響應(yīng)面優(yōu)化乙酸酐改性蛋黃蛋白質(zhì)工藝

李和平，魏建春，付 麗，王 斌

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物工程工程學(xué)院，河南鄭州 450011）

我國(guó)是禽蛋生產(chǎn)大國(guó)，年產(chǎn)量超3 000萬(wàn)t，約占全球禽蛋產(chǎn)量的45%[1]，擁有豐富的禽蛋加工資源。然而我國(guó)禽蛋加工業(yè)與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，存在加工能力弱、加工深度低、品種單一等不足。禽蛋蛋黃中含有大量高附加值的活性物質(zhì)，蛋黃蛋白質(zhì)便是其中之一。蛋黃中蛋白質(zhì)含量高、種類多、功能豐富，是一種傳統(tǒng)的表面活性劑，在飼料、醫(yī)藥、化工、食品及保健品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[2]。目前，我國(guó)蛋黃分離加工主要以提取蛋黃油脂為主，生產(chǎn)過(guò)程中使用乙醇、甲醇及丙酮等有機(jī)溶劑造成分離加工后蛋黃蛋白質(zhì)不同程度地變性，降低其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性。

一般采用酶解、化學(xué)和物理方法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改性以改善其功能特性。其中，化學(xué)改性由于操作簡(jiǎn)單、方便易行而成為蛋白質(zhì)類改性研究的熱點(diǎn)[3]。酰基化是一種反應(yīng)條件溫和、節(jié)約能源的化學(xué)改性方法，并因能夠用來(lái)生產(chǎn)具有高乳化性、高溶解性及高起泡性等高附加值改性蛋白產(chǎn)品而日益受到重視。乙?；男灾参锏鞍兹缧←溍娼畹鞍?、花生蛋白、大豆分離蛋白和大米蛋白以及蛋黃體系中蛋白質(zhì)的物理及酶改性研究報(bào)道較多[4-13]。迄今為止，利用乙?；磻?yīng)對(duì)蛋黃蛋白質(zhì)改性的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究采用乙酸酐對(duì)蛋黃提取脂類后的蛋黃蛋白質(zhì)進(jìn)行改性，以乙酰化程度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用響應(yīng)面法對(duì)乙酰化改性蛋黃蛋白質(zhì)的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)改性后黃蛋白質(zhì)的乳化性進(jìn)行初步研究，為蛋黃蛋白質(zhì)在飼料、醫(yī)藥、化工及保健品領(lǐng)域的工業(yè)化利用開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 鮮雞蛋為市售褐殼蛋；乙酸酐為淄博魯中化工輕工有限公司生產(chǎn)；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 JJ-1A精密增力電動(dòng)攪拌機(jī)（武漢格萊莫檢測(cè)設(shè)備有限公司），WFZ-W2000型分光光度計(jì)（尤尼柯儀器有限公司），PHS-3E酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠），LR10-24A 型離心機(jī)（北京雷勃爾有限公司），SHA-C恒溫振蕩水浴鍋（常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司），DHG-9204A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司），R-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市英峪高科儀器廠）。

1.3 蛋黃蛋白質(zhì)的制備 參考趙繪繪等[14]的制備方法，取雞蛋分離出蛋黃，蛋黃攪拌均勻后放入潔凈的帶塞的三角瓶中，加入95%乙醇（用量4.0 mL/g）浸泡、攪拌60 min 后，靜置15 min，抽濾，濾餅用乙醇浸泡、抽濾，重復(fù)2 次。所得濾餅快速揮干即為蛋黃蛋白質(zhì)。

1.4 乙?；包S蛋白質(zhì)的制備方法 乙酰化蛋黃蛋白質(zhì)的制備是根據(jù)張紅印等[4]報(bào)道的方法，略做修改。取一定質(zhì)量蛋黃蛋白質(zhì)加入純凈水，攪拌30 min溶解后，用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0±0.5，恒溫30℃下按一定速度分批緩慢加入乙酰酐，調(diào)節(jié)pH始終保持在8.0±0.5，反應(yīng)一定時(shí)間后，用2 mol/L HCl調(diào)pH至4.0，3 500 r/min離心10 min收集沉淀，用蒸餾水將沉淀洗滌2次后快速揮干，粉碎至100目得改性蛋黃蛋白質(zhì)。

