耐碳青霉烯類腸桿菌的同源性分析

申振華 申潔心 鄭洪澤

作者單位：251800 山東濱州，陽信縣人民醫(yī)院檢驗科（申振華）

265400 山東煙臺，山東玲瓏英誠醫(yī)院檢驗科（申潔心）

256600 山東濱州，濱州市人民醫(yī)院檢驗科（鄭洪澤）

耐碳青霉烯類腸桿菌若經(jīng)碳青霉烯類抗菌藥物治療無效，則細菌的耐藥基因極易通過質(zhì)粒、整合子、插入序列共同區(qū)（insertion sequence common region，ISCR）等可移動元件廣泛進行傳播［1］，導致不同菌屬之間的感染，引發(fā)醫(yī)院內(nèi)感染的暴發(fā)流行。

本研究針對我院臨床分離的耐碳青霉烯類抗菌藥物的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌建立腸桿菌基因間重復一致序列聚合酶鏈反應（Enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction，ERIC-PCR）同源性分析，進行分子流行病學研究，以監(jiān)測我院耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌的暴發(fā)流行情況，為感染的控制和相關(guān)新藥的研發(fā)提供依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2012年1月—2016年11月山東省陽信縣人民醫(yī)院臨床分離的對亞胺培南、美羅培南、厄他培南等碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的89株腸桿菌，其中69株為肺炎克雷伯菌，20株為大腸埃希菌。

1.2 儀器與試劑 儀器包括PE9700PCR擴增儀（美國PE公司），Microscan 96全自動微生物分析/藥敏系統(tǒng)（德國西門子公司），EPS300A型電泳儀（上海天能科技有限公司），紫外凝膠成像儀（上海復日科技有限公司），eppendorf超速低溫離心機、Thermo生物安全柜、MUTI Block數(shù)字干浴器、WH-2微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司），42 ℃孵箱，天平。試劑包括10×Buffer緩沖液、肉湯培養(yǎng)基、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、Mg2+、DNA Mark、TaqDNA 聚合酶、6×loading buffer上樣緩沖液、ERIC-2引物（大連寶生物工程有限公司）、瓊脂糖、50X TAE電泳緩沖液。

1.3 研究方法

1.3.1 DNA模板的制備 提取89株耐碳青霉烯類菌株的DNA作為模板。

1.3.2 ERIC-PCR方法檢測細菌的同源性 應用腸桿菌科基因間重復序列分析耐碳青霉烯類抗菌藥物腸桿菌的菌屬同源性。引物序列ERIC-2為5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'。

1.3.2.1 PCR的反應體系 反應體系共50 μL，其中 10Xbuffer緩沖液 5 μL、TaqDNA 聚合酶 0.5 μL、dNTP 4 μL、Mg2+3 μL、引物 2.5 μL、DNA 模板 2 μL，加入無菌去離子水至50 μL。

1.3.2.2 PCR的反應條件 95 ℃預變性5 min，94 ℃變性 1 min，26 ℃退火 2 min，72 ℃延伸 1 min，4 個循環(huán)。94 ℃變性 1 min，40 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)。72 ℃延伸10 min。采用2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產(chǎn)物進行分析，電泳時間1 h，電壓60 V。應用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

判定標準：電泳基因分型主條帶的位置及數(shù)量相同，有1～2條非主條帶不相同的菌株歸為同一基因型；主條帶位置及數(shù)量不相同或者非主條帶差3條以上的菌株歸為不同基因型。本院耐碳青霉烯類抗菌藥物的肺炎克雷伯菌共分成7個基因型（E1～E7），包括 E1（76 號）、E2（77、80 號）、E3（81～84、86、90、94～96 號）、E4（85、87、97號）、E5（88號）、E6（89、91 號）、E7（92、93 號），分布在急診科和重癥醫(yī)學科（Intensive Care Unit，ICU）的肺炎克雷伯菌主要為2個基因型（E3和E4）。而本院耐碳青霉烯類抗菌藥物的大腸埃希菌主要共分為8個基因型（A1～A8），包括 A1（3、6、22、25、26、49 號）、A2（7、18 號）、A3（15、65、78、79 號）、A4（16、19、21 號）、A5（23 號）、A6（24 號）、A7（34、36 號）、A8（73號），都散在分布于臨床各個科室。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的部分ERIC-PCR電泳分型結(jié)果見圖1。

