合浦珠母貝糖胺聚糖泡騰片制備工藝優(yōu)化及其質(zhì)量分析

張磊，王錦旭，楊賢慶，魏涯，楊少玲

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306)

泡騰片是含有泡騰崩解劑的片劑，崩解劑一般由酸源和碳源組成，遇水后其中的酸和堿發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并放出二氧化碳?xì)怏w，使片劑迅速崩解和融化[1]。泡騰片不僅方便攜帶、保質(zhì)期長(zhǎng)，而且容易吸收、生物利用度高，特別適合老年人或者有咀嚼困難的人群，起初用于制藥領(lǐng)域，近年來(lái)在食品和保健品領(lǐng)域也進(jìn)行了大量研究，且成果顯著，越來(lái)越受到人們的歡迎，如維生素C泡騰片[2]、黑莓泡騰片[3]等。

合浦珠母貝Pinctadamartensii[4-6]是中國(guó)南海珠母貝的主要貝種之一，分布在廣東、廣西和海南沿海地區(qū)，每年珠農(nóng)采珠后剩余的加工副產(chǎn)物珍珠貝肉高達(dá)3500～4000 t，大多為鮮食或粗加工后食用，深加工率較低，保藏期短，價(jià)格低廉。合浦珠母貝貝肉除了富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和多種礦物質(zhì)外，其中的糖胺聚糖(Glycosaminoglycans，GAGs)作為一種天然的生物活性多糖也越來(lái)越引人關(guān)注。糖胺聚糖，也稱氨基多糖或酸性黏多糖，是由重復(fù)的二糖單位構(gòu)成的長(zhǎng)鏈多糖，存在于多數(shù)海洋動(dòng)物的組織中，具有調(diào)節(jié)免疫[7]、抗腫瘤[8-9]、降血脂[10]、抗氧化[11]等多種生物活性[12]，可用于營(yíng)養(yǎng)健康食品領(lǐng)域，具有重要的經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)價(jià)值。中國(guó)是貝類養(yǎng)殖大國(guó)，資源極為豐富，利用加工副產(chǎn)物提取糖胺聚糖，開(kāi)發(fā)出新產(chǎn)品，對(duì)實(shí)現(xiàn)合浦珠母貝高值化利用和養(yǎng)殖業(yè)健康持續(xù)發(fā)展具有重要意義[13]。本研究中，以合浦珠母貝糖胺聚糖為主料，泡騰崩解劑、黏合劑、潤(rùn)滑劑、矯味劑和稀釋劑等為輔料，制備出酸甜可口、質(zhì)量安全的泡騰片，在補(bǔ)充功能因子的同時(shí)，增強(qiáng)適口感，旨在為人類提供一種新型的營(yíng)養(yǎng)健康食品，促進(jìn)貝類資源的高值化利用，豐富合浦珠母貝的食品種類。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用合浦珠母貝貝肉全臟器購(gòu)自廣東省徐聞縣，于冰箱(-18 ℃)中保存，糖胺聚糖精制品從合浦珠母貝貝肉中提取，用1，9-二甲基亞甲基藍(lán)法測(cè)得純度均在80%以上，置于冰箱(-4 ℃)中冷藏備用。

主要試劑：中性蛋白酶(酶活力100 U/mg)、胰蛋白酶(酶活力250 U/mg)、透析袋、DEAE-52纖維素填料均購(gòu)自廣州齊云生物技術(shù)有限公司，聚乙二醇(PEG)4000 購(gòu)自汕頭市光華化學(xué)廠，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)購(gòu)自美國(guó)陶氏化學(xué)公司，乳糖購(gòu)自德國(guó)MEGGLE公司，檸檬酸、碳酸氫鈉、甘露糖、三氯蔗糖等均為食品級(jí)。

