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    海鞘真菌的形態(tài)鑒定及其代謝產(chǎn)物抗菌活性研究

    2018-10-26 02:12:34羅國聰黃蘊怡柴慧子雷曉凌聶芳紅
    生物技術(shù)通報 2018年9期
    關(guān)鍵詞:海鞘指示菌青霉

    羅國聰 黃蘊怡 柴慧子 雷曉凌 聶芳紅

    (1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,湛江 524088;2. 暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣州 510632)

    由于海洋高鹽、高壓、低溫、寡營養(yǎng)等特殊生境,使得海洋微生物可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的生物活性物質(zhì),包括抗腫瘤、抗炎癥、抗菌、抗寄生蟲等化合物,海洋微生物已經(jīng)成為新型藥物開發(fā)的重要來源。尤其是海洋動植物共附生微生物,積極地參與動植物的代謝活動,在動植物的抗感染、抗吞噬的生態(tài)防衛(wèi)中起了重要的作用[1]。而就近幾年已報導(dǎo)的數(shù)據(jù)來看,從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)的新活性物質(zhì)中,有60% 以上來自于海洋真菌[2-3]。海鞘是脊索動物、尾索動物亞門、海鞘綱的尾索動物,是海洋污損生物之一,我國目前已記錄的海鞘種類有66 種[4]。近年來,從海鞘中發(fā)現(xiàn)了生物堿、環(huán)肽、神經(jīng)酰胺、萜類、甾體等活性物質(zhì),且含量相對較高,具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌等顯著的生物活性,引起了許多研究人員的高度重視[5],人們開始關(guān)注這些活性的物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu),并對海鞘共附生真菌展開抗菌活性的研究。

    對于真菌來說,其形態(tài)特征是一種重要的分類依據(jù),主要根據(jù)菌落、分生孢子梗、孢子及其發(fā)育時的形態(tài)特征來進行形態(tài)學(xué)鑒定,依據(jù)鑒定結(jié)果進行分類[6]。本研究選擇湛江雷州的海鞘作為研究原料,從中分離純化出海鞘共附生真菌,對菌株進行形態(tài)學(xué)的初步鑒定以及抗菌活性的篩選;篩選出抗菌活性較強且抗菌譜較廣的菌株,結(jié)合對海鞘中真菌多樣性的分析確定優(yōu)選的種屬,旨在為開發(fā)海洋真菌代謝產(chǎn)物的資源以及海洋藥物的研究提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 樣品來源 海鞘樣品于2014年3月采自廣東省雷州市流沙蝦塘。

    1.1.2 抗菌活性試驗指示菌 細菌指示菌:銅綠假單胞菌(Pseudomons aeruginosa),藤黃八疊球菌(Sarcina lutea),金黃色葡萄桿菌(Staphylococcus aureus)。腐敗菌 :假單胞菌屬(Pseudomonassp.),庫特氏菌屬(Kurthia gibsonii strainsp.),金黃桿菌屬(Chryseobacteriumsp.)。

    1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基,淀粉培養(yǎng)基,真菌發(fā)酵培養(yǎng)基[7]用鹽度為3%的人工海水進行配置。營養(yǎng)瓊脂(NA),瓊脂培養(yǎng)基用蒸餾水配置。

    1.1.4 試劑及儀器 乙酸乙酯、甲醇、氯化鈉購自廣州華大化學(xué)試劑有限公司;瓊脂粉、營養(yǎng)瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司);YS100雙目生物顯微鏡(日本尼康公司);722型紫外可見分光光度計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 海鞘共附生真菌的分離[8-9]采用平板涂布法,在無菌環(huán)境下先用無菌水洗去除海鞘表面的泥沙,再分別取海鞘的外殼、內(nèi)臟,用均質(zhì)機均質(zhì)后,放入無菌水中,震蕩混勻,吸取上述勻漿液制成梯度稀釋液。吸取稀釋液到PDA培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基平板上,用涂布棒將其均勻涂布,于28℃培養(yǎng)4-5 d。發(fā)現(xiàn)有新的菌絲或菌落長出后立即轉(zhuǎn)接,分別統(tǒng)計在PDA培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基中分離出來的真菌種類及數(shù)量。

