miR-17在非小細胞肺癌放射抗拒細胞中的表達及作用研究

李萬禎 殷 俊 李 萍 林曉輝 張國前 張書旭

據(jù)最新的癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，肺癌的發(fā)病率在中國排在首位，在美國排在第二位，而死亡率在兩國均排在首位[1-2]。放療作為晚期肺癌的主要治療方式，然而只有10%患者能達到完全緩解，5年生存率不到15%[3]，其中放射抗拒則是限制放療療效的關鍵因素[4]。因此，建立耐放射腫瘤細胞株，是研究放射抗拒機制的第一步。在X線下連續(xù)照射建立腫瘤放射抗拒細胞系，在乳腺癌[5]、喉癌[6]和鼻咽癌[7]等癌種已取得成功。目前肺癌放射抗拒的機制尚未明確，有幾種分子機制被認為與其放射抗拒的形成有關，如DNA修復蛋白的改變、存活蛋白的失調(diào)、表皮生長因子受體(EGFR)的激活等[8]。microRNA(miRNA)是一類長度約為18～24個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，參與調(diào)控細胞分化、生長、凋亡等功能[9]。miR-17-92基因簇位于人染色體13q31.3處，包括miR-17等6個成熟的miRNA，近年來被指通過調(diào)控幾十種靶基因參與腫瘤的形成、轉移和復發(fā)[10]。Jiang等[11]發(fā)現(xiàn)過表達miR-17-92水平明顯提高了套細胞淋巴瘤Z138c細胞的放射抗拒性。但miR-17在肺癌放射抗拒機制的研究中鮮有報道。因此，本研究探索miR-17在肺癌放射抗拒中的作用，以期能成為非小細胞肺癌放射抗拒診治的突破口。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

直線加速器購自瑞典醫(yī)科達公司Synergy；胎牛血清和培養(yǎng)基購自Gibco公司；CCK-8試劑盒購于日本同仁化學研究所；細胞周期試劑盒購于聯(lián)科生物公司；RT-PCR試劑盒和細胞凋亡檢測試劑盒購于美國Genecopoeia公司；miR-17引物和內(nèi)參U6購自上海吉瑪公司；Trizol試劑和Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Introvigen公司；miR-17 mimic/NC和miR-17 inhibitor/NC購自廣州銳博生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 肺腺癌細胞系H1975由廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院研究所保存。將在液氮中凍存的H1975細胞復蘇，加入適量含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基。當細胞密度達到80%以上時進行胰酶消化和傳代。

1.2.2 建立放射抗拒細胞系 取指數(shù)生長期H1975肺癌細胞，在直線加速器6 MV X線下垂直野照射，源皮距(SSD)100 cm，照射野為10 cm×10 cm，劑量率600 cGy/min，單次照射劑量為2 Gy，立即放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至80%以上，將適量細胞傳代接種至新的培養(yǎng)瓶(剩余細胞凍存?zhèn)溆?，待細胞再次進入指數(shù)生長期時，重復以上過程，依次按照2 Gy、4 Gy、6 Gy和8 Gy各3次進行照射，累積劑量為60 Gy。照射完成后的細胞常規(guī)傳代10代，篩選得到放射抗拒細胞系，命名為H1975R，總耗時約為7個月。

1.2.3 細胞克隆形成實驗檢測放射敏感性 取指數(shù)生長期的H1975和H1975R細胞消化，計數(shù)，逐級稀釋，根據(jù)照射劑量不同，在6孔板內(nèi)接種不同數(shù)目細胞。待細胞貼壁12 h后，分別接受0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy和8 Gy X線照射，照射后放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期換液。直至照射后14天，甲醇固定，結晶紫染色，干燥后肉眼直接計克隆數(shù)或顯微鏡下計數(shù)≥50個細胞的集落數(shù)。計算集落形成率(Plating efficiency，PE)=集落數(shù)/接種細胞數(shù)，以接受0 Gy組PE作為對照組，計算各劑量組的細胞存活分數(shù)(Survival fraction，SF)，SF=劑量照射組PE/對照組PE×100%。應用Graphpad Prism 5.0版軟件，以多靶單擊模型擬合細胞存活曲線，公式為SF=1-(1-e-kD)N，D0=1/K，logN=Dq/D0，計算H1975和H1975R細胞的放射生物學參數(shù)平均致死劑量(D0)、準閾劑量(Dq)、2 Gy照射后細胞存活分數(shù)(SF2)和外推數(shù)(N)。

