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    塔里木盆地5個(gè)生態(tài)小區(qū)稀有放線菌分離及合成抗生素基因分布

    2018-10-26 02:12:32朱榮貴關(guān)統(tǒng)偉姜秀娟
    生物技術(shù)通報(bào) 2018年9期
    關(guān)鍵詞:放線菌菌種病原菌

    朱榮貴 關(guān)統(tǒng)偉 姜秀娟

    (1. 四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院,自貢 643000;2. 西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,成都 610039)

    隨著人類社會(huì)的發(fā)展,新型人類疾病不斷出現(xiàn)、病原微生物對(duì)臨床藥物耐藥性不斷增加以及動(dòng)植物病害嚴(yán)重發(fā)生等問題日益嚴(yán)重,促使人們呼喚新結(jié)構(gòu)新活性抗生素的發(fā)現(xiàn),目前,新抗生素中50%-78%由放線菌產(chǎn)生[1-2]。稀有放線菌是一類出現(xiàn)頻率比鏈霉菌低得多的放線菌類群,有著產(chǎn)生新的天然活性物質(zhì)的極大潛力[3-4],其研究一直備受關(guān)注[5]。

    塔里木盆地是我國(guó)最大內(nèi)陸盆地,氣候極端干旱,植被稀少,土壤荒漠化和鹽堿化嚴(yán)重,環(huán)境較為特殊,可能存在獨(dú)特的稀有放線菌[6-7]。微生物的數(shù)量和組成與其生存環(huán)境(水、熱、pH、植被、土壤等生態(tài)條件)密切相關(guān)[8-9],為了給研究者有目標(biāo)的分離獲得該地區(qū)稀有放線菌資源提供參考,本研究根據(jù)倪健等[10]對(duì)塔里木盆地生態(tài)小區(qū)的劃分,選擇5個(gè)代表性生態(tài)小區(qū),使用選擇性培養(yǎng)基分離稀有放線菌,分析不同生態(tài)小區(qū)稀有放線菌分布情況。

    為提高產(chǎn)活性物質(zhì)潛力菌的篩選效率,本項(xiàng)目組還對(duì)抗生素合成相關(guān)基因進(jìn)行了篩選,主要包括I型PKS、II型PKS、NRPS、APH和HMG-CoA。它們是相應(yīng)抗生素類代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的關(guān)鍵催化物,其中聚酮合酶(Polyketide synthase,PKS)能夠催化小分子羧酸類物質(zhì)合成具有重要藥用價(jià)值的次級(jí)代謝產(chǎn)物——聚酮類化合物。放線菌主要含有I型PKS和II型PKS,I型PKS催化合成的抗生素主要包括大環(huán)內(nèi)脂類、聚醚類、多烯類和安莎類;II型PKS催化合成的抗生素主要包括蒽環(huán)類和四環(huán)類。非核糖體多肽合成酶(Nonribosomal Peptide -synthetase,NRPS)是一些重要多肽類抗生素的合成系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的酶,能識(shí)別特定的氨基酸并將其直接相連形成多肽鏈。氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(Aminoglycoside Phosphotransferases,APH)與氨基糖苷類抗生素合成密切相關(guān)[11],氨基糖苷類抗生素主要包括鏈霉素、新霉素等。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A,HMG-CoA)還原酶與類異戊二烯的生物合成密切相關(guān),后者有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值[12]。這些基因是篩選生產(chǎn)相應(yīng)抗生素放線菌的重要依據(jù)。本研究根據(jù)基因篩選評(píng)估稀有放線菌的抗生素類活性物質(zhì)的產(chǎn)生潛力,旨在為進(jìn)一步開發(fā)利用稀有放線菌提供菌種基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗(yàn)選擇塔里木盆地具代表性的5個(gè)生態(tài)小區(qū),根據(jù)各小區(qū)的面積,每小區(qū)選擇2-4個(gè)點(diǎn)進(jìn)行采樣,采樣取土下5-20 cm深度的土壤,裝入滅菌袋,編號(hào)注明采集信息,4℃低溫保藏帶回實(shí)驗(yàn)室后,將各小區(qū)樣品以四分法均勻混合并檢測(cè)理化性質(zhì),以5份混合土樣為材料進(jìn)行分離。各樣品理化性質(zhì)見表1。

