雜交鱘外周血細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

任永麗，齊林星，楊志軍，王錦秀，聶竹蘭

(塔里木大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)

鱘Acipenser隸屬于硬骨魚(yú)綱、輻鰭魚(yú)亞綱、硬鱗總目、鱘形目，是世界上最古老的魚(yú)類(lèi)之一，也是目前中國(guó)重要的冷水性養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)。近年來(lái)，隨著人工養(yǎng)殖技術(shù)的提高，鱘養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)得到了較大的發(fā)展[1]。中國(guó)境內(nèi)水域遼闊，比較適合鱘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，現(xiàn)如今中國(guó)已知的鱘種群有8種，是鱘種數(shù)最多的國(guó)家之一[2]。鱘起源早，分布廣泛且生命周期較長(zhǎng)，具有重要的研究?jī)r(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。鱘全身沒(méi)有肌間刺，食用部分均為軟骨，營(yíng)養(yǎng)豐富；其卵可以制成魚(yú)子醬，被稱(chēng)為“軟黃金”[3-4]。雜交鱘(達(dá)氏鰉Husodauricus♀×施氏鱘Acipenserschrenckii♂)是中國(guó)重要的養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)。鱘在自然條件下性成熟遲，種群遭到破壞后恢復(fù)時(shí)間較長(zhǎng)，但雜交后的鱘繁殖能力高于親本[5]，具有明顯的雜交優(yōu)勢(shì)。

動(dòng)物血液中含有豐富的血細(xì)胞，在其自身生理、生化調(diào)節(jié)中起重要作用[6]。血液起源于中胚層的間充質(zhì)。在魚(yú)類(lèi)的血液中，血細(xì)胞的組成和高等哺乳動(dòng)物相似但又有所不同，均含有紅細(xì)胞、白細(xì)胞(包括有粒白細(xì)胞和無(wú)粒白細(xì)胞)，不同的是魚(yú)類(lèi)血液中不存在血小板，而是由血栓細(xì)胞替代。魚(yú)類(lèi)的血液學(xué)指標(biāo)受較多因素影響，主要包括養(yǎng)殖密度、個(gè)體發(fā)育和棲息環(huán)境等[7]。例如，張墨等[8]在研究大雜交鱘大規(guī)格魚(yú)種在不同放養(yǎng)密度條件下血液生理生化指標(biāo)的變化時(shí)，發(fā)現(xiàn)高密度下產(chǎn)生的擁擠脅迫會(huì)導(dǎo)致大雜交鱘魚(yú)種血液的生理指標(biāo)發(fā)生明顯變化。在達(dá)氏鱘血液指標(biāo)的測(cè)定中，將血細(xì)胞分為紅細(xì)胞系、粒細(xì)胞系、單核細(xì)胞系、淋巴細(xì)胞系和其他細(xì)胞；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，其外周血中也有少量未成熟的紅細(xì)胞[9]。魚(yú)類(lèi)的血液指標(biāo)還可以反映魚(yú)類(lèi)的繁殖狀況和疾病。匙吻鱘Polyodonspathula[10]與中華鱘Acipensersinensis[11]血液中紅細(xì)胞的數(shù)量少于其他魚(yú)類(lèi)，同時(shí)受外界環(huán)境的影響較大，這種現(xiàn)象的出現(xiàn)應(yīng)該是與二者的運(yùn)動(dòng)能力弱相關(guān)。

本研究中采用瑞氏染色法制作雜交鱘血細(xì)胞涂片，觀察血細(xì)胞的形態(tài)特征；并依據(jù)其形態(tài)特征對(duì)雜交鱘的血細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)，旨在豐富魚(yú)類(lèi)血液學(xué)研究?jī)?nèi)容，為魚(yú)類(lèi)的病理及免疫等方面的研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用雜交鱘由新疆伊河鱘業(yè)科技股份有限公司提供，選擇活潑健康的雜交鱘10尾，體質(zhì)量為(425±25)g。

1.2 方法

采血時(shí)，用經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為0.1% 的肝素鈉浸潤(rùn)過(guò)的2.5 mL一次性注射器，自魚(yú)尾柄側(cè)線(xiàn)鱗下方的尾靜脈處抽取靜脈血2 mL，整個(gè)過(guò)程不超過(guò)1 min。采用常規(guī)方法將新鮮血液即刻制成血涂片，每尾魚(yú)2～3張；經(jīng)Wright染液染色后，在油鏡下進(jìn)行血細(xì)胞的觀察與測(cè)量；使用明美數(shù)碼成像系統(tǒng)觀察拍照，并對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)計(jì)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Photoshop CS 8.01軟件對(duì)試驗(yàn)照片進(jìn)行后期處理，同比例縮放圖像與標(biāo)尺；試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，用Excel軟件與SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

