梳型陽離子共聚物輔助構(gòu)建DNA生物傳感體系用于檢測單堿基錯配

張銘珂 韓佳倫 劉晨 吳金才 杜杰

（海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，海口 570228）

近年來，人們越來越多的通過分析基因?qū)用嬷虏C(jī)理來進(jìn)行疾病治療［1-4］。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論中，特定的致病基因或易感基因均會導(dǎo)致與之對應(yīng)的疾病發(fā)生。而其中最值得注意的當(dāng)屬基因突變中的單堿基突變，包括單個堿基的轉(zhuǎn)換、缺失、插入、顛換四種形式。因其在基因突變中所占的比例極大，所以在研究人類疾病的過程中，單堿基突變的檢測至關(guān)重要。

檢測單堿基錯配的方法種類繁多，上世紀(jì)就有變性梯度膠電泳法、核糖核酸酶法和等位基因特異性寡聚核苷酸雜交法等各種有效的方法。近年來，隨著基因檢測領(lǐng)域的不斷開拓，又在這些基礎(chǔ)上擴(kuò)展了很多新的內(nèi)容，其中大多是構(gòu)建新型高效的分子探針，通過探針與特定靶標(biāo)配合作用，最終以光、電等信號將作用結(jié)果輸出，從而進(jìn)行檢測。而實現(xiàn)對單堿基錯配的方便、快速、準(zhǔn)確的檢測對疾病的治療以及藥物的開發(fā)等方面都有著極為重要的意義［5-9］。

熒光DNA生物傳感器可以將所識別信息轉(zhuǎn)換成可檢測的熒光信號，從而實現(xiàn)對物質(zhì)的定性或定量檢測。它有光學(xué)傳感器所特有的非破壞性和高靈敏性和用量少、選擇性好、方法簡便等優(yōu)點［10］。而因氧化石墨烯具有獨特的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)、較好的水溶性、良好的生物相容性和低毒等性能，在分子水平檢測過程中常被應(yīng)用［11］。近幾年研究成果顯示，將有優(yōu)異熒光淬滅能力的氧化石墨烯應(yīng)用在熒光生物傳感技術(shù)中，可以快速準(zhǔn)確的檢測蛋白質(zhì)、核酸或者其他的生物小分子［12-14］。這種分析方法還有成本較低操作方便等優(yōu)點，所以在分子水平檢測方面有廣闊的發(fā)展空間和樂觀的發(fā)展前景。

基于此，為了更好的檢測單堿基錯配，本研究構(gòu)建了一個無酶、簡單、精確的分析體系。該體系利用氧化石墨烯優(yōu)異的熒光淬滅能力、對單雙鏈DNA吸附能力的差異和具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)這些特點，同時結(jié)合梳型陽離子共聚物PLL-g-Dex能夠促進(jìn)DNA雜化及鏈交換反應(yīng)，并且穩(wěn)定DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的特點，構(gòu)建了一個快速、靈敏的生物傳感體系用于檢測DNA單堿基錯配。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基本材料 聚賴氨酸接枝葡聚糖PLL-g-Dex共聚物和氧化石墨烯均由海南大學(xué)熱帶島嶼資源先進(jìn)材料教育部重點實驗室提供。DNA序列見表1。

1.1.2 試劑及儀器 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的 Na2HPO4·12H2O，EDTA 和 HCl，西隴化工股份有限公司生產(chǎn)的NaCl，KH2PO4，C2H5OH和NaOH。以上所提及的試劑均為二級試劑。主要儀器及設(shè)備見表2。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑的配制

1.2.1.1 ssDNA儲備液的配制 在26℃的狀態(tài)下，將裝有干粉DNA的離心管在高轉(zhuǎn)速下離心，約15 s后DNA會全部集中在離心管底，此時停止旋轉(zhuǎn)。按照合成單上濃度為100 μmol/L時的劑量加入無酶水，振蕩使管內(nèi)DNA混勻并充分溶解。再根據(jù)紫外檢測結(jié)果計算出準(zhǔn)確濃度，精確的配制成10 μmol/L的溶液裝好，在4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 DNA序列