主要儀器設(shè)備：Milli-Q超純水機(jī)(美國(guó)MILLIPORE公司)；HWS24電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；Alpha1-4冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Christ；Delta320)；精密pH計(jì)[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；TDP-1單沖壓片機(jī)(上海天凡藥機(jī)制造廠)；BJ-3崩解時(shí)限測(cè)定儀(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；78X-3片劑四用測(cè)試儀(上海黃海藥檢儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 合浦珠母貝糖胺聚糖提取工藝 將合浦珠母貝全臟器在常溫下自然解凍，攪成肉泥備用。取一定量貝肉加2倍體積的水，55 ℃下浸提4 h，4 ℃下浸提12 h；加入中性蛋白酶和胰蛋白酶，pH調(diào)至7.6，復(fù)合酶解4 h，煮沸10 min滅酶，以10 000 r/min離心20 min，取上清液，重復(fù)離心操作直至除去雜質(zhì)蛋白；上清液pH調(diào)至7.0，加70%乙醇4 ℃下醇沉12 h，離心取沉淀，經(jīng)冷凍干燥得糖胺聚糖粗制品，粗多糖經(jīng)過(guò)透析，用DEAE-52纖維素陰離子柱層析分離得到合浦珠母貝糖胺聚糖精制品[14]。

1.2.2 合浦珠母貝糖胺聚糖泡騰片制備 將合浦珠母貝糖胺聚糖與崩解劑、乳糖按適當(dāng)比例混合，攪拌均勻后過(guò)100目篩，向混合原料緩慢噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的PVP乙醇溶液，同時(shí)不斷攪拌均勻，制成軟硬適中的軟材，過(guò)16目篩，使軟材變成顆粒，將制成的濕顆粒攤放在搪瓷盤中，于65 ℃下烘干至水分含量為0.5%以下，粉碎過(guò)20目篩，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的潤(rùn)滑劑和3%的矯味劑，用單沖壓片機(jī)壓片，采用紫外線殺菌機(jī)進(jìn)行紫外殺菌，采用雙鋁包裝按10片每板的規(guī)格包裝[15]。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 影響泡騰片成型的主要因素是酸源和碳源種類、酸堿比例和崩解劑用量，本研究中采用單因素試驗(yàn)，以CO2釋放量、pH值為考察指標(biāo)來(lái)確定泡騰崩解劑。因泡騰片具有較強(qiáng)的吸濕性，在制備過(guò)程中有一定的難度，因此，本試驗(yàn)中選取吸濕性較小的乳糖為稀釋劑，輔助一定的黏合劑和潤(rùn)滑劑提高制粒效果，改善壓片進(jìn)程[16]。采用單因素試驗(yàn)法對(duì)處方中各影響因素的作用進(jìn)行考察，優(yōu)化制備工藝。

1.2.4 正交試驗(yàn) 通過(guò)單因素試驗(yàn)，選出影響泡騰片品質(zhì)的3個(gè)主要因素為崩解劑、黏合劑和潤(rùn)滑劑。為進(jìn)一步優(yōu)化糖胺聚糖泡騰片的配方，采用L9(34)正交試驗(yàn)，以崩解時(shí)限和硬度為考察指標(biāo)，優(yōu)化崩解劑、PVP、PEG4000的添加量。

1.2.5 質(zhì)量指標(biāo)的測(cè)定方法 采用儀器法測(cè)定pH值、硬度、崩解時(shí)限；根據(jù)GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》測(cè)定水分含量；采用1，9-二甲基亞甲基藍(lán)法測(cè)定糖胺聚糖含量；分別采用BCA試劑盒法、苯酚-硫酸法測(cè)定蛋白質(zhì)和總糖含量；采用濕法消解ICP-MS測(cè)定重金屬污染物含量；根據(jù)GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》、GB 4789.3—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》等測(cè)定微生物指標(biāo)；根據(jù)中國(guó)藥典2015年版測(cè)定重量差異；采用失重法測(cè)定CO2釋放量[17]；采用固定漏斗法測(cè)定休止角[18]。

1.2.6 合浦珠母貝糖胺聚糖咀嚼片的SD大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) SD大鼠為SPF級(jí)，雌、雄各半，體質(zhì)量為180～200 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2013-0003，試驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明號(hào)44007200037911]。動(dòng)物飼養(yǎng)于廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)施[許可證號(hào)SYXK(粵)2013-0002，動(dòng)物試驗(yàn)證明號(hào)00165703]中，試驗(yàn)相關(guān)的內(nèi)容和程序遵從試驗(yàn)動(dòng)物使用和管理的相關(guān)法律法規(guī)及試驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。