雜交鱘的血細(xì)胞是由紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血栓細(xì)胞組成。紅細(xì)胞是血細(xì)胞中最常見(jiàn)的一種，白細(xì)胞含量較少，血栓細(xì)胞則是2個(gè)及以上聚集在一起。白細(xì)胞包括有粒白細(xì)胞和無(wú)粒白細(xì)胞。有粒白細(xì)胞可見(jiàn)嗜中性粒細(xì)胞與嗜酸性粒細(xì)胞。無(wú)粒白細(xì)胞可見(jiàn)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞。雜交鱘紅細(xì)胞的大小以及白細(xì)胞的分類(lèi)和大小分別見(jiàn)表1與表2。

表1 雜交鱘紅細(xì)胞的大小Tab.1 Sizes of erythrocytes in the hybrid sturgeon μm

表2 雜交鱘白細(xì)胞的分類(lèi)和大小Tab.2 Classification and sizes of leukocytes in the hybrid sturgeon μm

2.1 雜交鱘紅細(xì)胞形態(tài)

雜交鱘紅細(xì)胞為橢圓形，細(xì)胞核為圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央被染成深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)則被染成淺藍(lán)色(圖1-A實(shí)線(xiàn)箭頭)。紅細(xì)胞在雜交鱘血細(xì)胞中占絕大多數(shù)，白細(xì)胞和血栓細(xì)胞只有很少的一部分。紅細(xì)胞的長(zhǎng)徑為(17.3±1.2)μm，短徑為(12.7±0.8)μm，細(xì)胞大小為(17.3±1.2)μm×(12.7±0.8)μm；核長(zhǎng)徑為(7.7±0.5)μm，核短徑為(6.4±0.6)μm，細(xì)胞核大小為(7.7±0.5)μm×(6.4±0.6)μm。紅細(xì)胞中散落分布有近圓形的早期成紅細(xì)胞(17.6±1.5)μm×(14.9±1.0)μm，其細(xì)胞核為(8.9±0.8)μm×(7.9±0.9)μm，明顯大于紅細(xì)胞核，核染色質(zhì)清晰可見(jiàn)，胞質(zhì)嗜堿性(圖1-A虛線(xiàn)箭頭)。

2.2 雜交鱘白細(xì)胞形態(tài)

雜交鱘白細(xì)胞包括有粒白細(xì)胞和無(wú)粒白細(xì)胞兩大類(lèi)。有粒白細(xì)胞主要有兩種：嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。無(wú)粒白細(xì)胞主要有單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。

2.2.1 雜交鱘嗜中性粒細(xì)胞形態(tài) 雜交鱘嗜中性粒細(xì)胞是顆粒白細(xì)胞中最多的一種，比紅細(xì)胞略微大一些。細(xì)胞長(zhǎng)徑為(18.0±2.5)μm，短徑為(15.8±1.9)μm。細(xì)胞一般呈橢圓形、圓形或不規(guī)則形，在細(xì)胞的表面有突起。經(jīng)染色后可見(jiàn)細(xì)胞核呈帶狀、腎形或2葉(圖1-B)、3葉(圖1-C)、4葉(圖1-D)、5葉(圖1-E)、6葉(圖1-F)狀，各分葉之間有絲狀或帶狀相連。部分細(xì)胞核的位置發(fā)生偏移，偏在細(xì)胞的一側(cè)。

2.2.2 雜交鱘嗜酸性粒細(xì)胞形態(tài) 雜交鱘嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量比較少，細(xì)胞呈圓形，比紅細(xì)胞體積大。染色可見(jiàn)紅色嗜酸性顆粒，分布均勻。細(xì)胞核分2葉(圖1-G)、3葉(圖1-H)、4葉(圖1-I)不等，且偏向細(xì)胞一側(cè)，呈藍(lán)色。細(xì)胞的長(zhǎng)徑為(17.1±1.7)μm，短徑為(16.1±1.6)μm。細(xì)胞一般呈圓形，所以它的長(zhǎng)徑和短徑相差不大。

