±0.03*0.62±0.05*L-AP1.26±0.04*#1.34±0.03*#0.82±0.04*#0.92±0.04*#H-AP1.03±0.03*#△1.15±0.03*#△1.13±0.05*#△1.16±0.06*#△

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsM group;△P<0.05vsL-AP group.

6 黃芪多糖對(duì)大鼠纖維環(huán)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

倒置顯微鏡下觀察，NC組大鼠原代纖維環(huán)細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞貼壁，呈紡錘體或星形細(xì)胞生長(zhǎng); M組大鼠的原代纖維環(huán)細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，并形成空泡;而L-AP組和H-AP組細(xì)胞皺縮、空泡形成等征象均有所改善,見(jiàn)圖6。

Figure 6.Effect of astragalus polysaccharides on the growth of rat annulus fibrosus (×100).

圖6黃芪多糖對(duì)大鼠纖維環(huán)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

7 黃芪多糖對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞-膠原黏附的影響

M組A值顯著低于NC組(P<0.05);與M組相比，L-AP組和H-AP組A值均顯著上升(P<0.05),見(jiàn)圖7。

8 纖維環(huán)細(xì)胞中MMP2、MMP9、TIMP2和collagen Ⅳ的mRNA表達(dá)水平

與NC組相比，M組纖維環(huán)細(xì)胞中MMP2、MMP9的mRNA表達(dá)水平顯著增加，而TIMP2和collagen Ⅳ的mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05);與M組相比，L-AP組和H-AP組MMP2和MMP9的mRNA表達(dá)水平顯著降低，而TIMP2和collagen Ⅳ的mRNA表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)表4。

Figure 7.The results of cell-collagen adhesion test. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsM group;△P<0.05vsL-AP group.

圖7細(xì)胞-膠原黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4纖維環(huán)細(xì)胞中MMP2、MMP9、TIMP2和collagenⅣmRNA相對(duì)表達(dá)水平

Table 4.The relative expression of MMP2, MMP9, TIMP2 and collagen IV mRNA in rat annulus fibrosus cells (Mean±SD.n=3)

GroupMMP2/β-actinMMP9/β-actinTIMP2/β-actinCollagen Ⅳ/β-actinNC1.01±0.021.12±0.061.34±0.081.26±0.05M2.13±0.09*2.34±0.10*0.42±0.04*0.30±0.04* L-AP1.46±0.08*#1.63±0.09*#0.78±0.05*#0.81±0.06*# H-AP1.13±0.05*#△1.30±0.05*#△1.04±0.09*#△1.09±0.07*#△

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsM group;△P<0.05vsL-AP group.

9 纖維環(huán)細(xì)胞中MMP2、MMP9、TIMP2和collagen Ⅳ的蛋白表達(dá)水平

與NC組相比，M組纖維環(huán)細(xì)胞中MMP2和MMP9蛋白表達(dá)水平顯著增加，而TIMP2和collagen Ⅳ表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；與M組相比，L-AP組和H-AP組MMP2和MMP9的蛋白表達(dá)水平顯著降低，而TIMP2和collagen Ⅳ的蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05),見(jiàn)圖8、表5。

討 論

椎間盤(pán)退變是頸椎病、腰椎間盤(pán)突出和腰背部疼痛的重要原因之一。臨床上治療頸椎病的金標(biāo)準(zhǔn)是實(shí)行頸椎間盤(pán)切除移植骨融合術(shù)，然而因其存在嚴(yán)重并發(fā)癥等問(wèn)題令頸椎病患者不愿接受手術(shù)。藥物治療在一定程度上安全性較高，但在尋找有效治療藥物時(shí)，透徹分析疾病發(fā)生及藥物作用機(jī)制非常重要，因此需要建立椎間盤(pán)退變的動(dòng)物模型。本研究采用黃萍萍等[4]的方法，采用頸椎動(dòng)靜力失衡法建立的大鼠模型，是通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)所建立，與人類(lèi)長(zhǎng)期低頭工作所致頸椎間盤(pán)病變相似度很高，另外大鼠價(jià)格較低，制備周期短，因此是一種很好的動(dòng)物模型。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組纖可見(jiàn)椎間隙狹窄、曲度變直，椎體邊緣觀察到骨贅形成，關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)出現(xiàn)增生硬化等頸椎退變等情況，證實(shí)模型制備成功。

Figure 8.The protein expression of MMP2, MMP9, TIMP2, collagen Ⅳ in the annulus fibrosis cells deteced by Western blot.

