MED19基因?qū)w內(nèi)胃癌細(xì)胞增殖抑制作用機(jī)制的探討△

丁相福，王婷婷，許崴崴，袁偉杰，徐廣甍，魏士雄

吉林大學(xué)第二醫(yī)院1甲狀腺外科，2腫瘤血液科，3結(jié)直腸外科，長春130041

4長春市南關(guān)區(qū)醫(yī)院綜合外科，長春130000

5復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，上海200433

中介體（mediator）最早發(fā)現(xiàn)于酵母菌中，是由多個蛋白質(zhì)亞基組成的生物大分子復(fù)合物，屬于RNA聚合酶Ⅱ通用轉(zhuǎn)錄裝置的基本組分，在真核生物mRNA合成的活化和抑制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。酵母的中介體由25個亞基組成[2]，其中21個亞基組成核心結(jié)構(gòu)，包括頭部、中部和尾部組件[3]；4個亞基組成特別組件，對RNA聚合酶Ⅱ的活力進(jìn)行調(diào)節(jié)。哺乳動物中介體的亞基組成及其相關(guān)活性已經(jīng)確定，目前已鑒定30余種亞基，其中多數(shù)亞基與酵母的中介體亞基存在廣泛的同源性[4-5]。

MED19是中介體中的一個亞單位，又稱肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1（lung cancer metastasis related protein 1，LCMR1），最初從高轉(zhuǎn)移肺癌中克隆得到，已被證實(shí)參與細(xì)胞信號由胞外向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。抑制MED19基因表達(dá)，可引起某些調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化和凋亡的基因的表達(dá)發(fā)生改變，提示MED19可能參與細(xì)胞的周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)錄調(diào)控[6]。本研究利用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)在離體胃癌SGC-7901組織細(xì)胞中沉默MED19基因，旨在觀察其影響胃癌組織細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的能力，從而對MED19基因在胃癌中的功能進(jìn)行驗證。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立及瘤體獲得

1.1.1 動物模型建立選擇分化程度差且轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的SGC7901胃癌細(xì)胞株（購自上海吉凱基因科技有限公司），經(jīng)復(fù)蘇及傳代后置入培養(yǎng)瓶中備用。將SGC7901胃癌細(xì)胞分為3組：空白對照組，正常培養(yǎng)的SGC7901胃癌細(xì)胞，不用病毒顆粒轉(zhuǎn)染；陰性對照組，用陰性對照病毒顆粒轉(zhuǎn)染；病毒干擾組，用MED19shRNA慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染。裸鼠為BALB/C-nu/nu裸鼠，共36只，鼠齡4～6周，雌雄各半，平均體重18～25 g，飼養(yǎng)于SPF級屏障動物實(shí)驗室[SYXK（吉）2007-0011]，喂養(yǎng)環(huán)境、溫度、條件均符合實(shí)驗要求。將裸鼠隨機(jī)分成3組，每組12只，3組裸鼠的性別、鼠齡及體重比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。3組裸鼠分別以control組、negative組及shRNA組標(biāo)記，按照組別將各組裸鼠分別移至超凈臺，用碘伏消毒待接種部位，混勻細(xì)胞懸液，選擇裸鼠右側(cè)腋下皮下為接種部位，分別抽取空白對照組、陰性對照組、病毒干擾組SGC7901細(xì)胞0.2 ml接種于control組、negative組及shRNA組裸鼠的接種部位，形成約3 mm皮丘，注射后局部壓迫片刻。

1.1.2 獲取動物模型腫瘤細(xì)胞每日觀察裸鼠是否感染、出瘤時間、瘤體生長情況及腫瘤是否自然消退。成瘤的判斷標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤直徑≥3 mm。全部成瘤率為83.3%。成瘤體積取平均值，每7天記錄1組數(shù)值。全部裸鼠成活良好，腫瘤生長良好。成瘤35 d后，提取裸鼠胃癌組織SGC7901細(xì)胞，備下一步實(shí)驗用。提取胃癌組織SGC7901細(xì)胞后全部裸鼠脫頸處死，沿腫瘤背膜完整剝離胃癌移植瘤備其他實(shí)驗用。