1.5 乙?；潭鹊臏y(cè)定 采用Paik等[15]的茚三酮比色法測(cè)定蛋白質(zhì)的酰化程度。

1.6 蛋黃蛋白質(zhì)乳化性的測(cè)定 參考李磊等[7]的方法測(cè)定乳化活性（EA/OD500）和乳化穩(wěn)定性（ESI/min）。

1.7 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.7.1 蛋白質(zhì)濃度（m/v）對(duì)乙?；磻?yīng)的影響 在濃度（m/v）為1%、2%、4%、6%、8%、10%、15%的蛋黃蛋白液中分別加入蛋黃蛋白質(zhì)量20%（v/m）的乙酸酐，在溫度30℃、pH在8.0±0.5條件下反應(yīng)100 min后，測(cè)定?；潭取?/p>

1.7.2 乙酸酐添加量對(duì)乙?；磻?yīng)的影響 在8%（m/v）蛋黃蛋白液中分別加入占蛋黃蛋白質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)（v/m）為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%的乙酸酐，在溫度30℃、pH在（8.0±0.5）條件下反應(yīng)100 min后，測(cè)定酰化程度。

1.7.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)乙酰化反應(yīng)的影響 在8%（m/v）蛋黃蛋白液中加入占蛋黃蛋白質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)20%（v/m）的乙酸酐，在溫度30℃、pH在8.0±0.5條件下分別反應(yīng) 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 min 后，測(cè)定酰化程度。

1.8 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取反應(yīng)時(shí)間、蛋黃蛋白質(zhì)濃度（m/v）和乙酸酐添加量（v/m）3個(gè)因素設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

1.9 統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，取其平均值。采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。乙酸酐改性蛋黃蛋白質(zhì)采用Design-Expert 8.0.6.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一水解條件分析

2.1.1 蛋白質(zhì)濃度對(duì)乙?；磻?yīng)的影響 從圖1可以看出，當(dāng)?shù)鞍诐舛葟?%增加到8%時(shí)，乙?；潭妊杆偕仙?；當(dāng)?shù)鞍诐舛葟?%增加到16%時(shí)，蛋黃蛋白的乙?；潭乳_始降低。其原因是隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，高濃度蛋白質(zhì)分子與乙酸酐分子充分碰撞有利于乙?；磻?yīng)；但蛋白質(zhì)濃度過(guò)高，溶液體系的粘度增大，蛋白質(zhì)和乙酸酐分子的碰撞減少，最終導(dǎo)致蛋黃蛋白?；潭冉档蚚16]。因此，蛋黃蛋白質(zhì)的最適濃度為8%。

圖1 蛋白質(zhì)濃度對(duì)乙?；磻?yīng)的影響

2.1.2 乙酸酐添加量對(duì)乙?；磻?yīng)的影響 從圖2可以看出，當(dāng)乙酸酐添加量從5%增加到20%時(shí)，乙酰化反應(yīng)以較快的速度增加，蛋黃蛋白的乙酰化度迅速增加；當(dāng)乙酸酐添加量超過(guò)20%后，乙酰化度增加不明顯。隨著乙酰酐濃度的增加，乙酸酐分子與蛋黃蛋白質(zhì)分子碰撞機(jī)率增大，反應(yīng)速率增加，產(chǎn)物乙酰化程度增加；但當(dāng)乙酰酐達(dá)到一定濃度后，蛋黃蛋白參與?；磻?yīng)的基團(tuán)達(dá)到飽和，乙?；炔辉倜黠@增加[16]。因此，確定乙酸酐的最適添加量為20%。

圖2 乙酸酐添加量對(duì)乙?；磻?yīng)的影響

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)乙?；磻?yīng)的影響 由圖3可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間從10 min增加到50 min，乙?；妊杆偕仙?；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)50 min之后，乙?；然颈３趾愣╗17-18]；乙?；磻?yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不利于工業(yè)生產(chǎn)，確定乙酰化蛋黃蛋白質(zhì)的最適反應(yīng)時(shí)間為50 min。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)乙?；磻?yīng)的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 響應(yīng)面試驗(yàn)及結(jié)果見表2和表3。利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，獲得蛋黃蛋白質(zhì)乙酰化度（Y）對(duì)反應(yīng)時(shí)間（A）、蛋白質(zhì)濃度（B）、乙酸酐添加量（C）的二次回歸模型方程：Y=72.00+2.48A+2.62B+8.16C+0.88 AB+0.56AC-0.36BC-2.17A2-1.69B2-3.32C2。

