干擾TGF-βⅡ型受體表達(dá)對(duì)NB4細(xì)胞增殖、分化及凋亡的影響*

陳美玲， 張淑遐， 郭雅斐， 陳瑩瑩， 吳 勇

(福建省血液病研究所， 福建省血液病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院， 福建 福州 350004)

轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是最強(qiáng)的血細(xì)胞增殖抑制因子，能夠有效抑制造血細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)造血細(xì)胞凋亡[1-3]，其與造血細(xì)胞表面相應(yīng)的特異性受體結(jié)合，參與調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄過程而發(fā)揮生物學(xué)作用[4-6]。TGF-β受體主要有TβRI、TβRII和TβRIII 3三種亞型。已知三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)可誘導(dǎo)人急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)NB4細(xì)胞凋亡，但TβRII在全反式維甲酸(all-transretinoic acid，ATRA)誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞分化及ATO誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞凋亡中的作用不甚清楚。本文以急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系NB4為研究對(duì)象，采用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)，下調(diào)NB4細(xì)胞內(nèi)源性TβRII水平，研究干擾TβRII表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長、分化及凋亡的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

NB4細(xì)胞由福建省血液病研究所保存。ATRA和ATO(Sigma)；TGF-β1 (PeproTech)；DMSO(上海生物試劑廠)；胎牛血清( 灝洋天津生物公司)；DMEM、Opti-MEM和RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO)；Lipofectamine 2000、TRIzol試劑和PCR引物(Invitrogen)；qPCR試劑盒(Roche)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)；Western blot抗體(eBioscience)；蛋白提取液(PIERCE)；CCK-8試劑盒(同仁化學(xué)研究所)；流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測(cè)試劑盒(凱基生物公司)；Western blot定影/顯影粉(世紀(jì)奧博商貿(mào)公司)。

2 方法

2.1穩(wěn)定表達(dá)TβRII-shRNA NB4 細(xì)胞株的建立 構(gòu)建4種靶向TβRII序列(表1)的RNAi 慢病毒載體后，采用Western blot 法外源篩選有效RNAi 載體，選擇有效LV-TGFBR2-RNAi (9759-1)包裝慢病毒顆粒，由上海吉?jiǎng)P生物有限公司完成。采用慢病毒LV-TGFBR2-RNAi (9759-1)轉(zhuǎn)染NB4細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)TβRII-shRNA NB4 細(xì)胞株。RT-qPCR鑒定TβRII的mRNA 在TβRII-shRNA NB4細(xì)胞中的表達(dá)情況。TβRII的上游引物序列為5’-CACCGCACGTTCAGAAGTC-3’，下游引物序列為5’-CACAGATGGAGGTGATGCTG-3’；β-actin的上游引物序列為5’- AGTGTGACGTGGACATCCGCAA-3’，下游引物序列為5’-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3’。qPCR體系(20 μL)如下：2× Taq PCR Mix 10 μL，目的基因上、下游引物為 1 μL，去離子水8 μL，cDNA 1 μL。每組取3個(gè)平行孔。采用7500 Real-Time PCR System，擴(kuò)增的具體循環(huán)參數(shù)： 50 ℃ 2 min， 94 ℃ 10 min； 94 ℃ 15 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 40 s， 共40個(gè)循環(huán)。同時(shí)擴(kuò)增β-actin作為內(nèi)參照。利用2-ΔΔCt分析數(shù)據(jù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Western blot鑒定TβRII蛋白在TβRII-shRNA NB4 細(xì)胞中的表達(dá)情況。