將雌、雄各20只SD大鼠隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組和合浦珠母貝糖胺聚糖泡騰片組，每組20只,雌、雄各10只，采用最大耐受量試驗(yàn)法進(jìn)行試驗(yàn)，按大鼠最大灌胃容量20 mL/kg(體質(zhì)量)，24 h內(nèi)灌胃3次，兩次灌胃時(shí)間間隔4～6 h。以蒸餾水為溶劑對(duì)照組，合浦珠母貝糖胺聚糖泡騰片作為受試物，加蒸餾水溶解，劑量為90 g/kg(體質(zhì)量)，其中的功能因子糖胺聚糖劑量為22.5 g/kg(體質(zhì)量)。觀察并記錄給予受試物過(guò)程和觀察期內(nèi)動(dòng)物的中毒和死亡情況，觀察期為14 d，觀察期內(nèi)中毒死亡以及觀察期滿處死的動(dòng)物均應(yīng)解剖，肉眼觀察，如發(fā)現(xiàn)組織或臟器出現(xiàn)異常，進(jìn)一步作組織病理學(xué)檢查，分別在第0、1、3、7、14天稱重，急性毒性劑量分級(jí)表對(duì)受試物的毒性評(píng)價(jià)規(guī)定如表1所示[19]。

表1 急性經(jīng)口毒性的評(píng)價(jià)規(guī)定Tab.1 Evaluation regulations of acute oral toxicity

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用正交設(shè)計(jì)助手II專業(yè)版對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 崩解劑酸源選擇 由化學(xué)反應(yīng)原理可知，碳酸氫鈉、碳酸鈉產(chǎn)氣效果不同，產(chǎn)氣量相同時(shí)碳酸氫鈉用量更少，因此，選用碳酸氫鈉為崩解劑碳源。以碳酸氫鈉作為崩解劑碳源，對(duì)比相同添加量的檸檬酸、富馬酸、酒石酸對(duì)泡騰片品質(zhì)的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，由檸檬酸作為崩解劑酸源的泡騰片外觀良好，溶解后無(wú)可見(jiàn)不溶物，且口感較好。因此，選擇檸檬酸作為酸源。

表2不同酸源對(duì)糖胺聚糖泡騰片品質(zhì)的影響

Tab.2Effectsofdifferentacidsourcesonqualityoftheglycosaminoglycaneffervescenttablets

酸源acid source外觀surface溶解效果solubility口感taste檸檬酸citric acid形態(tài)較完整,表面光滑無(wú)不溶物清爽可口富馬酸fumaric acid形態(tài)完整,表面光滑可見(jiàn)不溶物爽口度較好酒石酸t(yī)artaric acid形態(tài)較完整,表面光滑有明顯可見(jiàn)不溶物爽口度較好

2.1.2 崩解劑配比的確定 選用碳酸氫鈉和檸檬酸為崩解劑，通過(guò)調(diào)整碳酸氫鈉與檸檬酸的用量改善泡騰片的品質(zhì)。按照基礎(chǔ)配方[20]，糖胺聚糖25%，碳酸氫鈉和檸檬酸40%，黏合劑2%，矯味劑3%，乳糖為填充劑，以泡騰片CO2釋放量和pH值為指標(biāo)，考察碳酸氫鈉和檸檬酸的比例，其中碳酸氫鈉與檸檬酸的質(zhì)量比分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，隨著碳酸氫鈉比例的增加，CO2釋放量也顯著增加(P<0.05)，當(dāng)二者的比例大于1∶1時(shí)，CO2釋放量增加緩慢，溶液pH也逐漸升高至接近中性。在考慮CO2釋放量的同時(shí)，還要兼顧酸堿反應(yīng)后產(chǎn)生的檸檬酸鈉，如生成量過(guò)多會(huì)有不愉快的澀味，故碳酸氫鈉的用量不宜過(guò)高。當(dāng)碳酸氫鈉和檸檬酸的比例為1∶2時(shí)，CO2釋放量較多，且pH符合要求，口感較好，因此，選用碳酸氫鈉與檸檬酸比例為1∶2。