    表1 塔里木盆地5個(gè)生態(tài)小區(qū)混合土樣理化特性

    1.2 方法

    1.2.1 稀有放線菌分離 (1)預(yù)處理。干熱處理:土樣風(fēng)干,研磨過篩,120℃干熱處理1 h,稱取1g樣品到10 mL的無(wú)菌水中,120 r/min振蕩10 min。苯酚處理:取1 g樣品加入到1.5% 苯酚的無(wú)菌水中,30℃水浴30 min。SDS處理:稱取1 g土樣,用0.05%的SDS(5 mmol/l磷酸鹽緩沖液配制),加入6%的酵母膏,40℃下 200 r/min 振蕩 20 min[13]。

    (2)分離培養(yǎng):采用稀釋法涂板分離,使用改良HV培養(yǎng)基;ATCC172培養(yǎng)基[14];海藻糖-脯氨酸培養(yǎng)基;改良脯氨酸培養(yǎng)基;改良高氏二號(hào)培養(yǎng)基[15];葡萄糖-天門冬酰氨培養(yǎng)基[16]和YIM-3培養(yǎng)基[17]等7種培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)合篩選。培養(yǎng)基加入終濃度為60 μg/mL的重鉻酸鉀、50 μg/mL的放線菌酮和25 μg/mL的制霉菌素來抑制細(xì)菌和霉菌的生長(zhǎng)。以預(yù)處理和培養(yǎng)基為因素,設(shè)置21個(gè)處理進(jìn)行分離,28℃培養(yǎng) 2 周[18]。

    (3)純化:根據(jù)菌落形態(tài)挑菌純化,純化培養(yǎng)基為ISP4培養(yǎng)基。ISP 4培養(yǎng)基:淀粉10 g,(NH4)2SO44g,CaCO32 g,MgSO42 g,K2HPO42 g,瓊脂16-18 g,水1 000 mL,pH調(diào)至7.0-7.5。

    1.2.2 菌種鑒定 采用16S rRNA基因序列分析方法鑒定菌種。以酶小量法提取待測(cè)菌株基因組DNA[16],利用通用引物(正向 PA :5′-CAGA GTTTGATCCTGGCT-3′和反向 PB :5′-AGGAGGTGA TCCAGCCGCA -3′)進(jìn)行16S rDNA基因的擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。獲得的16S rRNA基因序列在NCBI上采用Blast Search法進(jìn)行相似性檢索,從GenBank和EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)中搜集到相關(guān)放線菌的16S rRNA基因序列進(jìn)行比較鑒定。最后使用顯微鏡觀察形態(tài)特征并與分子鑒定結(jié)果比照進(jìn)行綜合鑒定。

    1.2.3 生態(tài)分布及多樣性分析 分析各生態(tài)小區(qū)菌種分布及多樣性,計(jì)算不同小區(qū)的物種均勻度(Evenness)、豐富度(Shannon)和多樣性(Simpson)指數(shù),其中Simpson指數(shù)用如下公式計(jì)算:

    其中,N為個(gè)體總數(shù),S屬數(shù),Ni為i屬的個(gè)體數(shù)。

    1.2.4 抗生素合成相關(guān)基因擴(kuò)增 采用5對(duì)引物擴(kuò)增菌株的功能基因。引物K1F(5′-TSAAGTCSAACA TCGGBCA-3′) 和 M6R(5′-CGCAGGTTSCSGTAC CAGTA-3′)用來擴(kuò)增 PKS-I基因[19],引物 KSa(5′-TSGRCTACRTCAACGGSCAC GG-3′)和 KSβ(5′-TACSAGTCSWTCGCCTG GTTC-3′)用來擴(kuò)增 PKS-II基因[20],引物 A3F(5′-GCSTACSYS ATSTACACSTCSGG-3′) 和 A7R(5′-SASGTCVCCSGTSCGG TAS-3′)用來擴(kuò)增NRPS基因,引物STR-F(5′-CGGCTGCTCGACCACGAC-3′) 和 STR-R(5′-GTCCTCGATGTCCCACAG-3′)用來擴(kuò)增 APH 基因[21],引物 HMGF(5′-GGGCATCGCCGCGACCCTCGTCGACGAGCG-3′)和 HMGR(5′-GCGATGACGGCG AGGC GGCGGGCGTTCTC-3′)用來擴(kuò)增 HMG-CoA 基因[12]。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè),目的條帶進(jìn)行割膠回收純化,克隆測(cè)序,通過Blast比對(duì)進(jìn)行驗(yàn)證。