表1 TβRII-shRNA靶序列

2.2CCK-8法觀察TGF-β1對(duì)TβRII-shRNA NB4 細(xì)胞活力的變化 收集對(duì)數(shù)生長期的TβRII-shRNA NB4細(xì)胞，以親代NB4細(xì)胞作為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入不同終濃度(0、1、2、4、8和10 μg/L)的TGF-β1, 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，將細(xì)胞密度調(diào)整為4×107/L，隨后將其種于96孔板，將每孔的總體積定為200 μL，每組設(shè)復(fù)孔3個(gè)。放置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng) 24、48、72和96 h，隨后每孔加CCK-8溶液20 μL，37 ℃孵育120 min，在酶標(biāo)儀上振蕩10 min，以空白組為零點(diǎn)進(jìn)行校正測(cè)得每孔的吸光度(A)值(波長490 nm/630 nm)，并將其與時(shí)間分別作為縱、橫坐標(biāo)繪制生長曲線，再計(jì)算TGF-β1對(duì)各組細(xì)胞的IC50。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD11b表達(dá)水平觀察ATRA對(duì)TβRII-shRNA NB4細(xì)胞分化的影響 在TβRII-shRNA NB4細(xì)胞和親代NB4細(xì)胞培養(yǎng)體系中分別加入不同終濃度(0、0.01、0.02、0.04、0.08和0.1 μmol/L)的ATRA，對(duì)照組于上述2種細(xì)胞加入等體積的DMSO。收集對(duì)數(shù)生長期的2種細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×107/L，分別接種于6孔板，按需加入RPMI-1640稀釋的ATRA，使終體積為5 mL，培養(yǎng)96 h。收集上述各組細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后棄上清，PBS洗滌1遍，加200 μL PBS重懸細(xì)胞，加5 μL PE標(biāo)記的CD11b抗體，室溫下避光孵育20 min后，加1 mL PBS 1 000 r/min離心5 min后吸棄上清，加200 μL PBS重懸，上流式細(xì)胞儀(B&D)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4瑞氏-吉姆薩染色法檢測(cè)ATRA對(duì)TβRII-shRNA NB4細(xì)胞分化的影響 以加入DMSO的NB4細(xì)胞和TβRII-shRNA NB4細(xì)胞為對(duì)照組，加入終濃度為0.02 μmol/L ATRA的上述細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組。收集對(duì)數(shù)生長期的2種細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×107/L，分別接種于96孔板中，加入RPMI-1640稀釋的ATRA，使終體積為200 μL。培養(yǎng)96 h后取細(xì)胞進(jìn)行涂片，待載玻片干后，滴加瑞氏-吉姆薩染液覆蓋細(xì)胞30 s，滴加等量蒸餾水，混勻1 min，水沖洗數(shù)秒，待玻片干后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.5RT-qPCR 檢測(cè)ATO 誘導(dǎo)NB4 細(xì)胞凋亡對(duì)TβRII mRNA表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)組為加入不同濃度(2、4和8 μmol/L)ATO的TβRII-shRNA NB4細(xì)胞和親代NB4細(xì)胞，對(duì)照組為加入等體積DMSO的上述2種細(xì)胞。收集活力好、處于對(duì)數(shù)生長期的上述細(xì)胞，用含10% 胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×108/L，隨后將其種于6孔板，依次加入稀釋好的ATO溶液，每孔總體積為5 mL。培養(yǎng)1 d后收集并離心獲得細(xì)胞沉淀，加入預(yù)冷PBS 1 mL，輕搖使細(xì)胞呈懸浮態(tài)，于4 ℃ 離心機(jī)，1 000 r/min離心5 min，吸棄上清后，重復(fù)洗滌1次，提取總RNA，RT-qPCR 檢測(cè)TβRII mRNA表達(dá)水平,方法同上。