1.2 慢病毒介導(dǎo)RNAi沉默MED19基因的效率驗證

分別抽提3組裸鼠胃癌組織SGC7901細(xì)胞的總RNA，以β-actin為內(nèi)參，采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）驗證MED19蛋白表達(dá)水平的變化，采用實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR，RT-PCR）檢測shRNA慢病毒對MED19mRNA表達(dá)的抑制作用。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況

分離3組裸鼠胃癌組織SGC7901細(xì)胞，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行接種，選取96孔板，每孔接種2000個細(xì)胞，每組5個復(fù)孔，接種5塊復(fù)板。以波長570 nm處的吸光度值反映細(xì)胞增殖情況，細(xì)胞活力越強(qiáng)，OD570nm值越大。連續(xù)檢測5 d，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D570nm值為縱坐標(biāo)，繪制各組細(xì)胞的生長曲線。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

將3組裸鼠胃癌組織SGC7901細(xì)胞分別接種于6孔板中，先用胰蛋白酶消化，后進(jìn)行細(xì)胞固定，待細(xì)胞未脫落呈圓形時，終止完全培養(yǎng)基。采用4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌細(xì)胞，沉淀2次，2000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，然后加入70%的冰冷乙醇1 ml固定細(xì)胞，調(diào)整溫度至4℃，搖床振蕩過夜培養(yǎng)。此后，采用冰PBS再次洗滌細(xì)胞2次，2000 r/min，離心5 min，收集細(xì)胞。1 ml冰PBS溶液重懸細(xì)胞沉淀，隨后在P（I1∶40）及RNase（1∶100）中分別將其加入，冰浴15 min，并應(yīng)避光進(jìn)行，上機(jī)進(jìn)行流式檢測。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒介導(dǎo)MED19基因沉默效果的檢驗

RT-PCR檢測結(jié)果顯示：shRNA組裸鼠胃癌組織SGC7901細(xì)胞中MED19mRNA的基因抑制率為79.3%（圖1A）。Western blot檢測結(jié)果顯示：shRNA組裸鼠胃癌組織SGC7901細(xì)胞中MED19蛋白的表達(dá)水平為（0.23±0.11），低于negative組和control組的（1.03±0.21）、（0.95±0.13），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1B）。

圖1 control組、negative組和shRNA組裸鼠胃癌組織SGC-7901細(xì)胞中MED19 mRNA和蛋白的表達(dá)情況

2.2 shRNA慢病毒介導(dǎo)MED19沉默對裸鼠胃癌組織SGC-7901細(xì)胞增殖作用的影響

MTT法檢測結(jié)果顯示：不同時間點(diǎn)，control組和negative組裸鼠胃癌組織SGC-7901細(xì)胞的增殖能力比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與control組和negative組相比，shRNA組裸鼠胃癌組織SGC-7901細(xì)胞的增殖能力在第3～5天降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（圖2）

2.3 沉默MED19基因?qū)β闶笪赴┙M織SGC-7901細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：shRNA組胃癌組織SGC-7901細(xì)胞的G1期細(xì)胞所占比例高于con-trol組和negative組，G2/M期細(xì)胞所占比例低于control組和negative組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

圖2 不同時間點(diǎn)control組、negative組和shRNA組裸鼠胃癌組織SGC-7901細(xì)胞的增殖情況

表1 control組、negative組和shRNA組不同細(xì)胞周期胃癌組織SGC-7901細(xì)胞所占比例的比較（%，±s）

表1 control組、negative組和shRNA組不同細(xì)胞周期胃癌組織SGC-7901細(xì)胞所占比例的比較（%，±s）

注：a與control組比較，P＜0.05；b與negative組比較，P＜0.05

組別control組negative組shRNA組G1期56.0±0.8 58.2±0.7 71.2±0.8a b G2/M期15.0±0.9 15.0±0.7 7.5±0.7a b S期28.9±0.8 26.7±0.9 21.3±0.3

