中鏈脂肪酸對脂多糖誘導(dǎo)的斷奶仔豬腸黏膜免疫屏障損傷的保護作用

劉聰聰，王樹輝，涂治驍，陳少魁，汪龍梅，秦 琴，張 琳，王秀英，劉玉蘭，朱惠玲

（武漢輕工大學動物營養(yǎng)與飼料科學湖北省重點實驗室，湖北武漢 430023）

小腸是動物消化吸收的主要器官，也是細菌、病毒、寄生蟲和過敏大分子等有害物質(zhì)的物理和免疫屏障[1]。在生豬飼養(yǎng)過程中，仔豬易受各種病原體和非病原體感染，刺激豬產(chǎn)生免疫應(yīng)激，進而使腸黏膜屏障功能遭到破壞，導(dǎo)致豬腸道通透性增加，使炎癥和腸道損傷加劇，最終導(dǎo)致動物器官多功能衰竭[2]。因此，借助于營養(yǎng)調(diào)控手段來改善腸道的應(yīng)激反應(yīng)對保護腸黏膜結(jié)構(gòu)和屏障功能的完整性非常重要。

中鏈脂肪酸是由6～12個碳原子組成的飽和脂肪酸，其酯化形式為中鏈甘油三酯，包括己酸（C6）、辛酸（C8）、癸酸（C10）和月桂酸（C12）。中鏈脂肪酸不僅能快速供能而且具有抑制有害細菌、改善腸道微生物菌群、降低炎性細胞因子水平、提高新生仔豬免疫功能等生物學特性[3]。中鏈脂肪酸還可改善哺乳仔豬腸道結(jié)構(gòu)，緩解腸道損傷[4]。

脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌細胞膜的成分，LPS注射后3～6 h內(nèi)會引起腸黏膜形態(tài)急性損傷和腸道屏障功能障礙[5]?；诖?，本試驗旨在研究中鏈脂肪酸對LPS誘導(dǎo)的斷奶仔豬腸黏膜免疫屏障損傷的保護作用，為其在仔豬生產(chǎn)中的推廣與應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 LPS（大腸桿菌血清型O55: B5，Sigma公司）；中鏈脂肪酸（購自連云港華成飼料有限公司）。玉米油和中鏈脂肪酸的組成成分見表1。

1.2 試驗設(shè)計與管理 選取24頭（21±1）d、體重為（9.0±0.7）kg的杜×長×大三元雜交斷奶仔豬，經(jīng)過7 d預(yù)試后，按照體重相近原則隨機分為4個處理組，每個處理組6個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。試驗用玉米油作為對照，采用2×2因子設(shè)計，主因子分別為日糧處理（中鏈脂肪酸日糧或玉米油日糧）和免疫應(yīng)激（LPS或生理鹽水）。按照NRC（1998）配制基礎(chǔ)日糧，日糧組成與營養(yǎng)成分見表2。中鏈脂肪酸日糧含有4%中鏈脂肪酸+1%玉米油，玉米油日糧含有5%的玉米油。試驗期為21 d。在試驗第21天，每個日糧組中選3個重復(fù)注射100 μg/kg 體重（BW）的LPS，剩余的3個重復(fù)注射等量的生理鹽水。試驗期間，豬舍進行常規(guī)消毒，仔豬自由采食及飲水。

表1 玉米油和中鏈脂肪酸的組成成分 %總脂肪酸（重量）

1.3 樣品采集與處理 本試驗注射LPS或生理鹽水4 h后屠宰仔豬，剖開腹腔取空腸、回腸樣品，制作組織切片。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 絨毛高度和隱窩深度 取腸道切片，在10×10倍光鏡下，選取10根最長且完整的絨毛，測定絨毛高度、隱窩深度，計算其比值。

1.4.2 上皮間淋巴細胞、杯狀細胞數(shù) 取腸道切片，在40×10倍光鏡下，選取6個完好絨毛和隱窩，計數(shù)每100個腸上皮細胞內(nèi)所含淋巴細胞數(shù)、杯狀細胞數(shù)，并計算每張切片上皮間淋巴細胞、杯狀細胞平均值。

1.4.3 嗜中性粒細胞數(shù) 取腸道切片，在40×10倍光鏡下，隨機選取6個視野計數(shù)嗜中性粒細胞數(shù)，并測量每個視野的面積，求出該切片嗜中性粒細胞的密度。

1.4.4 固有層細胞密度的測定 取腸道腸切片，在40×10倍光鏡下，選取6根完好絨毛，計數(shù)腸絨毛固有層細胞數(shù)，并測量每個固有層的面積，計算該切片固有層細胞密度。

1.4.5 派氏結(jié)（Peyers Pathch，PP結(jié)）細胞密度 取回腸切片，在40×10倍光鏡下，選取6個完好的PP結(jié)，每個PP結(jié)隨機選取6個視野計數(shù)細胞數(shù)，并測量每個視野的面積，并計算該切片PP結(jié)細胞密度。