2.6Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ATO對(duì)TβRII-shRNA NB4細(xì)胞凋亡的影響 實(shí)驗(yàn)組為加入不同濃度(2、4和8 μmol/L)ATO的TβRII-shRNA NB4細(xì)胞和親代NB4細(xì)胞，對(duì)照組為加入等體積DMSO的上述2種細(xì)胞。收集活力好、處于對(duì)數(shù)生長期的上述細(xì)胞，用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，將細(xì)胞密度調(diào)整為 5×108/L，隨后將其種于6孔板，依次加入稀釋好的ATO溶液，每孔總體積為5 mL。培養(yǎng)1 d后收集并離心獲得細(xì)胞沉淀，加入預(yù)冷PBS 1 mL，輕搖使細(xì)胞呈懸浮態(tài)，于4 ℃、1 000 r/min離心5 min，吸棄上清后，重復(fù)洗滌1次，再使細(xì)胞懸浮于100 μL結(jié)合緩沖液中，各加入5 μL PI及Annexin V-FITC混勻后避光條件下，室溫反應(yīng)15～20 min，加入400 μL結(jié)合緩沖液，于60 min內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.7AO/EB染色法檢測(cè)ATO對(duì)TβRII-shRNA NB4細(xì)胞凋亡的影響 實(shí)驗(yàn)組為加入8 μmol/L ATO的TβRII-shRNA NB4 細(xì)胞和親代NB4細(xì)胞，以加入DMSO的上述2種細(xì)胞為對(duì)照組。收集活力好，生長對(duì)數(shù)期的上述細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，將細(xì)胞密度調(diào)整為 5×108/L，隨后將其種于6孔板，加入稀釋好的ATO溶液，每孔總體積為5 mL。培養(yǎng)24 h后，收集上述各組細(xì)胞，PBS洗滌后使其再次懸浮于PBS中，細(xì)胞濃度同上，取AO/EB熒光染色混合液4 μL，加入100 μL細(xì)胞懸液中，吹打混勻滴到載玻片上，加上蓋玻片后，立刻觀察熒光成像并進(jìn)行拍照記錄。AO和EB均可以進(jìn)入細(xì)胞核，前者能通過胞膜完整的細(xì)胞嵌入胞核DNA，后者則只能通過受損細(xì)胞嵌入胞核DNA，二者熒光分別為綠色、橘紅色。鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞所占比例。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以GraphPad Prism 5.0作為分析軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TβRII-shRNA NB4細(xì)胞株TβRII的mRNA 和蛋白水平下降

RT-qPCR檢測(cè)顯示，TβRII-shRNA NB4細(xì)胞TβRII的mRNA表達(dá)水平較NB4細(xì)胞顯著降低(P<0.01)，見圖1A；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，TβRII-shRNA NB4細(xì)胞的TβRII蛋白水平顯著下降(P<0.01),見圖1B。

2 TGF-β1對(duì)TβRII-shRNA NB4細(xì)胞活力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1對(duì)NB4細(xì)胞及TβRII-shRNA NB4 細(xì)胞活力抑制作用呈時(shí)間及劑量依賴性，但對(duì)TβRII-shRNA NB4細(xì)胞的活力抑制作用弱于NB4細(xì)胞(P<0.05)，見圖2。

Figure 1.The expression of TβRII in NB4 cells and TβRII-shRNA NB4 cells. A: the relative mRNA expression of TβRII detected by RT-qPCR; B: the protein expression of TβRII detected by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNB4 group.

圖1TβRII在NB4細(xì)胞和TβRII-shRNANB4細(xì)胞中的表達(dá)

Figure 2.The viability of TβRII-shRNA NB4 cells and NB4 parental cells after TGF-β1 treatment was detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNB4 group.

圖2CCK-8法檢測(cè)TGF-β1處理后TβRII-shRNANB4細(xì)胞的活力

3 ATRA對(duì)TβRII-shRNA NB4細(xì)胞分化的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分化抗原CD11b的表達(dá)情況，結(jié)果顯示經(jīng)不同濃度的ATRA孵育96 h后，NB4細(xì)胞及TβRII-shRNA NB4細(xì)胞表面的CD11b抗原表達(dá)量隨著ATRA濃度的增加而增高，呈劑量依賴性；但TβRII-shRNA NB4細(xì)胞的CD11b表達(dá)量低于同樣濃度ATRA處理的NB4細(xì)胞(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The expression of CD11b on TβRII-shRNA NB4 cells and NB4 parental cells treated with ATRA for 96 h was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNB4 group;△P<0.05,△△P<0.01vs0 μmol/L.