表2 主要儀器及設(shè)備

1.2.1.2 GO分散液的制備 用超純水將GO儲備液配成氧化石墨稀分散液濃度為60 μg/mL的溶液。超聲2 h后在10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，取其上清液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 PBS緩沖溶液的配制 使用KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、NaCl、EDTA 以及超純水配制PBS緩沖溶液1 L。使用前的準(zhǔn)備：取出適量溶液利用 NaOH（0.1 mol/L）、HCl（0.1 mol/L）調(diào)節(jié)至pH7.2。在120℃下滅菌30 min，冷卻后在4℃條件下保存。

1.2.1.4 PLL-g-Dex儲備液的配制 取2 mg的PLL-g-Dex（由實驗室提供），2 mL的超純水，配制成濃度為1 mg/mL的儲備液，在4℃條件下放置以待使用。

1.2.2 熒光檢測

1.2.2.1 檢測T-DNA（已被TAMRA熒光標(biāo)記）單獨在PBS緩沖液中的熒光值 在室溫條件下，檢測由 6 μL 的 T-DNA（10 μmol/L）和 PBS（pH 7.2）緩沖液組成的體系發(fā)射出的熒光信號，待信號穩(wěn)定。最終體系總體積3 mL，T-DNA終濃度20 nmol/L。

1.2.2.2 GO最佳濃度的選擇 將6 μL的T-DNA（10 μmol/L） 分 別 與 100、150、200、250、300、350、400和450 μL的GO溶液（60 μg/mL）混合，待30 min后檢測熒光。對比檢測結(jié)果得到最優(yōu)的GO猝滅濃度。最終體系總體積3 mL，T-DNA濃度20 nmol/L，GO濃度分別為 2、3、4、5、6、7、8、9和 10 μg/mL。

1.2.2.3 cDNA最佳濃度的選擇 分別加6、9、12、15、18 和 21 μL 的 cDNA（10 μmol/L）到含有 6 μL的 T-DNA（10 μmol/L）和 450 μL的濃度為 GO（60 μg/mL）的PBS（pH 7.2）緩沖液中，均勻混合2 h后，檢測體系中顯示的熒光值，掃描平衡時間。體系總體積3 mL，T-DNA濃度20 nmol/L，GO濃度9 μg/mL。cDNA的濃度分別為20、30、40、50、60、70、80和 90 nmol/L。

1.2.2.4 PLL-g-Dex最佳濃度的選擇 將完全匹配的20 nmol/L的 T-DNA，9 μg/mL的 GO，90 nmol/L的cDNA混合后加入到PBS（pH7.2）緩沖液中構(gòu)成的T-DNA-GO-cDNA體系，再分別加入不同濃度（24、48、72、96、120和 144 nmol/L）的 PLL-g-Dex，檢測體系中顯示的熒光值，掃描平衡時間，最終體系總體積3 mL。

1.2.2.5 T-DNA-GO+PLL-g-Dex體系對單堿基錯配的選擇性 將完全匹配的20 nmol/L的T-DNA，9 μg/mL的 GO，90 nmol/L的 cDNA，96 nmol/L的PLL-g-Dex混合后加入到PBS（pH7.2）緩沖液中構(gòu)成T-DNA-GO+PLL-g-Dex體系，再向其中分別加入與之互補(bǔ)的cDNA（90 nmol/L），M1、M2、M3檢測熒光恢復(fù)情況。其中每種錯配堿基DNA的終濃度都是90 nmol/L，M1、M2、M3應(yīng)提前在室溫下培育30 min。

若無特殊說明，實驗中均采用熒光分光光度計檢測熒光，在PBS緩沖液（pH7.2）中進(jìn)行，其中熒光比色皿裝樣為3 mL，發(fā)射光譜波長范圍575-700 nm，激發(fā)光譜波長560 nm，曲線所用熒光強(qiáng)度在582 nm的波長。實驗數(shù)據(jù)整合使用origin8.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 方法設(shè)計的可行性驗證