1.5 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進行雙因子方差分析。模型主效應(yīng)包括日糧處理、免疫應(yīng)激及二者的互作關(guān)系。

表2 日糧配方和營養(yǎng)成分（風干基礎(chǔ)）

2 結(jié) 果

2.1 中鏈脂肪酸對LPS刺激仔豬腸黏膜形態(tài)的影響 由圖1可知，LPS刺激導(dǎo)致空腸絨毛萎縮、上皮脫落；飼糧中添加中鏈脂肪酸導(dǎo)致空腸絨毛上皮輕度脫落。LPS和中鏈脂肪酸對腸黏膜形態(tài)的影響無互作關(guān)系（P＞0.10）（表3）。LPS刺激顯著降低空腸的絨毛高度和隱窩深度（P＜0.05），同時顯著降低回腸的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度（P＜0.05）。日糧中添加中鏈脂肪酸顯著提高了空腸絨毛高度（P＜0.05），對回腸黏膜形態(tài)沒有影響（P＞0.05）。

圖1 仔豬空腸黏膜形態(tài)

2.2 中鏈脂肪酸對LPS刺激仔豬腸黏膜免疫屏障的影響上皮間淋巴細胞（多數(shù)分布在上皮細胞基底膜附近）和杯狀細胞都分布在腸上皮柱狀細胞間，以小型細胞為主，胞核大而圓，深染，胞漿少；杯狀細胞多呈柱狀或圓錐形。由表4可知，LPS刺激顯著降低回腸上皮間淋巴細胞及杯狀細胞數(shù)（P＜0.05），且有降低空腸上皮間淋巴細胞的趨勢（P＜0.10）；中鏈脂肪酸與LPS對空腸杯狀細胞（P＜0.05）及上皮間淋巴細胞（P＜0.10）存在互作關(guān)系，即中鏈脂肪酸緩解了LPS刺激導(dǎo)致的空腸杯狀細胞數(shù)的升高和上皮間淋巴細胞數(shù)的減少。嗜中性粒細胞主要分布在小腸黏膜固有層，胞核多為腎形，胞漿豐富。LPS刺激顯著增加了回腸嗜中性粒細胞密度（P＜0.05），中鏈脂肪酸對小腸嗜中性粒細胞密度沒有影響（P＞0.10），二者也沒有互作關(guān)系（P＞0.05）。

由表5可知，LPS刺激顯著增加回腸固有層細胞密度（P＜0.05），日糧添加中鏈脂肪酸降低了空腸、回腸固有層細胞密度（P＜0.05），且LPS與中鏈脂肪酸之間存在互作關(guān)系（P＜0.05），即中鏈脂肪酸能緩解LPS刺激所引起的空腸固有層細胞密度的增加。LPS刺激可使回腸PP結(jié)細胞密度顯著增加（P＜0.05）。日糧中添加中鏈脂肪酸則顯著降低了回腸PP結(jié)細胞密度（P＜0.05），兩者沒有互作關(guān)系（P＞0.05）。

表3 中鏈脂肪酸對LPS刺激仔豬腸黏膜形態(tài)的影響

表4 中鏈脂肪酸對LPS刺激仔豬腸黏膜免疫細胞的影響

表5 中鏈脂肪酸對LPS刺激仔豬小腸黏膜固有層細胞密度和PP結(jié)細胞密度的影響

3 討 論

腸道是動物消化吸收的主要器官，同時作為機體最大的保護屏障，可以阻止腸道內(nèi)病原微生物入侵，保護機體健康[1]。 腸黏膜屏障功能的完整性主要由腸黏膜上皮屏障、腸道免疫屏障和腸道內(nèi)正常微生物群這三大屏障來維持[2]，通過絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度等指標來反映。本試驗結(jié)果顯示，LPS刺激導(dǎo)致空腸絨毛萎縮、上皮脫落，小腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度顯著降低，與相關(guān)研究結(jié)果一致[1]。小腸上皮細胞的更新和屏障功能的維持是一個動態(tài)過程，受機體營養(yǎng)水平、飼喂方式及營養(yǎng)素的影響，在應(yīng)激狀態(tài)下需要足夠的能量來維持和修復(fù)小腸的完整性和屏障功能[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加中鏈脂肪酸可以提高小腸絨毛高度，這是因為在應(yīng)激狀態(tài)下，中鏈脂肪酸可直接被小腸上皮細胞吸收利用，快速供能以促進上皮細胞的更新和修復(fù)，維持腸黏膜屏障功能的完整性。而且有研究表明，中鏈脂肪酸可以提高小腸絨毛高度，同時降低隱窩深度，對腸道形態(tài)有積極的作用[7]。LPS主要引起動物急性的炎癥反應(yīng)和腸道損傷，如果長期用LPS刺激會使仔豬的敏感性降低。飼糧中添加4%中鏈脂肪酸對仔豬的生長性能并沒有影響，這主要是由于仔豬在應(yīng)激及炎癥的情況下，中鏈脂肪酸可通過保護仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)來改善生產(chǎn)性能，而仔豬在健康狀況下，飼喂中鏈脂肪酸不會影響生 長性能（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。