1.2.4 RT-PCR檢測miR-17表達 Trizol法提取待檢測細胞總RNA，按照GeneCopoeia All-in-OneTMmiRNA PCR Kit說明書進行逆轉錄反應和實時PCR檢測細胞miR-17的表達水平，以U6作為內(nèi)參。逆轉錄反應條件為37℃孵育60 min，85℃溫育5 min終止反應。PCR反應條件為95℃10 min預變性，95℃10 s變性，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，共40個循環(huán)。檢測完成后，計算機系統(tǒng)自動分析各樣本Ct值，采用2-△△Ct計算基因的相對表達量。

1.2.5 細胞轉染 取指數(shù)生長期的H1975和H1975R細胞消化，接種適量細胞于6孔板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度達至80%即可用于轉染。利用Lipofectamine 2000轉染試劑將miR-17 inhibitor和NC轉染至H1975R細胞中，將miR-17 mimic和NC轉染到H1975細胞中(根據(jù)RT-PCR結果顯示H1975R中miR-17表達量高于H1975)，轉染后6 h換液，轉染24～48 h后，收集細胞用于后續(xù)實驗。RT-PCR檢測轉染后細胞的miR-17表達和克隆形成實驗檢測轉染后細胞放射敏感性，方法同前。

1.2.6 細胞增殖實驗 取轉染后24 h的細胞消化，計數(shù)，在96孔板中每孔接種200 μL細胞懸基(4 000個細胞)，設3個副孔，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞貼壁后0 h、24 h、48 h、72 h、76 h和120 h時，將細胞從培養(yǎng)箱內(nèi)取出，棄去培養(yǎng)基，加入100 μL新培養(yǎng)基和10 μL CCK-8溶液，放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2 h，應用酶標儀，設定波長為450 nm，測定各孔吸光度(OD450)值。以0 h的OD值作為對照組，其他各時間點為實驗組，按照以下公式計算各時間點的細胞增殖率：增殖率(%)=實驗組OD450/對照組OD450。

1.2.7 細胞凋亡檢測 收集轉染后48 h的細胞，用4℃預冷的PBS洗滌2次，離心棄上清，用1×Annexin-binding buffer重懸細胞，取100 μL細胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL FITC Annexin V和1 μL PI，輕輕混勻。在室溫和避光的條件下反應15 min，再加入400 μL 1×Annexin-binding buffer，輕輕混勻，冰上放置。在1 h內(nèi)通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.8 細胞周期測定 收集轉染后48 h的細胞，用4℃預冷PBS洗滌1次，離心棄上清。加入1 mL DNA Staining solution和10 μL Permeabilization solution，渦旋振蕩5～10秒充分混勻。室溫避光孵育30 min后，通過流式細胞儀進行檢測，分別讀出G0/G1、S和G2/M期細胞的百分比。最終用Flowjo軟件對細胞凋亡和細胞周期數(shù)據(jù)進行分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 細胞克隆形成實驗檢測放射敏感性

在不同的照射劑量下，H1975R細胞的克隆集落數(shù)均多于H1975(圖1A)。從細胞存活曲線可知，隨著照射劑量增大，細胞存活分數(shù)出現(xiàn)明顯下降，但H1975細胞下降的幅度更大。由多靶單擊模型得到各項放射生物學參數(shù)，H1975R的SF2為H1975的1.62倍(t=8.00，P<0.01)，H1975R的D0為H1975的1.20倍(t=5.13，P<0.01)，H1975R的Dq為H1975的2.56倍(t=5.87，P<0.01)。由此可知，H1975R比H1975細胞的放射抗拒性更強(圖1B)。

圖1 H1975和H1975R細胞克隆形成結果Figure 1 The colony formation in H1975 and H1975R cellsNote：A.A representative image of colony formation in H1975 and H1975R cells exposed to or not exposed to different doses of IR after 14 days；B.Survival fractions of H1975 and H1975R cells were obtained from the results of the colony-forming assay.

2.2 RT-PCR檢測miR-17表達情況

H1975R的miR-17表達量是H1975細胞的2.68倍(t=12.86，P<0.01)。H1975細胞轉染miR-17 mimic后，其miR-17的表達水平是陰性對照組的47.3倍(t=6.07，P<0.01)；H1975R細胞轉染miR-17 inhibitor后，其miR-17表達水平是陰性對照組的0.37倍(t=9.15，P<0.01)(圖2)。