    1.2.5 拮抗活性初篩 采用抑菌圈法檢測(cè)分離到的放線菌對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,菌種編號(hào)ATCC 25923)、大腸桿菌(Escherichia coli,菌種編號(hào)ATCC 25922)的拮抗活性(本部分實(shí)驗(yàn)病原菌均購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)菌種保存中心)。使用血球計(jì)數(shù)板將病原菌調(diào)制成108個(gè)/ mL濃度的菌懸液,將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌菌懸液取100 μL涂布到LB培養(yǎng)基上,再在平板上接種放線菌的菌餅(瓊脂塊直徑0.6 cm)。LB培養(yǎng)平板37℃培養(yǎng)24-48 h。采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法檢測(cè)分離菌對(duì)給新疆主要經(jīng)濟(jì)作物造成危害的棉花枯萎病原菌(Fusarium oxysperiumsp.Vasinfectum,菌種編號(hào)ACCC 31038)、棉花黃萎病原菌(Verticillium dahliae,菌種編號(hào)ACCC 36211)和辣椒疫霉病原菌(Phytophthoracapsici,菌種編號(hào)ACCC 36278)的拮抗活性,將棉花枯、黃萎病原菌和辣椒疫霉病原菌菌懸液取100 μL涂布到PDA培養(yǎng)基上,接種放線菌(懸液濃度及方法同上)PDA培養(yǎng)平板28℃培養(yǎng)5 d。測(cè)量以上兩組實(shí)驗(yàn)的抑菌圈直徑(病原菌的菌落/絲與放線菌之間形成的隔離帶外圈的直徑),每個(gè)菌種做3組重復(fù),取3組重復(fù)平均值,判斷放線菌對(duì)病原菌的拮抗活性。

    2 結(jié)果

    2.1 生態(tài)小區(qū)稀有放線菌分布分析

    2.1.1 生態(tài)小區(qū)稀有放線菌組成狀況 對(duì)分離到的放線菌菌株先觀察其菌落形態(tài)特征,選擇形態(tài)差異明顯的稀有放線菌菌株,并在ISP 4培養(yǎng)基上插片培養(yǎng)1周,取片進(jìn)行顯微觀測(cè),記錄其菌體、基絲形態(tài),比照《放線菌的分類和鑒定》(閻遜初,1992),并結(jié)合16S rRNA基因序列在Blast上的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行菌屬鑒定。結(jié)果(表2)顯示分離得18株稀有放線菌,屬于放線菌的10個(gè)屬。

    不同生態(tài)小區(qū)稀有放線菌分布種類由多到少依次為:塔里木河河岸林生態(tài)小區(qū)(I-5-j)10株,分別屬于8屬;塔克拉瑪干沙漠和田河西部生態(tài)小區(qū)(I-5-b)9株,分別屬于8屬;塔里木北部壤質(zhì)荒漠生態(tài)小區(qū)(I-5-a)8株,分別屬于8個(gè)屬;塔克拉瑪干沙漠中部生態(tài)小區(qū)(I-5-c)7株,分別屬于7屬;塔克拉瑪干沙漠塔里木河?xùn)|部生態(tài)小區(qū)(I-5-d)4株,分別屬于4個(gè)屬。

    從稀有放線菌在生態(tài)小區(qū)的分布情況看,三項(xiàng)指數(shù)豐富度、均勻度、多樣性均為壤質(zhì)土壤小區(qū)較高(表3),反映出壤質(zhì)土壤較為適宜微生物生長(zhǎng),其種類也很豐富。此外,從總體上看,不同植被土樣放線菌分布,以耕作土多樣性較為豐富,這一點(diǎn)與其它研究者結(jié)論基本相符,原因可能為耕作土水分充足、施肥較多、熟化程度高,利于稀有放線菌繁衍。