腸道免疫屏障主要是由腸道免疫細胞和相關(guān)淋巴組織組成。上皮間淋巴細胞是腸道免疫屏障的重要組成成分之一，也是機體對抗感染或過敏原的第1道防線，在維持腸黏膜屏障功能方面發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，動物小腸黏膜屏障完整性破壞往往伴隨著上皮間淋巴細胞數(shù)目的減少[8]，中鏈脂肪酸可降低新生仔豬食糜沙門氏菌和大腸桿菌的濃度，如月桂酸可顯著抑制革蘭氏陰性菌[9]。本研究中，在LPS刺激后，腸上皮間淋巴細胞數(shù)顯著降低，說明腸黏膜免疫屏障遭受破壞，而日糧中添加中鏈脂肪酸則提高了上皮間淋巴細胞數(shù)，這可能與中鏈脂肪酸抑制腸道有害菌群、減少其對腸黏膜的損傷有關(guān)。

嗜中性粒細胞作為機體的天然免疫細胞，具有趨化、吞噬和殺菌功能。趨化物質(zhì)使嗜中性粒細胞滲出血管壁迅速聚集在炎癥部位，發(fā)揮抗炎和殺菌的作用[10]。本研究表明，腸黏膜的炎癥反應(yīng)是由LPS刺激導(dǎo)致的腸黏膜嗜中性粒細胞密度增加引起的。

固有層中含有大量的免疫細胞（如淋巴細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞和嗜中性粒細胞等），是腸黏膜免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)場所，也是腸黏膜的過濾器[11]。研究發(fā)現(xiàn)，腸黏膜固有層細胞密度增大是由黏膜炎癥和抗原刺激引起的[12]。本試驗結(jié)果表明，LPS刺激可導(dǎo)致腸固有層細胞密度顯著增大，表明LPS刺激可引起腸黏膜炎癥及屏障功能受損。有研究指出，在魚油基礎(chǔ)日糧中添加中鏈甘油三酯可以降低小鼠的炎癥反應(yīng)，而且中鏈甘油三酯可顯著降低LPS刺激誘導(dǎo)的炎性細胞因子及趨化因子水平[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加中鏈脂肪酸降低了腸固有層細胞密度，說明中鏈脂肪酸可能降低了LPS刺激導(dǎo)致的炎性細胞因子的升高，對LPS所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有緩解作用，維持了腸黏膜屏障功能。

回腸在腸黏膜免疫系統(tǒng)中具有重要的地位，其黏膜層有大量的免疫細胞，黏膜下層還有集合淋巴結(jié)即PP結(jié)，在歸巢受體介導(dǎo)下，PP結(jié)中致敏的淋巴細胞可移行到致敏部位的腸黏膜上皮和固有層發(fā)揮作用。當機體發(fā)生炎癥或抗原入侵時，PP結(jié)細胞密度增大。本研究中，LPS刺激引起PP結(jié)細胞密度增大，表明LPS刺激能夠?qū)е履c黏膜出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。中鏈脂肪酸可通過免疫細胞GPR84參與機體的免疫調(diào)節(jié)，其中辛酸和癸酸都具有抗病毒活性[14]。PP結(jié)細胞密度因中鏈脂肪酸的添加而降低，可能是由于中鏈脂肪酸參與了機體的免疫調(diào)節(jié)，對腸道內(nèi)的病毒入侵有抵抗作用，同時緩解了LPS刺激所導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，從而對腸黏膜屏障功能起到保護作用。

杯狀細胞可以分泌黏蛋白進入管腔內(nèi)，從而阻止病原微生物和有害物質(zhì)的入侵，對黏膜上皮有潤滑和保護作用[15]，是機體重要的防御細胞。此外，杯狀細胞分泌的三葉因子可減少炎性細胞的浸潤，從而起到維護和修復(fù)腸黏膜的作用。在本研究中，LPS及中鏈脂肪酸都降低了腸杯狀細胞數(shù)。但中鏈脂肪酸及LPS對腸黏膜杯狀細胞的影響未見報道，其機體的機理還有待進一步研究。

4 結(jié) 論

綜上分析，LPS刺激會引起腸黏膜結(jié)構(gòu)受損，破壞免疫屏障功能；日糧中添加中鏈脂肪酸可有效緩解LPS引起的仔豬腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷，維持和保護腸黏膜免疫屏障功能。