圖8Westernblot法檢測(cè)纖維環(huán)細(xì)胞MMP2、MMP9、TIMP2和collagenⅣ蛋白表達(dá)

表5纖維環(huán)細(xì)胞中MMP2、MMP9、TIMP2和collagenⅣ蛋白表達(dá)水平

Table 5.The relative expression of MMP2, MMP9, TIMP2 and collagen IV protein in rat annulus fibrosus cells (Mean±SD.n=3)

GroupMMP2MMP9TIMP2Collagen ⅣNC1.001.001.001.00 M3.82±0.12*3.57±0.09*0.13±0.01*0.20±0.02* L-AP2.19±0.08*#2.07±0.06*#0.61±0.04*#0.59±0.03*# H-AP1.13±0.04*#△1.09±0.06*#△1.03±0.06#△1.02±0.05#△

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsM group;△P<0.05vsL-AP group.

椎間盤(pán)退變的特征在于生物化學(xué)成分和機(jī)械完整性發(fā)生變化，椎間盤(pán)的主要成分是細(xì)胞外基質(zhì)，其中富含膠原和蛋白多糖，是維持脊柱生理、機(jī)械穩(wěn)定和運(yùn)動(dòng)性的基礎(chǔ)[6]。細(xì)胞外基質(zhì)中糖胺聚糖含量降低、細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解平衡失調(diào)、變性膠原蛋白含量的增加均會(huì)引起椎間盤(pán)退變[7]?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)是MMPs特異性的內(nèi)源性抑制因子，二者共同調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡，在椎間盤(pán)退變過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明，椎間盤(pán)細(xì)胞內(nèi)MMPs表達(dá)的增加是椎間盤(pán)退變的誘因之一[8]。在老化和退化的椎間盤(pán)中，MMPs表達(dá)異常使細(xì)胞外基質(zhì)成分，如纖維膠原蛋白、明膠、蛋白聚糖、纖邊蛋白和層黏連蛋白等降解[9]。 過(guò)往研究發(fā)現(xiàn)，在病變椎間盤(pán)的纖維環(huán)細(xì)胞中MMP2表達(dá)水平升高[10-11]，與此一致，本研究中模型大鼠頸椎間盤(pán)纖維環(huán)組織中MMP2和MMP9表達(dá)顯著增加。另外，本研究中發(fā)現(xiàn)，頸椎病大鼠纖維環(huán)組織中TIMP2表達(dá)水平無(wú)明顯變化，而collagen Ⅳ表達(dá)水平顯著降低。薛恩興等[12]發(fā)現(xiàn)，正常椎間盤(pán)髓核細(xì)胞中MMP1和MMP13表達(dá)較低，而在椎間盤(pán)退變過(guò)程中MMP2表達(dá)增加，導(dǎo)致MMPs-TIMPs平衡被破壞。Zhang等[13]發(fā)現(xiàn)，在退變椎間盤(pán)髓核組織中MMP2高表達(dá)，且其表達(dá)情況與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，提示MMP2參與椎間盤(pán)退變過(guò)程。另外，collagen Ⅳ是MMP2和MMP9主要水解底物之一[14]。因此推測(cè)，頸椎病大鼠頸椎間盤(pán)纖維環(huán)組織中MMP2和MMP9表達(dá)水平增加,TIMP2表達(dá)水平降低，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解平衡失調(diào)及功能改變，引起細(xì)胞外基質(zhì)中膠原和蛋白聚糖降解，從而破壞纖維環(huán)結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致椎間盤(pán)退變。