2.3 轉染后細胞克隆形成實驗

根據(jù)克隆形成實驗通過多靶單擊數(shù)學模型擬合細胞存活曲線，H1975 miR-17 mimic組的D0、Dq和SF2分別是陰性對照組的1.09倍、1.96倍和1.47倍，而H1975 miR-17 inhibitor組的D0、Dq和SF2分別是陰性對照組的0.85倍、0.64倍和0.75倍，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這表明了上調(diào)miR-17提高了H1975的放射抗性，下調(diào)miR-17則可提高H1975R的放射敏感性(圖3)。

2.4 轉染后細胞增殖能力

轉染后細胞的增殖規(guī)律與陰性對照組大致相同。采用重復測量設計的方差分析，H1975轉染miR-17 mimic后，即上調(diào)H1975細胞中的miR-17表達，其增殖能力顯著增強，在不同時間點間的差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。同樣地，H1975R轉染miR-17 inhibitor后，即下調(diào)H1975R細胞中的miR-17表達，其增殖能力顯著降低，在不同時間點間的差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。這表明上調(diào)miR-17表達促進細胞增殖，反之，下調(diào)miR-17表達抑制細胞增殖(圖4)。

圖2 PCR檢測miR-17表達情況Figure 2 The expression of miR-17 in H1975 and H1975R cells by qRT-PCRNote：A.The results of qRT-PCR showed the expression of miR-17 in H1975 and H1975R；B.The results of qRT-PCR showed overexpression of miR-17 in H1975；C.The results of qRT-PCR showed downregulation of miR-17 in H1975R.** P<0.01，when compared with the control group.

圖3 H1975和H1975R轉染后細胞的存活曲線Figure 3 The curves of cell viability in H1975 and H1975R cells after transfectionNote：A.H1975 cell that transfect miR-17 mimic showed a curve of cell viability；B.H1975R cell that transfect miR-17 inhibitor showed a curve of cell viability.

圖4 H1975和H1975R轉染后細胞增殖情況Figure 4 The proliferation of H1975 and H1975R cells after transfectionNote：A.The cell viability of H1975 that transfect miR-17 mimic was measured by CCK-8 assay；B.The cell viability of H1975R that transfect miR-17 inhibitor was measured by CCK-8 assay.

2.5 轉染后細胞凋亡情況

本研究流式細胞儀檢測轉染后細胞的凋亡情況。H1975轉染miR-17 mimic后，其凋亡率(9.66±0.27%)低于陰性對照組(13.43±0.45%)(t=12.49，P<0.01)；H1975R轉染miR-17 inhibitor后，其凋亡率(13.77±0.78%)高于陰性對照組(11.7±0.37%)(t=4.16，P<0.05)。由此可知上調(diào)miR-17抑制細胞凋亡，而下調(diào)miR-17則促進細胞凋亡(圖5)。

2.6 轉染后細胞周期分布

H1975轉染miR-17 mimic后，G1期細胞比例(54.56±0.67%)低于陰性對照組(60.90±0.57%)(t=10.95，P<0.01)，G2/M細胞比例(31.57±0.35%)高于陰性對照組(25.45±0.08%)(t=23.28，P<0.01)。H1975R轉染miR-17 inhibitor后，G1期細胞比例(64.18±0.48%)高于陰性對照組(52.65±0.69%)(t=16.90，P<0.01)，G2/M細胞比例(25.57±1.37%)低于陰性對照組(32.12±0.20%)(t=6.37，P<0.01)。這表明了miR-17通過影響細胞周期再分布參與肺癌細胞放射抗性的調(diào)控(圖6)。

圖5 H1975和H1975R轉染后細胞凋亡情況Figure 5 The apoptotic rates of H1975 and H1975R cells after transfectionNote：A.A representative image of apoptosis was detected by flow cytometry(FCM)；B.H1975 cells that transfected miR-17 mimic demontrates an induced apoptotic rate；C.H1975R cells that transfected miR-17 inhibitor demontrate an increased apoptotic rate.* P<0.05，**P<0.01，when compared with the control group.

圖6 H1975和H1975R轉染后細胞周期分布情況Figure 6 The distribution of cell cycle in H1975 and H1975R cells after transfectionNote：A.A representative image of cell cycle distribution was detected by flow cytometry(FCM)；B.The cell cycle of H1975 that transfected miR-17 mimic was measured by FCM；C.The cell cycle of H1975R that transfected miR-17 inhibitor was measured by FCM.* P<0.05，** P<0.01，when compared with the control group.