先使T-DNA（20 nmol/L）與不同試劑進(jìn)行組合，再檢測各個體系所發(fā)射出的熒光信號，實驗結(jié)果如圖1所示。圖中曲線a表示當(dāng)在PBS緩沖液中僅加入帶有TAMRA標(biāo)記的T-DNA（20 nmol/L）時，體系發(fā)出的熒光值為363，即顯示出較強(qiáng)的熒光信號。圖中曲線b表示在a組的基礎(chǔ)上再加入GO（9 μg/mL）時，體系中絕大部分的熒光被淬滅，被淬滅的熒光占比高達(dá)91.6%。圖中曲線c表示在b組的基礎(chǔ)上再向體系加入cDNA（90 nmol/L）時（所加入的cDNA與T-DNA完全匹配），出現(xiàn)了熒光恢復(fù)，數(shù)據(jù)表明熒光信號約恢復(fù)了60%。圖中曲線d表示在c組的基礎(chǔ)上再向體系加入PLL-g-Dex（96 nmol/L）時，熒光強(qiáng)度恢復(fù)率激增，甚至達(dá)到a組的熒光強(qiáng)度。因此，我們可以得知實驗設(shè)計思路是切實可行的。

圖1 不同條件下被TAMRA標(biāo)記的T-DNA（20 nmol/L）所顯示的熒光光譜

2.2 體系反應(yīng)時間檢測

分別檢測3組不同條件下被TAMRA標(biāo)記的T-DNA（20 nmol/L）顯示出的熒光光度值和反應(yīng)時間的關(guān)系，結(jié)果如圖2所示。

圖2 T-DNA（20 nmol/L）在不同條件下的熒光光度值和反應(yīng)時間的關(guān)系（采集熒光信號的時間分別為5、10、20、30、40、50、60、80、100、120 min）

由圖2可知，若在T-DNA（20 nmol/L）溶液中加入與之相適應(yīng)的GO（9 μg/mL）時，可觀察到體系中絕大部分熒光在5 min之內(nèi)被淬滅，之后熒光值以極緩慢的速度繼續(xù)下降，30 min內(nèi)熒光值趨于平穩(wěn)。隨后若添加與T-DNA（20 nmol/L）完全匹配的cDNA（90 nmol/L）時，觀察到T-DNA-GO-cDNA體系的熒光信號恢復(fù)，60 min后熒光信號達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。若熒光被淬滅后在T-DNA（20 nmol/L）溶液中同時加入與其相匹配的cDNA（90 nmol/L）和PLL-g-Dex（96 nmol/L）后，可觀察到新體系中熒光值恢復(fù)更加明顯，熒光信號同樣是在60 min后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。對比數(shù)據(jù)可知，此時熒光強(qiáng)度已經(jīng)恢復(fù)到了在PBS緩沖液中僅添加T-DNA時所顯示的熒光強(qiáng)度。

2.3 實驗條件的選擇

2.3.1 氧化石墨烯最佳濃度的選擇 隨著不同濃度（0、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/mL）GO 的加入，TAMRA標(biāo)記的T-DNA（20 nmol/L）的熒光強(qiáng)度變化如圖3所示。

由圖3可知，GO的加入會對被TAMRA標(biāo)記的T-DNA（20 nmol/L）所顯示出的熒光造成影響，隨著加入的GO濃度的持續(xù)升高，熒光值會不斷降低。當(dāng)所加入的GO濃度為10 μg/mL時，GO過量并且影響了體系檢測的靈敏性。但當(dāng)GO濃度維持在較低水平時，不能有效的淬滅體系顯示出的熒光。綜合對比認(rèn)為采用濃度為9 μg/mL的GO為最好，此時體系的熒光被淬滅91.6%。

2.3.2 cDNA最佳濃度的選擇 在T-DNA（20nmol/L）和GO（9 μg/mL）的混合液中，分別添加不同濃度的 cDNA（20、30、40、50、60、70、80和90 nmol/L），檢測T-DNA-GO傳感器體系的熒光恢復(fù)情況，結(jié)果如圖4所示。