2.2.3 雜交鱘淋巴細(xì)胞形態(tài) 雜交鱘淋巴細(xì)胞是白細(xì)胞中最多的細(xì)胞。其細(xì)胞核比較大，占據(jù)整個(gè)細(xì)胞的大部分，細(xì)胞質(zhì)較少，一般細(xì)胞核質(zhì)比為3∶1。經(jīng)過(guò)染色后可以觀察到細(xì)胞核被染成深藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)被染成藍(lán)色，像一層薄膜包裹在核周?chē)?。根?jù)雜交鱘的淋巴細(xì)胞直徑大小，將其分為大淋巴細(xì)胞(長(zhǎng)短徑10～20 μm)和小淋巴細(xì)胞(長(zhǎng)短徑均小于10 μm)2種。大淋巴細(xì)胞表面粗糙(圖1-J)，伸出偽足樣突起，其長(zhǎng)徑為(17.0±3.0)μm，短徑為(15.8±2.6)μm；小淋巴細(xì)胞表面光滑(圖1-K)，其長(zhǎng)徑為(9.8±0.1)μm，短徑為(9.3±0.1)μm。

2.2.4 雜交鱘單核細(xì)胞形態(tài) 雜交鱘單核細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核為不規(guī)則形(圖1-L實(shí)線(xiàn)箭頭)、腎形(圖1-L虛線(xiàn)箭頭)、S形(圖1-M)或U形(圖1-N)，染色質(zhì)較疏松，呈藍(lán)紫色；胞質(zhì)弱堿性，呈藍(lán)色；其長(zhǎng)徑為(18.9±1.7)μm，短徑為(16.8±1.7)μm。

2.3 雜交鱘血栓細(xì)胞形態(tài)

注： A為紅細(xì)胞(Er)和早期成紅細(xì)胞(Eae)(×40)；B、C、D、E、F為嗜中性粒細(xì)胞(分葉，Sne)(×100)；G、H、I為嗜酸性粒細(xì)胞(分葉，Seo)(×100)；J為大淋巴細(xì)胞(Ll)(×100)；K為小淋巴細(xì)胞(Sl)(×100)；L、M、N為單核細(xì)胞(Sm)(×100)；O、P、Q為血栓細(xì)胞(Th)(×100)Note: A，Erythrocyte(Er) and early erythroblast (Eae)(×40); B,C,D,E,and F，Neutrophil segmented granulocyte (Sne)(×100); G,H,and I，Eosinophil segmented granulocyte(Seo)(×100); J，Large lymphocyte (Ll)(×100); K，Small lymphocyte(Sl)(×100); L,M,and N，Monocyte segmented granulocyte (Sm)(×100); O,P,and Q，Thrombocyte(Th)(×100)圖1 雜交鱘外周血細(xì)胞的顯微圖Fig.1 Microstructure of the peripheral hematocytes in hybrid sturgeon

雜交鱘血栓細(xì)胞呈紡錘形或近圓形，在血涂片上往往有2個(gè)(圖1-O)、4個(gè)或5個(gè)(圖1-P)甚至大量(圖1-Q)血栓細(xì)胞聚集在一起。細(xì)胞質(zhì)濃密，著色深，而且細(xì)胞質(zhì)較少，一般出現(xiàn)在細(xì)胞核兩端，有時(shí)較難看到；細(xì)胞核幾乎占據(jù)整個(gè)血栓細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)在其周?chē)挥斜”∫粚?。血栓?xì)胞的個(gè)體較小，為(8.2±1.2)μm×(6.5±1.3)μm，略大于紅細(xì)胞的細(xì)胞核。