表3崩解劑配比對(duì)糖胺聚糖泡騰片CO2釋放量和反應(yīng)溶液pH的影響

Tab.3EffectsofdisintegrantratioonCO2amountandpHofglycosaminoglycaneffervescenttablets

碳酸氫鈉∶檸檬酸sodium bicarbonate∶citric acidCO2釋放量/mgCO2 amountpH值pH value3∶19.67±0.14a6.33±0.11a2∶19.58±2.02a6.19±0.04a1∶19.16±0.17ab5.51±0.18b1∶28.65±0.21b4.21±0.12c1∶36.10±0.87c3.40±0.21d

注：同列中標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，下同

Note：The means with different letters within the same column are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences, et sequentia

2.1.3 崩解劑添加量的確定 崩解劑酸堿反應(yīng)產(chǎn)生的檸檬酸鈉為偏堿性的鹽，當(dāng)泡騰片中碳酸氫鈉與檸檬酸添加量適當(dāng)時(shí)，才能使泡騰片有良好CO2釋放量和口感，同時(shí)崩解劑的添加量還會(huì)對(duì)崩解時(shí)限產(chǎn)生重要影響[21]。本試驗(yàn)中以崩解時(shí)限和CO2釋放量為指標(biāo)，考察泡騰片崩解劑添加量，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，隨著泡騰崩解劑用量的增加，其崩解時(shí)限呈先減小后增加的趨勢(shì)，可能是因?yàn)樘砑恿吭黾?，輔料比例減少，不能迅速分散。當(dāng)添加量為35%時(shí)，其崩解時(shí)限最小，其次是添加量為30%，當(dāng)添加量為25%時(shí)，崩解時(shí)限最長(zhǎng)；在CO2釋放量方面，當(dāng)添加量大于35%時(shí)，均符合要求。綜上所述，可以選用35%作為崩解劑的添加量，即碳酸氫鈉為11.6%，檸檬酸為23.2%。

表4泡騰崩解劑添加量對(duì)糖胺聚糖泡騰片崩解時(shí)限和發(fā)泡量的影響

Tab.4EffectsoftheeffervescentdisintegrantamountonthedisintegrationtimeandCO2amount

崩解劑添加量/%disintegrant amount崩解時(shí)限/sdisintegration timeCO2釋放量/mgCO2 amount2538.33±1.53a5.63±0.21a3034.00±2.00bc7.63±0.22b3533.67±1.53c9.14±0.35c4035.67±1.53abc10.16±0.09d5037.33±2.52ab11.20±0.43a

2.1.4 黏合劑添加量的確定 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)等均為親水性的黏合劑，制成的顆粒表面具有親水性，水分易濕潤(rùn)、透入，加快片劑崩解速度。本試驗(yàn)中采用酸堿混合制粒工藝，需嚴(yán)格控制接觸水分，所以選擇可溶于無(wú)水乙醇的PVP作為黏合劑。以崩解時(shí)限和片劑硬度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、2%、4%、6%、8%的PVP乙醇溶液對(duì)糖胺聚糖泡騰片質(zhì)量指標(biāo)的影響，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知：當(dāng)PVP添加量大于2%時(shí)，泡騰片崩解時(shí)限顯著增加(P<0.05)，硬度也隨之增大，不易崩解，容易出現(xiàn)裂片現(xiàn)象，且所制軟材偏黏，顆粒不均勻，壓片易黏沖；當(dāng)PVP添加量小于2%時(shí)，制得軟材較松散，顆粒粉末增多，壓片硬度偏小，泡騰片易松散；當(dāng)PVP添加量為2%時(shí)，黏性好，干顆粒經(jīng)過(guò)手捻能粉碎成有粗糙感的細(xì)粉，且崩解時(shí)限和硬度適宜。因此，選擇2% PVP作為最佳黏合劑添加量。

表5PVP添加量對(duì)泡騰片崩解時(shí)限和硬度的影響

Tab.5EffectsofPVPamountonthedisintegrationtimeandhardnessofeffervescenttablets

PVP添加量/%PVP amount 崩解時(shí)限/sdisintegration time硬度/kghardness030.33±3.21c4.53±0.45e131.33±1.53c5.53±0.51d232.67±1.15c6.33±0.15c340.33±3.05b7.27±0.32b445.67±2.08a8.63±0.38a