    1.2.2 海鞘共附生真菌的形態(tài)鑒定 菌株采用點植法接種,即用接種針沾取少量孢子點植在平板上中心,于28℃培養(yǎng)3-5 d,每隔1 d觀察其菌落表面大小、質(zhì)地、高度、顏色等菌落特征,借助顯微鏡觀察菌株的個體形態(tài),包括是否產(chǎn)孢、孢子等的大小、規(guī)則及顏色等,結(jié)合真菌鑒定手冊等對菌株進行形態(tài)鑒定[10-14]。

    1.2.3 海鞘共附生真菌抗菌活性的篩選 (1)海鞘共附生真菌發(fā)酵液粗提物的制備:按40%的裝液量在500 mL錐形瓶中加入真菌發(fā)酵培養(yǎng)液,挑取三環(huán)菌種接種到培養(yǎng)液中,28℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)7 d后,經(jīng)過真空抽濾得發(fā)酵液與干菌體。取200 mL發(fā)酵液用乙酸乙酯等體積萃取3 次,合并萃取液,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮,蒸干萃取液中的有機溶劑,用甲醇清洗旋蒸瓶,將提取物溶解于10mL的甲醇中,即為乙酸乙酯粗提液供試樣品。(2)指示菌菌懸液的制備:將保存的指示菌接種到營養(yǎng)瓊脂斜面37℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)3次后,用接種環(huán)刮取適量的菌體于生理鹽水中,振蕩1 min直至菌體均勻分布,測量OD值,并根據(jù)OD值將指示菌濃度調(diào)整至細菌數(shù)約為106CFU/mL。

    1.2.4 海鞘共附生真菌抑菌活性測定 采用雙層平板法[15],首先在無菌平板上鋪一層素瓊脂,放置無菌牛津杯,然后采用稀釋倒平板法制備含菌平板,待平板凝固后將牛津杯取出,分別將乙酸乙酯粗提液供試樣品150 μL加入到牛津杯中。每組實驗重復(fù)3次,并設(shè)陰性對照(不加粗提物)。將加好粗體液的含菌平板置于冰箱中擴散3 h后放置于37℃恒溫培養(yǎng)。24 h后觀察抑菌圈的透明程度和邊緣整齊程度,測量并記錄抑菌圈直徑。

    2 結(jié)果

    2.1 海鞘共附生真菌的分離純化

    經(jīng)分離純化排重后,從海鞘中共分離出14株菌,其中12株分離自PDA培養(yǎng)基,2株分離自淀粉培養(yǎng)基,分別占總菌株分離率的85.7%、14.3%。這說明PDA培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分比淀粉培養(yǎng)基更適合于海鞘共附生真菌的生長繁殖。

    2.2 海鞘共附生真菌的形態(tài)鑒定

    從海鞘中所分離的14株菌株的菌落形態(tài)、個體形態(tài)菌落見圖1,個體形態(tài)的特征描述見表1。根據(jù)真菌鑒定手冊對其進行形態(tài)學(xué)的初步鑒定,以上的鑒定結(jié)果顯示,所分離出的14 株真菌分屬4 個屬,分別為青霉屬、曲霉屬、枝孢屬和麥軸梗霉屬。以青霉屬和曲霉屬居多,其中青霉屬為第一優(yōu)勢種群,青霉屬的菌株占總分離出的菌株的比例為64.3%,曲霉屬為第二優(yōu)勢種群,占總分離出的菌株21.4%。說明從海鞘中分離出的真菌以青霉屬和曲霉屬為主。另外,麥軸梗霉屬在海洋真菌中的報道出現(xiàn)較少,說明海鞘真菌中多樣性較豐富。