圖3檢測(cè)CD11b水平評(píng)價(jià)ATRA對(duì)TβRII-shRNANB4細(xì)胞分化的影響

瑞氏-吉姆薩染色法檢測(cè)細(xì)胞分化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NB4細(xì)胞及TβRII-shRNA NB4細(xì)胞染色質(zhì)細(xì)致疏松，核仁明顯。0.02 μmol/L ATRA作用于NB4細(xì)胞及TβRII-shRNA NB4細(xì)胞96 h后，2組細(xì)胞的核仁消失，細(xì)胞核分葉，出現(xiàn)分化征象，但是TβRII-shRNA NB4細(xì)胞的分化程度低于同樣濃度ATRA處理的NB4細(xì)胞，見圖4。

4 TβRII-shRNA 阻止ATO誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡

RT-qPCR檢測(cè)顯示，NB4細(xì)胞經(jīng)ATO處理后TβRIImRNA的水平上調(diào)， 但TβRII-shRNA 干擾ATO引起NB4細(xì)胞TβRIImRNA的表達(dá)水平上調(diào)(P<0.01)，見圖5。

Figure 4.The morphological changes of TβRII-shRNA NB4 cells and NB4 parental cells treated with ATRA for 96 h were observed under optical microscope (Wright-Giemsa staining, ×1 000). A and C: NB4 and TβRII-sh-RNA NB4 control; B and D: NB4 and TβRII-shRNA NB4 cells treated with 0.02 μmol/L ATRA for 96 h.

圖4瑞氏-吉姆薩染色法檢測(cè)ATRA對(duì)TβRII-shRNANB4細(xì)胞分化的影響

Figure 5.The relative expression of TβRII mRNA in NB4 cells and TβRII-shRNA NB4 cells induced by ATO was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.△P<0.05,△△P<0.01vs0 μmol/L;*P<0.05,**P<0.01vsNB4 group.

圖5TβRII在ATO誘導(dǎo)的NB4和TβRII-shRNANB4細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平

雙熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)2 μmol/L的ATO處理24 h可誘導(dǎo)NB4細(xì)胞及TβRII-shRNA NB4細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且隨著ATO濃度的增加，凋亡率也隨之增高，但是TβRII-shRNA NB4細(xì)胞的凋亡率明顯低于NB4細(xì)胞(P<0.01)，見圖6。

Figure 6.The apoptosis of TβRII-shRNA NB4 cells and NB4 parental cells treated with ATO for 24 h was detected by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI double staining. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNB4 group;△△P<0.01vs0 μmol/L.

圖6AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TβRII-shRNA是否抑制ATO誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞凋亡

AO/EB染色法在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核呈現(xiàn)不同顏色及形態(tài)，其中可見綠色核染色質(zhì)及橘紅色核染色質(zhì)，分別呈現(xiàn)為結(jié)構(gòu)正常的活細(xì)胞和死亡細(xì)胞(非凋亡)；同時(shí)還可以見到圓柱狀及固縮狀的綠色核染色質(zhì)和橘紅色核染色質(zhì)，分別代表早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞或凋亡小體。計(jì)數(shù)結(jié)果顯示NB4細(xì)胞組及TβRII-shRNA NB4細(xì)胞組凋亡率分別是(61.50±2.29)%和(45.00±2.78)%(P<0.01)，見圖7。

Figure 7.The apoptosis of TβRII-shRNA NB4 cells and NB4 parental cells treated with 8 μmol/L ATO was detected by AO/EB staining. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNB4 group.

圖7AO/EB染色法檢測(cè)TβRII-shRNA是否抑制ATO誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞凋亡