    2.1.2 多樣性分析 依據(jù)每個(gè)生態(tài)小區(qū)稀有放線菌組成、菌數(shù)(CFU計(jì),數(shù)據(jù)未列出),計(jì)算不同小區(qū)的物種均勻度(Evenness)、豐富度(Shannon)和多樣性(Simpson)指數(shù)。結(jié)果(表3)顯示豐富度指數(shù)以塔里木北部壤質(zhì)荒漠生態(tài)小區(qū)最大,為2.382 1,該小區(qū)物種所涵蓋屬的數(shù)目最多(屬數(shù)相同情況下,各屬的個(gè)體數(shù)目分配均勻性最高小區(qū)多樣性指數(shù)最高);物種均勻度指數(shù)以塔克拉瑪干沙漠塔里木河?xùn)|部生態(tài)小區(qū)最大,為0.871 8,說明該小區(qū)各個(gè)菌種的個(gè)體數(shù)目分配均勻性最高;Simpson指數(shù)是綜合均勻度和豐富度的一項(xiàng)多樣性指數(shù),以塔里木北部壤質(zhì)荒漠生態(tài)小區(qū)最大,為0.779 9,該小區(qū)的稀有放線菌屬數(shù)多且各屬的種數(shù)較為均勻,多樣性最好。

    2.2 抗生素合成相關(guān)基因及菌株的拮抗效果檢測(cè)

    利用5對(duì)引物通過PCR擴(kuò)增菌株抗生素合成相關(guān)基因,測(cè)得序列通過Blast比對(duì)進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證序列與相關(guān)功能基因相符為“陽(yáng)性(+)”,不符為“陰性(-)”。對(duì)分離菌對(duì)病原菌的對(duì)峙培養(yǎng)平板進(jìn)行檢測(cè),抑菌圈直徑<0.2 cm為無(wú)拮抗性(陰性“-”),0.2 cm≤抑菌圈直徑≤0.4 cm為弱拮抗性(陽(yáng)性“+”),抑菌圈直徑>0.4 cm為強(qiáng)拮抗性(++)、對(duì)分離菌的5種功能基因的分布及拮抗檢測(cè)結(jié)果見表4。

    表2 不同生態(tài)小區(qū)土樣放線菌組成

    18株稀有放線菌中,有14株菌含有1種以上的功能基因,其中的9株菌含有I型PKS基因,4株菌含有II型PKS基因,3株菌含有NRPS基因,4株菌含有APH基因,沒有檢測(cè)到HMG-COA基因。有一株鏈孢囊菌含有4種功能基因,有合成多種抗生素的潛力。I型PKS在稀有放線菌中的分布較為普遍,在這18株菌能占到有50%的比例,有產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯類和聚醚類等抗生素的潛力。HMG-COA基因在這18株菌中沒有檢測(cè)到,可能不具有產(chǎn)生異戊二烯化合物的潛力,通過檢測(cè),可以為有針對(duì)性的篩選產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物稀有放線菌提供指導(dǎo)。

    表3 不同生態(tài)小區(qū)物種的多樣性

    觀察放線菌的拮抗效果[22]。菌株47017、47029、47035和47037對(duì)金黃色葡萄球菌有強(qiáng)的拮抗活性,菌株47004和47011對(duì)金黃色葡萄球菌有弱拮抗活性。18株菌對(duì)大腸桿菌沒有拮抗活性。菌株47017對(duì)棉花黃萎病原菌有拮抗活性,菌株47029對(duì)棉花枯萎病原菌和棉花黃萎病原菌都有拮抗活性,其它菌株沒有拮抗3種植物病原真菌的活性。以含APH基因的47029菌株拮抗種類最多,表現(xiàn)出了廣譜抗菌活性。有4株含有PKSⅠ型基因的菌對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出拮抗性,菌株所含基因種類與其對(duì)病原菌拮抗性效果見表4。

    表4 五種功能基因在18株稀有放線菌中的分布及菌株的拮抗效果檢測(cè)

    3 討論

    從分離結(jié)果來看,幾個(gè)樣點(diǎn)的稀有放線菌種類較多。一些產(chǎn)生物活性物質(zhì)的重要菌源,如小單孢菌、馬杜拉放線菌、諾卡氏菌等都能分離到。但從分離的角度講,由于本研究采樣點(diǎn)集中于塔里木河沿線地區(qū)及塔中地區(qū),涉及生態(tài)區(qū)域僅占整個(gè)盆地1/3左右(共計(jì)13個(gè)生態(tài)小區(qū))。加之實(shí)驗(yàn)雖選用了一些分離效率比較高的培養(yǎng)基,但實(shí)際上很多稀有放線菌培養(yǎng)條件特殊[23]。因此,本實(shí)驗(yàn)可能無(wú)法分離到一些特殊的微生物。研究者仍需要不斷拓展分離源和創(chuàng)新分離手段來開發(fā)這些資源。