如表3所示，回歸模型的F值為22.184 9，P 值為0.000 2，達(dá)到極其顯著水平；失擬項(xiàng)不顯著（P=0.210 1），模型的確定系數(shù)R2=0.966 1，可以用該回歸方程對(duì)乙酸酐改性蛋黃蛋白質(zhì)的實(shí)際情況進(jìn)行預(yù)測(cè)。從F值可知，3個(gè)因素對(duì)蛋黃蛋白質(zhì)改性效果影響的順序?yàn)镃＞B＞A。一次項(xiàng)A、B、C對(duì)乙?；磻?yīng)效果影響極顯著（P＜0.01）。AB、AC、BC交互作用對(duì)乙?；磻?yīng)效果影響不顯著（P＞0.05）；二次項(xiàng)A2、B2對(duì)乙?；磻?yīng)效果影響不顯著（P＞0.05），C2對(duì)乙?；磻?yīng)效果影響極顯著（P＜0.01），說(shuō)明各具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 各因素和回歸方程的方差分析

2.2.2 響應(yīng)面分析 等高線圖可以直觀反映各因素對(duì)乙酰化程度的交互作用程度[19]。從圖4可以看出，反應(yīng)時(shí)間和蛋白質(zhì)濃度等高線圖是橢圓形的，表明兩者之間的相互作用明顯；反應(yīng)時(shí)間和乙酸酐添加量、乙酸酐添加量和蛋白質(zhì)濃度等高線圖的接近圓形，表明兩者之間的交互作用不明顯。比較圖4各響應(yīng)面曲線可知，在乙酸酐添加量方向的坡面較陡，隨著乙酸酐添加量的增加，乙?；瘸尸F(xiàn)逐步升高的趨勢(shì)，并在乙酸酐添加量25.00%附近，乙?；茸罡?，表明乙酸酐添加量對(duì)乙?；扔绊戄^為顯著。蛋白質(zhì)濃度次之，其曲線較平直。反應(yīng)時(shí)間方向的坡面更平直，乙?；鹊纳呲厔?shì)不明顯，說(shuō)明反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋黃蛋白質(zhì)乙酰化改性效果影響不顯著。

圖 4 各交互因素對(duì)乙?；包S蛋白質(zhì)影響的響應(yīng)面及等高線圖

2.2.3 最佳工藝條件及驗(yàn)證 經(jīng)Design-Expert 8.0.6.1分析得到的預(yù)測(cè)工藝條件為反應(yīng)時(shí)間54.43 min、蛋白質(zhì)濃度9.80%、乙酸酐添加量25.00%，預(yù)測(cè)乙酰化度為79.19%。根據(jù)實(shí)際操作，對(duì)工藝條件進(jìn)行規(guī)范化處理，在反應(yīng)時(shí)間55 min、蛋白質(zhì)濃度10.00%、乙酸酐添加量25.00%條件下，做5次驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果蛋黃蛋白質(zhì)乙?；葹?8.98%，與預(yù)測(cè)理論值接近，說(shuō)明此模型優(yōu)化結(jié)果可靠。

2.3 蛋黃蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果 從表4可以看出，與未改性蛋黃蛋白質(zhì)相比較，乙?；蟮包S蛋白質(zhì)EA和ESI分別提高了67.16%和82.91%，這主要是因?yàn)轷；淖兞说鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)，相鄰分子間的離子鍵減弱，親水性更強(qiáng)[20]。

表 4 蛋黃蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)

3 結(jié) 論

各因素對(duì)蛋黃蛋白質(zhì)乙?；扔绊懙捻樞?yàn)橐宜狒砑恿浚镜鞍踪|(zhì)濃度＞反應(yīng)時(shí)間。乙?；磻?yīng)改性蛋黃蛋白質(zhì)的最適佳工藝條件為反應(yīng)時(shí)間55 min、蛋白質(zhì)濃度10.00%、乙酸酐添加量25.00%，該條件下蛋黃蛋白質(zhì)乙酰化度為78.98%，與預(yù)測(cè)值接近，且改性后蛋黃蛋白質(zhì)的乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別提高了67.16%和82.91%。該研究結(jié)果將為乙酰化改性蛋黃蛋白質(zhì)生產(chǎn)和應(yīng)用提供參考。