圖3 TAMRA標(biāo)記的T-DNA（20 nmol/L）在GO不同濃度下（0、2、3、4、5、6、7、8、9 和 10 μg/mL）的熒光光譜

圖4 加入不同cDNA濃度（20、30、40、50、60、70、80和90 nmol/L）的T-DNA-GO的熒光光譜

分析圖4可知，cDNA濃度的不同會導(dǎo)致熒光恢復(fù)情況有所差異。所加入的cDNA的濃度越高，T-DNA-GO傳感器體系的熒光恢復(fù)越明顯。當(dāng)cDNA的濃度到達(dá)90 nmol/L時，檢測到的熒光值最大，達(dá)到251.05。此時熒光強(qiáng)度恢復(fù)69.2%。

2.3.3 PLL-g-Dex最佳濃度的選擇 為確定PLL-g-Dex在實驗中的最佳濃度，檢測在T-DNA（20nmol/L），GO（9 μg/mL）和 cDNA（90 nmol/L）所構(gòu)成的T-DNA-GO-cDNA體系中分別加入不同濃度（24、48、72、96、120和144 nmol/L）的PLL-g-Dex時體系所顯示出的熒光值。結(jié)果如圖5所示，當(dāng)加入96 nmol/L的PLL-g-Dex時，熒光恢復(fù)度最高，能達(dá)到在PBS緩沖液中僅添加T-DNA時所顯示的熒光強(qiáng)度。而其他的濃度效果均不理想，濃度為24 nmol/L時熒光恢復(fù)度最低，僅恢復(fù)到了275.5。由此，我們選擇在使用濃度為96 nmol/L的PLL-g-Dex。

圖5 T-DNA體系在不同PLL-g-Dex濃度下的熒光光譜

2.4 T-DNA-GO+PLL-g-Dex體系對單堿基錯配的選擇性

檢測T-DNA-GO空白組和在T-DNA-GO中分別加入與之互補(bǔ)的cDNA（90 nmol/L），M1、M2、M3時的熒光恢復(fù)情況，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)加入cDNA時熒光信號恢復(fù)程度最大，達(dá)到60.0%。而加入相同濃度的M1、M2、M3時，熒光強(qiáng)度分別恢復(fù)到47.2%、50.3%和51.6%。

圖6 T-DNA-GO（20 nmol/L）體系在不同條件下的熒光光譜

具體情況如圖7所示，將同等濃度不同類型的堿基突變的目標(biāo)鏈加入到T-DNA-GO體系中，發(fā)現(xiàn)熒光值的提高程度有所不同，可據(jù)此識別雙鏈DNA中的不同類型的堿基錯配。明顯看出，加入cDNA的體系熒光增強(qiáng)強(qiáng)度最大，之后按順序依次為M3、M2、M1，即 C-G＞C-C＞C-A＞C-T。若再把 PLL-g-Dex加進(jìn)T-DNA-GO體系中（已經(jīng)含有不同類型的堿基突變的目標(biāo)鏈時），體系熒光又會出現(xiàn)變化，如圖7-D所示，增強(qiáng)的信號程度由大到小依次為cDNA、M2、M1、M3，即 C-G＞C-A＞C-T＞C-C。其中加入 cDNA、M1、M2的體系熒光強(qiáng)度增加明顯，分別為31.1%、21.2%和24.6%。而含M3的體系只在原本的基礎(chǔ)上多恢復(fù)了3.6%，相比于其他體系恢復(fù)極小。

3 討論

配合氧化石墨烯的生物傳感器體系具有高靈敏、低成本、檢測快速準(zhǔn)確等優(yōu)勢，引起了人們越來越多的研究和關(guān)注。近年來，采用氧化石墨烯進(jìn)行熒光共振能量轉(zhuǎn)移分析以達(dá)到實驗檢測目的的方法種類很多，在檢測DNA、離子、生物分子、病原體或細(xì)胞方面均具有廣闊的應(yīng)用潛能［15-16］。本研究把PLL-g-Dex加入到基于GO特性的熒光分析體系中，并對含有不同錯配堿基的幾種體系呈現(xiàn)出來的熒光進(jìn)行分析，進(jìn)而確定了我們構(gòu)建的檢測體系對T-DNA序列中出現(xiàn)的C-C堿基錯配有較強(qiáng)的選擇性。