2.1.5 潤(rùn)滑劑添加量的確定 為避免制片時(shí)由于顆粒流動(dòng)性不佳，出現(xiàn)片重波動(dòng)大、出片困難、光潔度低等現(xiàn)象，顆粒在壓片前要加入潤(rùn)滑劑。常用的片劑潤(rùn)滑劑有硬脂酸鎂、滑石粉、十二烷硫酸鈉(SDS)、聚乙二醇(PEG)4000等，其中，硬脂酸鎂、滑石粉為水不溶性，泡騰片在水中崩解后，會(huì)在水表面形成一層渾濁的薄膜，影響產(chǎn)品的感官品質(zhì)；SDS作為表面活性劑，可減小水表面活性，在泡騰片崩解后會(huì)殘留大量氣泡，影響泡騰片所產(chǎn)生的二氧化碳排放和溶劑可觀性；水溶性潤(rùn)滑劑PEG4000對(duì)泡騰片崩解后的澄清度無(wú)影響，且潤(rùn)滑性和抗黏性較好，宜選用[22-23]。

本試驗(yàn)中選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、1%、2%、3%、4%的PEG4000，以休止角和硬度為評(píng)定指標(biāo)，篩選最適的潤(rùn)滑劑添加量，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。潤(rùn)滑劑可使泡騰片的密度更加均勻，降低顆粒與壓片機(jī)孔壁間摩擦力。由表6可知：添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的潤(rùn)滑劑對(duì)崩解時(shí)限、休止角有不同程度的影響，當(dāng)潤(rùn)滑劑添加量小于2%時(shí)，休止角顯著增大(P<0.05)，顆粒流動(dòng)性差，出現(xiàn)黏沖現(xiàn)象；當(dāng)潤(rùn)滑劑加入過(guò)多時(shí)，崩解時(shí)限延長(zhǎng)， 可能是因?yàn)檫^(guò)多的潤(rùn)滑劑阻礙了水分進(jìn)入片劑中心，降低酸堿的反應(yīng)速度；當(dāng)潤(rùn)滑劑添加量為2%時(shí)，能在壓片中有效地改善顆?；蚍勰┑牧鲃?dòng)性，所得片劑的崩解時(shí)限較好，無(wú)黏沖現(xiàn)象。因此，確定潤(rùn)滑劑添加量為2%。

表6潤(rùn)滑劑添加量對(duì)泡騰片崩解時(shí)限和休止角的影響

Tab.6Effectsoflubricantamountonthedisintegrationtimeandthereposeangleofeffervescenttablets

2.1.6 矯味劑添加量的確定 蔗糖、阿斯巴甜、三氯蔗糖是食品中常用的矯味劑，甜度較高的阿斯巴甜或三氯蔗糖，可使泡騰片的崩解時(shí)限不受矯味劑添加量的影響，亦可避免糖含量高導(dǎo)致的吸潮結(jié)塊現(xiàn)象。由預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，阿斯巴甜較三氯蔗糖溶解度小、崩解時(shí)間長(zhǎng)，而三氯蔗糖極易溶于水，甜味更容易被接受，因此，選用三氯蔗糖作為矯味劑。三氯蔗糖是以蔗糖為原料的功能性甜味劑，無(wú)熱量，不會(huì)引起血糖增加，安全性高，口感純正，甜度為蔗糖的600倍，考察三氯蔗糖添加量分別為1%、2%、3%、4%、5%時(shí)對(duì)泡騰片口感的影響，結(jié)果見(jiàn)表7。從表7可知，當(dāng)三氯蔗糖添加量為3%時(shí)，甜度適中。同時(shí)為了解決糖胺聚糖藥物劑量小難以壓片，并具有一定黏性易黏結(jié)成團(tuán)的問(wèn)題，可復(fù)配一定量的乳糖和甘露糖作為泡騰片的稀釋劑和矯味劑，既能增加片劑的質(zhì)量，還可分散主料，減少主料成分劑量偏差。