    圖1 14株海鞘真菌形態(tài)鑒定

    2.3 海鞘共附生真菌抗菌活性篩選

    海鞘共附生真菌乙酸乙酯粗提物抗菌活性,如表2和圖2所示。從表2中可以看出,在這14 株真菌中,至少有11 個菌株對一種以上的指示菌有一定的抗菌活性。其中有4 株真菌對6 種指示菌都有抗菌活性,分別為Asc-2-4、Asc-2-12、Asc-1-1和Asc-2-1,這4株菌的抗菌活性較強且抗菌譜較廣。比較這4株菌的抑菌能力發(fā)現(xiàn),菌株Asc-2-12的乙酸乙酯粗提物的平均抑菌圈直徑最大,均大于21.00 mm,其對銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑最大達到21.91 mm,對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑最大達到21.37 mm,對SL1 的抑菌圈直徑最大達到23.13 mm,對SL2 的抑菌圈直徑最大達到23.94 mm。

    3 討論

    海鞘獨特的攝食習(xí)性使其富集大量的共附生微生物[16],而海洋真菌能夠耐受海洋中的特殊生境如高鹽、高壓、低氧、低光照等,形成能夠產(chǎn)生獨特次級代謝產(chǎn)物的生理特性[17]。本研究以海鞘為原料,從中分離純化出海鞘共附生真菌并以其為研究對象,對其進行形態(tài)學(xué)的鑒定和抑菌活性研究,共分離鑒定出14株菌株,分屬4個屬,其中青霉屬9株、占64.3%,屬于優(yōu)勢菌屬。目前,國內(nèi)已經(jīng)有對海鞘共附生細菌的研究報道[18],然而關(guān)于海鞘共附生真菌代謝產(chǎn)物抗菌活性的研究報道還比較少[19]。

    通過測試14株菌菌絲體乙酸乙酯的粗提取物的抗菌活性,以銅綠假單胞菌、黃八疊球菌、金黃色葡萄桿菌、假單胞菌屬、庫特氏菌屬、金黃桿菌屬為指示菌,其中有4株真菌對這6種指示菌都有抑菌活性,分別是Asc-2-4、Asc-2-12、Asc-1-1和Asc-2-1,在這抗菌活性較強的4株真菌,Asc-2-1屬于曲霉屬,其余3株屬于青霉屬。并且青霉屬菌株Asc-2-12 的抑菌活性最明顯,對銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑最大達到21.91 mm。珊瑚和海綿共附生真菌的研究發(fā)現(xiàn),分離得到的部分青霉和曲霉菌表現(xiàn)出對細菌的廣譜抑菌活性[20]。因此有必要對以上4株海洋真菌的活性代謝產(chǎn)物進行深入研究。海洋微生物天然產(chǎn)物正在成為創(chuàng)新藥物的一個重要來源,而海洋真菌作為海洋微生物的一個重要類群,具有研究和開發(fā)的巨大潛力[21]。

    表1 14株海鞘共附生真菌的形態(tài)鑒定

    表2 海鞘共附生真菌乙酸乙酯粗提物抗菌活性的篩選

    圖2 海鞘部分真菌發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物抗菌活性

    4 結(jié)論

    從海鞘中純化出14 株真菌,經(jīng)初步鑒定14 株真菌分屬于青霉屬、曲霉屬、枝孢屬和麥軸梗霉屬等4 個屬,其中青霉屬9株,曲霉屬3株,枝孢屬和麥軸梗霉屬各1株。最后對分離純化出的14 株海鞘真菌的乙酸乙酯粗提物進行抗菌活性篩選,發(fā)現(xiàn)14 株菌中有11 株菌對一種以上的細菌指示菌有抗菌活性,其中有4 株菌的抗菌活性較強且抗菌譜較廣,編號分別為Asc-2-4、Asc-2-12、Asc-1-1和Asc-2-1,菌株Asc-2-12 的抑菌活性最明顯,對銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑最大達到21.91 mm。綜上表明,海鞘共附生真菌存在良好的應(yīng)用開發(fā)潛力,可作為發(fā)現(xiàn)新穎抗菌活性物質(zhì)的潛在資源。

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