3 討論

放射治療在肺癌治療中扮演不可或缺的角色，然而放射抗拒是放療過程中出現(xiàn)的最棘手的問題，嚴重影響放療療效，往往是導致肺癌患者治療失敗的重要原因[12]。因此，體外建立肺癌放射抗拒細胞系是研究放射抗拒的首要任務，目前常見建立方法有常規(guī)劑量和高劑量連續(xù)照射。常規(guī)劑量照射誘導方法認為放射抗拒的細胞亞群是經(jīng)過常規(guī)劑量連續(xù)照射后突變而形成[13]；高劑量照射誘導方法則認為腫瘤細胞本身存在不同放射敏感性的細胞亞群，經(jīng)過高劑量連續(xù)照射后，只有放射抗拒性強的細胞才能存活下來[14]。

本研究所采用的梯度劑量照射誘導方法，實質(zhì)上是綜合上述兩種方法的優(yōu)點，既有低劑量照射誘導突變，又有高劑量照射篩選，實現(xiàn)高效建立放射抗拒模型。細胞放射敏感性通常采用克隆形成實驗進行驗證，并通過多靶單擊模型擬合細胞存活曲線，獲得各項放射生物學參數(shù)，其中D0、Dq和SF2越大，代表放射抗拒性越強，對射線越不敏感[15]。我們的結果顯示，H1975R的D0、Dq和SF2均比H1975大，表明了本研究所得到的細胞亞群H1975R的放射抗拒性明顯比親本細胞強。Lou等[5]通過連續(xù)X線誘導照射成功建立乳腺癌放射抗拒細胞MCF-7R和T-47DR，以及Li等[7]用同樣的方法成功建立鼻咽癌放射抗拒細胞CNE-2-Rs，它們的D0、Dq和SF2均比親本細胞大，與本研究的結果相似。由此表明，我們也成功建立了肺癌放射抗拒細胞H1975R，為后續(xù)研究其放射抗拒機制提供必備的實驗工具。

近年來不少證據(jù)表明miRNA的失調(diào)與腫瘤細胞的發(fā)生、復發(fā)及遠處轉移有密切相關[16]。有研究表明miR-17參與腫瘤放射抗拒的調(diào)控，Jiang等[11]通過上調(diào)套細胞淋巴瘤Z138c細胞的miR-17表達明顯提高了其耐放射的能力，而Wu等[17]下調(diào)口腔癌OC3細胞的miR-17表達大大增強了其放射敏感性。然而miR-17是否參與肺癌放射抗拒的調(diào)控不得而知。本研究PCR結果提示肺癌放射抗拒細胞H1975R的miR-17表達量顯著高于親本細胞。為進一步探究miR-17在肺癌放射抗拒中的作用，我們通過下調(diào)放射抗拒細胞系H1975R的miR-17的表達，從克隆形成實驗結果可知，其D0、Dq和SF2均減小，意味著其放射敏感性升高；相反地，通過上調(diào)親本細胞系H1975的miR-17的表達，其耐放射能力得到提高，與Jiang等[11]和Wu等[17]的研究結論相吻合。因此，我們認為miR-17表達升高是導致肺癌放射抗拒的重要因素。此外，本研究的增殖結果表明上調(diào)miR-17表達促進肺癌細胞增殖。Hayashita等[18]也發(fā)現(xiàn)miR-17-92促進小細胞肺癌細胞增殖，與本研究結論一致。細胞凋亡是腫瘤細胞受照射后的主要死亡方式，其凋亡率越高，放射敏感性越強[19]。我們通過下調(diào)肺癌細胞miR-17表達后，其凋亡率升高，意味其放射敏感性會相應升高，與我們的克隆形成實驗結果相符。Yao等[20]在肺癌細胞中也發(fā)現(xiàn)細胞放射敏感性與凋亡率呈正相關。細胞周期紊亂是腫瘤細胞惡化和無限增殖的原因之一[3]。我們下調(diào)放射抗拒細胞H1975R的miR-17表達后，G1期比例升高，G2/M期比例下降，反之則得到相反結論。Wu等[17]同樣通過下調(diào)口腔癌OC3細胞的miR-17表達后，細胞周期變化規(guī)律與我們的結論相一致。G1期細胞減少，而G2/M期細胞增多，意味著miR-17促使更多細胞進入分裂狀態(tài)，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，提高了腫瘤細胞的惡性程度和對抗治療能力，這與我們的細胞增殖、凋亡結果和克隆形成實驗結論相吻合。

綜上所述，本研究推測miR-17可通過促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，調(diào)控細胞周期再分布，從而使肺癌細胞獲得更強的耐放射能力。但究竟miR-17在肺癌細胞中具體的調(diào)控方式還有待進一步探討。miR-17在肺癌細胞放射抗拒中發(fā)揮重要的作用，有望為肺癌放療療效的預測及放射抗拒的分子靶向治療提供新的策略。