表7三氯蔗糖添加量對(duì)泡騰片口感的影響

Tab.7Effectsofsucraloseamountonthetasteofeffervescenttablets

三氯蔗糖用量sucralose amount/%甜味分析 sweetness analysis1甜味很淡2甜味一般3甜度適中4較甜5很甜

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

采用L9(34)正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以崩解劑(A)、黏合劑(B)和潤(rùn)滑劑(C)的添加量為考察因素，以崩解時(shí)限和硬度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，試驗(yàn)因素水平及正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8、9，方差分析結(jié)果見(jiàn)表10、表11。

表8 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.8 Factors and levels of orthogonal experiments

表9 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.9 Design and results of orthogonal tests

表10 崩解時(shí)限方差分析結(jié)果Tab.10 Analysis of variance for disintegration time

表11 硬度方差分析結(jié)果Tab.11 Analysis of variance for hardness

由極差分析可以看出，3個(gè)因素對(duì)崩解時(shí)限和硬度影響的大小順序均為A>B>C，即崩解劑添加量的影響最大，黏合劑添加量的影響次之，潤(rùn)滑劑添加量的影響最小，崩解時(shí)限正交試驗(yàn)的最優(yōu)組合為A1B3C2，硬度正交試驗(yàn)的最優(yōu)組合為A1B3C3，即崩解劑添加量為35%、黏合劑添加量2%時(shí)，潤(rùn)滑劑添加量為2%或3%時(shí)，崩解時(shí)限和硬度指標(biāo)均較好。方差分析結(jié)果顯示，3個(gè)因素對(duì)崩解時(shí)限、硬度的影響均不顯著(P>0.05)。根據(jù)前期糖胺聚糖活性評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果和成人—小鼠劑量換算公式，合浦珠母貝糖胺聚糖的小鼠起效劑量為0.25 mg/d，按照公式換算為成人起效劑量為200 mg/d，按照每天服用四片咀嚼片計(jì)算，每片中的糖胺聚糖添加量為25%[24]。綜合考慮，最終確定泡騰片各組分最佳配比為糖胺聚糖25%、崩解劑35%(碳酸氫鈉與檸檬酸的配比為1∶2、黏合劑PVP 2%、潤(rùn)滑劑PEG4000 2%、矯味劑三氯蔗糖3%，余量為乳糖，制備過(guò)程中無(wú)黏沖現(xiàn)象，所得產(chǎn)品片崩解迅速，硬度符合要求。

2.3 泡騰片質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)

按本研究最優(yōu)工藝制得的泡騰片直徑約為8 mm，重約為200 mg，硬度為5.5～6.5 kg，崩解時(shí)間<40 s，雙平面圓形，表面光滑、整潔，遇水產(chǎn)生大量氣體，崩解迅速。根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版檢測(cè)方法，對(duì)糖胺聚糖泡騰片的感官、重量差異、pH值、崩解時(shí)限、重金屬和微生物限度等質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果如表12所示，均符合營(yíng)養(yǎng)健康食品的相關(guān)要求[25]。

2.4 急性經(jīng)口毒性

表12糖胺聚糖泡騰片質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

Tab.12Resultsofqualityindexofglycosaminoglycaneffervescenttablets

指標(biāo)index結(jié)果result顏色colour白色外觀surface雙平面圓形,外形整潔,表面光滑口感風(fēng)味taste口感柔和,微甜清爽,無(wú)雜質(zhì),具有特有的香氣和滋味硬度hardness6.0 kg崩解時(shí)限disintegration time34 s質(zhì)量差異weight difference(201.0±2.5) mg理化指標(biāo)physicochemical index水分0.38%,蛋白質(zhì)1.69%,總糖28.46%功能因子含量functional component合浦珠母貝糖胺聚糖50 mg污染物限量heavy metal limit鉛≤0.06 mg/kg,總砷≤0.05 mg/kg,總汞≤0.05 mg/kg,鎘≤0.06 mg/kg微生物限量microbial limit菌落總數(shù)<500 個(gè)/mL,霉菌<5 個(gè)/mL,酵母菌<50 個(gè)/mL,大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌未檢出