首先，在驗證實驗可行性的過程中，當(dāng)GO加入到帶有熒光標(biāo)記的T-DNA中時，我們觀察到熒光被淬滅，這種現(xiàn)象的產(chǎn)生普遍認(rèn)為是由GO的結(jié)構(gòu)特征所致。在這個過程中，T-DNA以π-π非共價鍵形式吸附在GO表面，GO吸收熒光標(biāo)記后又通過熒光共振來傳遞能量以達(dá)到消除熒光的效果［17-21］。之后cDNA的加入使兩條單鏈根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則相互之間發(fā)生雜交，形成了雙鏈DNA。不同于對單鏈DNA的高度吸附作用，GO和在核酸骨架中的雙鏈DNA的相互作用明顯很弱，即便雙鏈DNA上的磷酸基團(tuán)和GO上的含氧活性基團(tuán)可以反應(yīng)，也只是氫鍵的結(jié)合，并不能穩(wěn)定存在于常溫水溶液中，這種較弱的相互作用不足以分開雙鏈，至此雙螺旋結(jié)構(gòu)得以保持，熒光恢復(fù)［22-24］。之后我們選擇加入PLL-g-Dex，PLL-g-Dex是一種能夠穩(wěn)定DNA雙螺旋

圖7 T-DNA-GO+PLL-g-Dex體系對單堿基錯配的選擇性情況示意圖

結(jié)構(gòu)并且可以刺激兩條互補(bǔ)的單鏈DNA之間雜交的功能高分子，因此熒光恢復(fù)率明顯提高［25-26］。也正是由于PLL-g-Dex 和GO特殊的性能使檢測體系的穩(wěn)定性得到提高，再配合低的背景信號，才使所構(gòu)建的整個檢測體系的靈敏度較高。

確定好實驗可行以后，我們檢測了體系的反應(yīng)時間，由于GO優(yōu)異的熒光淬滅能力，熒光值降低很快。隨后加入cDNA使熒光恢復(fù)的過程包含T-DNA從GO上的脫落和生成雙鏈DNA兩個內(nèi)容，所以恢復(fù)熒光耗時比淬滅熒光耗時長。

另外，當(dāng)在T-DNA-GO中分別加入與之互補(bǔ)的cDNA、M1、M2和M3時，我們檢測其熒光值并和T-DNA-GO空白組的熒光值做對照。不同熒光值的出現(xiàn)證明了我們可以用T-DNA-GO體系來檢測存在于雙鏈DNA中的單堿基錯配。

我們又將PLL-g-Dex加入到體系中，發(fā)現(xiàn)對于含完全匹配的cDNA的體系，雜交結(jié)果最好，熒光恢復(fù)增幅最大，說明PLL-g-Dex對其穩(wěn)定性最好。對于含有C-A、C-T錯配的體系，因為錯配影響本身就有部分位置不能恢復(fù)熒光，最終的恢復(fù)幅度較小，說明PLL-g-Dex對兩者也是有穩(wěn)定性的。但含有C-C堿基錯配的體系熒光恢復(fù)增幅和其他有明顯的不同，并無顯著增加，幾乎不能說明PLL-g-Dex對這個體系穩(wěn)定能力的提升有幫助。由此，我們確定了PLL-g-Dex對含有C-C堿基錯配的體系有選擇性。

總之，本實驗以PLL-g-Dex為輔助構(gòu)建的GODNA的熒光生物傳感體系可以快速的檢測出T-DNA中的C-C堿基錯配。這將為關(guān)于梳型陽離子PLL-g-Dex或其他物質(zhì)加入到GO-DNA的熒光生物傳感器中所產(chǎn)生的選擇能力的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了一種以梳型陽離子共聚物PLL-g-Dex輔助的GO-DNA的熒光生物傳感體系。研究表明，在T-DNA濃度為20 nmol/L的情況下，最佳的實驗點是GO濃度為9 μg/mL，cDNA濃度為90 nmol/L，PLL-g-Dex濃度為96 nmol/L。當(dāng)體系中含不同類型單堿基錯配的寡核苷酸時，含有C-C堿基錯配寡核苷酸的體系所呈現(xiàn)出的熒光變化效果與其他幾種有明顯差異，由此來實現(xiàn)對含有C-C堿基錯配鏈的特異性檢測。