    本次分離菌株含有較為豐富PKS、NRPS及APH基因,基因分布以PKS I型最多,未檢出HMGCoA還原酶基因。PKS I型基因陽(yáng)性率為50%,II型PKS為22.2%,NRPS為16.7%,APH為22.2%。除PKS I型基因外,其它基因檢出率與已報(bào)道鏈霉菌的檢出率相當(dāng)[24]。有的菌株同時(shí)含有多種功能基因(如鏈孢囊菌),因而可能產(chǎn)生不同的抗菌或細(xì)胞毒活性物質(zhì),從這一層面講,本研究所分離的放線菌菌群具有更為復(fù)雜的多樣性。此外,兩株親緣關(guān)系極近的菌株47010、47037,含有不同的抗生素合成基因,這也說明,菌株的產(chǎn)活性物質(zhì)能力具有菌株特異性而非菌種特異性,通過分子檢測(cè)的手段可以忽略菌株之間的相似性而快速的分析菌株的產(chǎn)抗?jié)摿ΑR虼?,分子檢測(cè)不僅能檢驗(yàn)菌株的產(chǎn)抗?jié)摿Γ彩峭晃锓N不同菌株間進(jìn)行細(xì)致分類的研究方法之一。

    本研究基因和活性之間的關(guān)系不能一一對(duì)應(yīng),如菌株47035雖然沒有抗生素合成基因,但具有拮抗金黃色葡萄球菌的活性??赡茉颍阂皇牵@些菌株產(chǎn)生其他種類的抗生素,而我們檢測(cè)的基因有限,出現(xiàn)“漏”篩。二是,PKS、NRPS等基因本身存在多樣性,同一種基因的表達(dá)也可能在結(jié)構(gòu)和活性上有差別。

    此外,18株放線菌中有14株具有抗生素合成相關(guān)基因,但只有6株具有拮抗病原菌的活性,其可能原因:一是所選取靶標(biāo)種類較少,放線菌產(chǎn)生的抗生素對(duì)上述5種靶標(biāo)菌不具有拮抗性(但可能對(duì)其它靶標(biāo)菌具有作用),需要增加靶標(biāo)菌檢測(cè);二是野生型的菌株可能只產(chǎn)生痕量的次級(jí)代謝產(chǎn)物,或者合成基因沉默表達(dá),從而對(duì)靶標(biāo)菌不能表現(xiàn)出拮抗性;三是檢測(cè)培養(yǎng)基不合適。對(duì)于這些菌株,筆者認(rèn)為不能簡(jiǎn)單定義為“無(wú)用菌株”。因?yàn)樗鼈兺写渭?jí)代謝產(chǎn)物的合成基因簇。通過激活其次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因的表達(dá),如摸索培養(yǎng)、發(fā)酵條件,找出抗生素合成基因表達(dá)的調(diào)控因素,或者通過基因操作如核糖體工程[25]等手段,激活潛在“有用”次級(jí)代謝產(chǎn)物相關(guān)基因表達(dá),甚至通過誘變,使菌株突變產(chǎn)生新的化合物,都可能使其功能基因發(fā)揮作用。這也是分子手段篩選產(chǎn)抗生素菌的一項(xiàng)優(yōu)勢(shì)所在,不僅提高了篩選效率,也能充分挖掘潛在的有用菌源。

    4 結(jié)論

    本實(shí)驗(yàn)從塔里木盆地5個(gè)生態(tài)小區(qū)土樣中分離稀有放線菌,經(jīng)16S rRNA序列及形態(tài)分析,鑒定分離得18種菌株,其中塔里木北部壤質(zhì)荒漠生態(tài)小區(qū)菌種豐富度指數(shù)最大,為2.3821。通過擴(kuò)增分離菌株產(chǎn)抗生素相關(guān)基因I型PKS、II型PKS、NRPS、APH及HMG-CoA,并進(jìn)行電泳分析,有14株菌含有抗生素合成相關(guān)基因,其中4株含有多種基因。檢測(cè)分離菌株對(duì)5種主要?jiǎng)又参锊≡目咕钚?,?株具有拮抗活性。其中2株具有廣譜抗菌活性。本研究基因和活性之間關(guān)系并非一一對(duì)應(yīng)。

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