急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)主要是測(cè)定受試物的半數(shù)致死量或濃度，將試驗(yàn)動(dòng)物1次或24 h內(nèi)多次染毒，觀察其中毒表現(xiàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，無(wú)論是在給予受試物過(guò)程中或14 d觀察期內(nèi)，合浦珠母貝糖胺聚糖泡騰片組和溶劑對(duì)照組中的雌、雄SD大鼠均無(wú)死亡，大鼠表現(xiàn)行為、呼吸、活動(dòng)狀況、姿勢(shì)等均未見(jiàn)異常。將大鼠解剖后，肉眼觀察其心臟、肝臟、脾、胃、生殖腺等臟器的外形、顏色、大小與比例，均未見(jiàn)任何異常。如表13所示，大鼠體質(zhì)量正常增長(zhǎng)，在各測(cè)定時(shí)間點(diǎn)，合浦珠母貝糖胺聚糖泡騰片組的大鼠體質(zhì)量與溶劑對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。因此，在本試驗(yàn)條件下，合浦珠母貝糖胺聚糖泡騰片對(duì)SD大鼠經(jīng)口最大耐受劑量(MTD)高于15 g/kg，毒性分級(jí)為無(wú)毒。

3 討論

表13 SD大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)體質(zhì)量結(jié)果Tab.13 Body weight of SD rats in the acute oral toxicity experiments g

泡騰片崩解劑由酸源和碳源共同組成，采用酸堿混合非水造粒法進(jìn)行合浦珠母貝糖胺聚糖泡騰片的制備，可避免因崩解劑分開(kāi)制粒產(chǎn)生的操作工序復(fù)雜、生產(chǎn)周期長(zhǎng)等缺陷。本研究中選用PVP無(wú)水乙醇溶液作黏合劑，酸源和碳源可以同時(shí)制粒，此法不僅操作簡(jiǎn)單，而且酸堿接觸充分，崩解時(shí)限短，但需要嚴(yán)格控制相對(duì)濕度和水分的引入[26]。本試驗(yàn)中經(jīng)篩選，確定檸檬酸為崩解劑的酸源，郭冬艷等[27]在制備海棠泡騰片時(shí)也指出，檸檬酸作為酸源制成的泡騰片，其溶液具有澄明度高和口感好的特點(diǎn)。另外，崩解劑配比也是影響泡騰片品質(zhì)的另一重要因素，張真真等[28]制備果皮提取物泡騰片的試驗(yàn)結(jié)果表明，碳酸鈉與檸檬酸總量一定時(shí)，其配比為1∶1.6時(shí)壓片效果最好，這與本試驗(yàn)結(jié)果1∶2略有差異，可能是因?yàn)槠渑蒡v片中檸檬酸和碳酸鈉總量比本試驗(yàn)的高，但宮江寧等[29]制備的紫蘇提取物泡騰片中碳酸氫鈉與檸檬酸的質(zhì)量比為1∶2，與本試驗(yàn)結(jié)果相符。曹光環(huán)等[30]運(yùn)用正交試驗(yàn)以崩解時(shí)限為指標(biāo)，對(duì)崩解劑用量32%、37%、42% 3個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)添加量為37%，而本試驗(yàn)得到的崩解劑添加量為35%，這從側(cè)面印證了數(shù)據(jù)的可靠性。此外，片劑的崩解效果還受到片劑硬度的影響，隨著片劑硬度增加，崩解時(shí)限延長(zhǎng)，當(dāng)控制片劑的硬度為5.0～7.0 kg時(shí)，片劑不易掉渣，崩解時(shí)限較短。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究中通過(guò)正交試驗(yàn)結(jié)果分析得到泡騰片最優(yōu)配方為糖胺聚糖添加量25%，碳酸氫鈉和檸檬酸總添加量35%(碳酸氫鈉和檸檬酸比例為1∶2)，PVP、PEG4000和三氯蔗糖添加量分別為泡騰片總質(zhì)量的2%、2%、3%，余量為乳糖。按最佳配方制備的泡騰片色澤均勻，硬度適中，崩解時(shí)限短，根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版檢測(cè)方法，對(duì)糖胺聚糖泡騰片的感官、重量差異、硬度、崩解時(shí)限、重金屬污染物和微生物限度等質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)要求。通過(guò)構(gòu)建急性經(jīng)口毒性大鼠模型，觀察試驗(yàn)動(dòng)物的中毒表現(xiàn)，證實(shí)其安全性較高。