3 討論

3.1 紅細(xì)胞

紅細(xì)胞在血細(xì)胞中廣泛存在，它能攜帶大量的氧氣輸送到全身各組織。在高等哺乳動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中細(xì)胞核消失的現(xiàn)象，其目的是增加攜氧面積，進(jìn)而攜帶更多的氧氣。不同的生理?xiàng)l件或病理狀態(tài)下紅細(xì)胞的形態(tài)、大小和數(shù)量可發(fā)生變化。據(jù)研究，在產(chǎn)卵、長(zhǎng)期饑餓或寒冷的情況下，鯉的紅細(xì)胞數(shù)量減少；在缺氧條件下，紅細(xì)胞的數(shù)量激增；而由于寄生蟲(chóng)所引起的機(jī)體疾病則會(huì)使紅細(xì)胞和血紅蛋白降低[12]。魚(yú)類(lèi)紅細(xì)胞的大小因種類(lèi)和生活環(huán)境不同而存在一定的差異[13]。由于環(huán)境的變化，魚(yú)類(lèi)的紅細(xì)胞并未徹底的分化，而是失去了分化能力，甚至停止分裂[14]。本研究中并未發(fā)現(xiàn)處于分裂狀態(tài)的紅細(xì)胞，這與對(duì)達(dá)氏鰉[9]及中華鱘[11]的研究結(jié)果一致。而對(duì)駝背鱸Cromileptesaltivelis[15]、條石鯛Oplegnathusfasciatus[16]、史氏鱘[17]、葉爾羌高原鰍Triplophysa(Hedinichthys)yarkandensis(Day)[18]等的研究發(fā)現(xiàn)，其外周血的紅細(xì)胞核可見(jiàn)分裂現(xiàn)象，這與對(duì)雜交鱘紅細(xì)胞的研究結(jié)果不同。雜交鱘外周血中可見(jiàn)早期成紅細(xì)胞，與達(dá)氏鰉[9]相似，但不同于中華鱘[11]與史氏鱘[17]。早期成紅細(xì)胞在高等哺乳動(dòng)物的正常外周血中一般不存在，但存在于魚(yú)類(lèi)中，說(shuō)明魚(yú)類(lèi)在動(dòng)物進(jìn)化中處于較低等水平；此外，早期成紅細(xì)胞的存在也表明，魚(yú)類(lèi)的紅細(xì)胞可以在自己的外周血環(huán)境中逐步發(fā)育成熟。

3.2 白細(xì)胞

雜交鱘的血涂片中未發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細(xì)胞。嗜堿性粒細(xì)胞在血液中存在的數(shù)量最少，中華鱘[11]與史氏鱘[17]的外周血中也未發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細(xì)胞，這可能與它在制作中易解體的性質(zhì)有關(guān)，所以不容易被發(fā)現(xiàn)[19]。本研究中，雜交鱘的嗜中性粒細(xì)胞胞質(zhì)嗜弱堿性，顆粒不明顯，核的形態(tài)多樣，分葉由2葉到6葉不等，核位于細(xì)胞的中央。目前，尚未見(jiàn)魚(yú)類(lèi)外周血中有具體統(tǒng)計(jì)嗜中性粒細(xì)胞核分葉數(shù)方面的報(bào)道。而雜交鱘嗜酸性粒細(xì)胞表面有粗大的紅色顆粒，核偏于細(xì)胞的一側(cè)，分葉有2葉至4葉不等，這明顯不同于金魚(yú)嗜酸性粒細(xì)胞為桿狀、腎形、半圓形或偶見(jiàn)二分葉形核[20]。達(dá)氏鰉[9]外周血中也未見(jiàn)分葉形嗜酸性粒細(xì)胞的存在，中華鱘[11]中雖指出嗜酸性粒細(xì)胞有分葉的現(xiàn)象，但并未指出具體的分葉數(shù)。本研究中，雜交鱘外周血中的單核細(xì)胞最大，核多見(jiàn)于S形、U形、近圓形和不規(guī)則形，細(xì)胞質(zhì)明顯多于淋巴細(xì)胞。而大淋巴細(xì)胞有偽足，小淋巴細(xì)胞未見(jiàn)有偽足的現(xiàn)象。對(duì)于淋巴細(xì)胞的分類(lèi)，不同的學(xué)者見(jiàn)解不同：Ellis[21]指出，淋巴細(xì)胞雖然有大小兩種狀態(tài)，但實(shí)際上是處于不同功能狀態(tài)的同一種細(xì)胞；Barber等[22]也認(rèn)為，不能以細(xì)胞的直徑大小用于淋巴細(xì)胞的分類(lèi)；林光華[23]則將細(xì)胞大小與形態(tài)特征相結(jié)合，將成年草魚(yú)的淋巴細(xì)胞分為大小兩種。本研究中也根據(jù)細(xì)胞大小與形態(tài)特征將淋巴細(xì)胞分為大小兩種，這與達(dá)氏鰉[9]相似。

3.3 血栓細(xì)胞

魚(yú)類(lèi)的血栓細(xì)胞類(lèi)似于高等脊椎動(dòng)物的血小板，是所有血細(xì)胞中體積最小的一種細(xì)胞。不同魚(yú)類(lèi)血栓細(xì)胞的形態(tài)不同，達(dá)氏鰉[9]的血栓細(xì)胞呈圓形或橢圓形。本研究中，雜交鱘血栓細(xì)胞呈紡錘形或近圓形，其大小明顯小于小淋巴細(xì)胞，但大于紅細(xì)胞的細(xì)胞核。