3 討論

胃癌是人類較常見的胃腸道惡性腫瘤之一。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，在世界范圍內(nèi)，因胃癌導(dǎo)致死亡的概率在惡性腫瘤中居第2位，目前發(fā)現(xiàn)中國、日本等國家占有全球約60%的胃癌新發(fā)病例[7]。目前，針對胃癌的治療，外科手術(shù)仍然是最有效的方式，但是近年來的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，胃癌患者術(shù)后5年的生存率仍然較低。2009年統(tǒng)計結(jié)果顯示，胃癌患者術(shù)后5年的總體生存率低于25%[7]。從分子生物學(xué)的角度考慮，胃癌的發(fā)生過程是一個多步驟、多階段的效應(yīng)過程，主要以癌基因的激活和（或）抑癌基因的失活為基礎(chǔ)，通過癌基因和（或）抑癌基因表達(dá)產(chǎn)物的改變，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)如惡性增殖、去分化和侵襲性生長等特征，導(dǎo)致癌變的發(fā)生。因此，基于上述理論，設(shè)想如果能實(shí)現(xiàn)對這一主要基礎(chǔ)變化的控制，即對癌基因激活和（或）抑癌基因失活的控制，就能夠使腫瘤的發(fā)生被阻斷。這也是近年來胃癌治療領(lǐng)域的主要研究目標(biāo)。RNAi技術(shù)具有高效性、特異性和低毒性等特點(diǎn)，使得該技術(shù)自應(yīng)用以來在反向基因組學(xué)、基因治療、抗腫瘤、抗病毒、抗遺傳性疾病以及胚胎干細(xì)胞的研究等多項研究中顯示出了巨大的潛力[8-9]。

MED19基因是在對CYC7基因突變進(jìn)行觀察時發(fā)現(xiàn)的[10]。相關(guān)研究證實(shí)，中介體和RNA聚合酶Ⅱ全酶的亞基是MED19基因所編碼的產(chǎn)物[11]。而酵母RNA聚合酶Ⅱ的頭部組件是由MED19/ROX3構(gòu)成的[12-13]。當(dāng)MED19/ROX3片段缺失后，中介體中部組建的解離情況出現(xiàn)，僅保留了由頭部和尾部模塊組成的亞復(fù)合體，這也提示了中部組件在中介體的位置，MED19基因?qū)ζ淦鸬搅朔€(wěn)定作用，而不會影響頭部和尾部組件。另一研究證實(shí)，MED19/ROX3突變后，MED19/ROX3中介體對RNA聚合酶Ⅱ的親和力明顯下降，無法刺激RNA聚合酶Ⅱ亞基羥基端結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致其磷酸化[14]。還有研究表明，MED19基因被確定為沉默轉(zhuǎn)錄因子RE1操縱的調(diào)控裝置的重要組分[15]。

目前，還在不斷完善和研究關(guān)于MED19基因在腫瘤組織中的特性，本研究組的前期研究已經(jīng)證實(shí)了MED19基因在胃癌組織中的特性問題，并且也已經(jīng)進(jìn)行了詳細(xì)闡述，研究證實(shí)MED19基因在腫瘤組織中的高表達(dá)具有特異性，這是通過免疫組化方法實(shí)現(xiàn)的，觀察并證實(shí)MED19基因的表達(dá)上調(diào)可能與胃癌的發(fā)生存在一定的關(guān)聯(lián)性。但該研究尚未闡明MED19基因?qū)?xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響[16]。本研究采用RNAi技術(shù)對MED19基因進(jìn)行沉默后，通過一系列實(shí)驗及方法對胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的變化進(jìn)行了觀察，MTT法檢測結(jié)果表明，與control組和negative組相比，shRNA組胃癌組織SGC-7901細(xì)胞的增殖能力在第3～5天降低（P＜0.05），說明對照序列的慢病毒，也可以說慢病毒本身對SGC-7901細(xì)胞增殖能力并沒有影響，而MED19基因沉默因shRNA慢病毒的介導(dǎo)而導(dǎo)致了SGC-7901細(xì)胞中細(xì)胞增殖能力下降。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化顯示，與control組和negative組相比，shRNA組胃癌組織SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G1期，使細(xì)胞復(fù)制能力明顯降低，這也驗證了MED19基因的表達(dá)可以起到對胃癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。在利用MGC803細(xì)胞進(jìn)行的體外實(shí)驗中，同樣也得到了如上所述的結(jié)論[17]。

綜上所述，沉默胃癌細(xì)胞MED19基因，能夠?qū)ξ赴┘?xì)胞的惡性表征起到有效地抑制作用，MED19基因在胃癌的靶向治療和基因治療中，很可能成為有效的靶點(diǎn)，但這還有待進(jìn)一步研究證實(shí)，具有良好的應(yīng)用前景。