黃芪多糖是中藥黃芪的主要有效成分，對(duì)機(jī)體免疫功能有廣泛的調(diào)節(jié)作用，且具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖和降血脂等多種功能[15-17]。近來(lái)研究表明，黃芪多糖可通過(guò)抑制肺組織中MMPs及其調(diào)節(jié)因子TIMPs的水平，來(lái)調(diào)控肺組織中細(xì)胞外基質(zhì)合成代謝和降解代謝的平衡，從而改善呼吸道重構(gòu)和肺纖維化程度[18-19]。張正軍等[19]發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能夠抑制糖尿病患者足部潰瘍成纖細(xì)胞內(nèi)IL-1β引起的MMP2和MMP9活性的顯著增加。在大鼠骨關(guān)節(jié)炎中，黃芪多糖可通過(guò)抑制關(guān)節(jié)軟骨中MMP3的表達(dá)，調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白多糖的降解，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨中GAG的合成[20]。這些研究表明，黃芪多糖可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)中MMPs的活性在多種疾病中起積極作用。然而在椎間盤(pán)退變中黃芪多糖的作用及對(duì)MMPs影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能夠改善椎間盤(pán)纖維環(huán)組織細(xì)胞外基質(zhì)降解，從而改善椎間盤(pán)退變情況。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)黃芪多糖以劑量依賴(lài)性的方式降低頸椎病大鼠纖維環(huán)組織內(nèi)MMP2和MMP9表達(dá)水平，且增加TIMP2表達(dá)水平。另外，隨著黃芪多糖劑量的增加，組織中collagen Ⅳ的含量逐漸增加。結(jié)合過(guò)往研究推測(cè)，在頸椎病大鼠中，黃芪多糖通過(guò)增加TIMPs表達(dá)來(lái)抑制MMPs表達(dá)水平的增加，使細(xì)胞外基質(zhì)中MMPs與TIMPs表達(dá)維持動(dòng)態(tài)平衡，從而抑制MMPs對(duì)椎間盤(pán)基質(zhì)中膠原和蛋白多糖的降解。

本研究進(jìn)一步從細(xì)胞水平上評(píng)估黃芪多糖對(duì)頸椎病模型大鼠纖維環(huán)細(xì)胞的影響。倒置顯微鏡下觀察到頸椎病模型大鼠纖維環(huán)細(xì)胞呈現(xiàn)皺縮、空泡現(xiàn)象，而黃芪多糖處理能夠改善這一現(xiàn)象。另外，椎間盤(pán)模型大鼠纖維環(huán)細(xì)胞-膠原黏附能力明顯下降，而黃芪多糖能夠改善細(xì)胞-膠原黏附能力，且隨著黃芪多糖濃度的增加，細(xì)胞-膠原黏附能力逐漸增加。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖處理能夠使頸椎病模型大鼠纖維環(huán)細(xì)胞內(nèi)MMP2和MMP9表達(dá)水平上升，同時(shí)使TIMP2和collagen Ⅳ表達(dá)水平降低。進(jìn)一步證實(shí)，黃芪多糖可以通過(guò)調(diào)節(jié)纖維環(huán)細(xì)胞內(nèi)MMPs與TIMPs的表達(dá)，參與基質(zhì)重塑過(guò)程，從而避免細(xì)胞外基質(zhì)破壞，改善纖維環(huán)細(xì)胞與膠原的結(jié)合能力。

然而，在椎間盤(pán)退變過(guò)程中涉及到多種MMPs的共同作用，黃芪多糖在調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成、降解平衡中具體機(jī)制還有待深入探究；其次，本研究選擇大鼠原代纖維環(huán)細(xì)胞，且細(xì)胞為單層融合，可能影響結(jié)果，且不能完全代表人纖維環(huán)細(xì)胞。另外，由于經(jīng)費(fèi)、技術(shù)等限制，本研究?jī)H涉及黃芪多糖對(duì)MMP、TIMP2和collagen Ⅳ在大鼠纖維環(huán)細(xì)胞中表達(dá)的影響，未對(duì)機(jī)制進(jìn)行經(jīng)深入研究，因此將在后續(xù)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，黃芪多糖能夠抑制頸椎病模型大鼠纖維環(huán)組織中MMP2和MMP9表達(dá)水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)中MMPs與TIMPs 動(dòng)態(tài)平衡，從而抑制MMPs對(duì)椎間盤(pán)基質(zhì)中相關(guān)膠原的降解，在椎間盤(pán)退變的治療中具有潛在研究?jī)r(jià)值。