討 論

在正常造血中，TGF-β的作用主要表現(xiàn)為抑制細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡。異常造血中，相應(yīng)抑制成分的非正常表達(dá)及其誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活的異常，相應(yīng)靶基因破壞及缺失、通路組分突變均會(huì)破壞TGF-β/Smads信號(hào)通路，使造血細(xì)胞出現(xiàn)分化、凋亡受阻及過度增殖。某些白血病的發(fā)生就與該通路密切相關(guān)，如PML-RARα和AML1/ETO可以明顯阻斷該通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促使該通路組成部分發(fā)生失活突變[7-10]。TGF-β結(jié)合TβRII是該信號(hào)通路的起點(diǎn)，TβR Ⅱ及其下游的Smad 信號(hào)分子突變或缺失在造血系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生中起著重要的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，急性髓性白血病細(xì)胞中的Smad4基因顯性負(fù)性突變，包括MH1位點(diǎn)的錯(cuò)義突變和MH2位點(diǎn)的移碼突變，都可以中斷該信號(hào)通路，使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻[11]。Imman等[12]指出EB病毒相關(guān)的B細(xì)胞淋巴瘤及伯基特淋巴瘤相應(yīng)細(xì)胞系中TβRII表達(dá)減少，能夠抵抗TGF-β的生長抑制作用。Rooke等[13]檢測(cè)了慢性粒細(xì)胞白血病患者不同時(shí)期TβRII水平，發(fā)現(xiàn)TβRII的表達(dá)在任何疾病期均明顯低于正常人。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)急性白血病細(xì)胞株HL60和K562細(xì)胞TβRII表達(dá)缺失，而NB4細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源性TβRII[14]，但TβRII對(duì)NB4細(xì)胞生物學(xué)行為的影響不甚清楚，本實(shí)驗(yàn)以NB4細(xì)胞為研究對(duì)象，采用RNAi技術(shù)，下調(diào)NB4細(xì)胞內(nèi)源性TβRII水平，進(jìn)一步研究TβRII在細(xì)胞增殖中的作用，發(fā)現(xiàn)TβRII-shRNA NB4細(xì)胞的活力高于NB4細(xì)胞，可見TβRII介導(dǎo)的TGF-β信號(hào)通路在NB4細(xì)胞生長中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。

NB4細(xì)胞是APL細(xì)胞株，其TGF-β/Smads 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的破壞情況比較特殊。PML-RARα既在細(xì)胞質(zhì)也在細(xì)胞核內(nèi)存在[10]。研究表明PML-RARα抑制TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑有2種：(1)通過直接阻斷cPML與Smad 2/3的相互作用，來抑制TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；(2)通過阻止nPML與Smad 3/4激活TGF-β目的基因的相互協(xié)作[4]。在APL細(xì)胞中PML-RARα呈過表達(dá)，TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞分化因此受阻，而ATRA治療后PML-RARα表達(dá)降低，細(xì)胞重新對(duì)TGF-β敏感，因此，PML-RARα的過表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)TGF-β信號(hào)的抵抗，阻斷TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Zhong等[15]發(fā)現(xiàn)ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化的過程中，TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3、Smad4和Smad7的mRNA表達(dá)有較顯著的恢復(fù)，提示ATRA介導(dǎo)NB4細(xì)胞分化與激活TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)TβRII-shRNA NB4細(xì)胞的分化程度低于NB4細(xì)胞，進(jìn)一步證實(shí)TβRII介導(dǎo)的TGF-β信號(hào)通路在NB4細(xì)胞分化過程中發(fā)揮調(diào)控作用。

Chowdhury等[16]研究證實(shí)，組蛋白脫乙酰酶抑制劑可以促進(jìn)TβRII表達(dá)，激活TGF-β1相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，阻斷細(xì)胞周期，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡。但是TβRII在ATO誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞凋亡中的作用不甚清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)ATO作用后，NB4細(xì)胞TβRII mRNA表達(dá)上調(diào)，但是TβRII-shRNA NB4細(xì)胞TβRII mRNA表達(dá)下調(diào)， TβRII-shRNA NB4細(xì)胞和親代NB4細(xì)胞均出現(xiàn)凋亡，但TβRII-shRNA NB4細(xì)胞的凋亡水平顯著低于NB4細(xì)胞，可見含有TβRII基因的NB4細(xì)胞對(duì)ATO促進(jìn)凋亡的作用更加敏感。

綜上所述，本研究表明下調(diào)TβRII可以促進(jìn)NB4細(xì)胞生長，部分拮抗ATRA誘導(dǎo)的細(xì)胞分化及ATO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。