圖1 耐碳青霉烯類大腸埃希菌（A）和耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（B）的部分ERIC-PCR電泳分型結(jié)果

大多數(shù)相同基因型的菌株分布于不同的科室，只有少數(shù)相同基因型的菌株同時分布于ICU和急診科，如來自急診和ICU的81～84號、86號菌株為同一基因型，并且均為肺炎克雷伯菌，我們推測可能存在局部流行暴發(fā)感染的趨勢。

3 討論

腸桿菌屬于臨床最常見的致病菌，包括多種類型的細菌，主要為大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌等，可引起多種器官局部及全身多部位的感染。由于臨床上不合理地使用抗菌藥物，造成細菌耐藥類型發(fā)生變遷，使其極易演變?yōu)椤俺壖毦保瑢е赂腥菊叩牟∷缆噬摺?/p>

自首例攜帶KPC-2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌于2001年被報道以來，世界各地開始相繼出現(xiàn)與產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細菌相關(guān)的報道。近幾年來，耐碳青霉烯類抗菌藥物的腸桿菌科細菌的分離率在國內(nèi)也呈現(xiàn)逐年升高趨勢。碳青霉烯類抗菌藥物為臨床治療腸桿菌感染較為有效的藥物，若細菌對此類抗菌藥物耐藥，耐藥菌株無法得到及時的控制和治療，極有可能在醫(yī)務(wù)人員與患者之間、患者之間引發(fā)交叉感染,甚至導致醫(yī)院內(nèi)感染的暴發(fā)流行。

醫(yī)療器械、醫(yī)護人員的手、患者病房之間的變動、周轉(zhuǎn)等均有成為“超級細菌”傳染源的可能性。耐碳青霉烯類腸桿菌感染可在醫(yī)院病房內(nèi)大規(guī)模暴發(fā)流行，給患者的生命安全和經(jīng)濟造成了極大的損失［2］。因此，進行臨床分離菌株的基因同源性分析對傳染源和傳播途徑等因素的流行病學調(diào)查具有重要的意義。

對菌屬之間進行同源性分析的方法較多，包括脈沖場凝膠電泳、隨機擴增多態(tài)性DNA標記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）和重復序列PCR（rep-PCR）［3］。脈沖場凝膠電泳屬于檢測金標準，既有很高的分辨率，又有很好的重復性。但是脈沖場凝膠電泳實驗成本太高，難以在普通實驗室開展［4］。RAPD的優(yōu)點為分辨率高，但因其引物合成的隨機性，重復性相對較差。

1990年，Sharples等［5］首次于大腸埃希菌的基因組中發(fā)現(xiàn)ERIC片段，并將此片段稱為“基因間的重復單位”。1991年，Hulton等［6］在腸桿菌科細菌中也找到了同樣高度保守的重復序列片段，稱之為ERIC。ERIC大多數(shù)存在于開放閱讀框上下游的不翻譯區(qū)域，即為基因組中可轉(zhuǎn)錄的非編碼區(qū)域，長約為126 bp的序列［7］，其中包括幾個反向重復序列。Versalovic等［8］根據(jù)ERIC中心一段長度約44 bp的高度保守反向重復序列設(shè)計了反向引物，發(fā)展了ERIC-PCR。起初ERIC-PCR由一個2～4人的團隊做科研驗證，之后ERIC-PCR陸續(xù)被用于細菌的同源性鑒定分析［9］。研究人員選擇在疾病暴發(fā)狀態(tài)下進行標本的采集，以研究患病風險，使ERIC-PCR成功應用于疾病的臨床診斷。

ERIC-PCR以ERIC的核心序列設(shè)計引物，由于不同的細菌之間ERIC重復序列位置及數(shù)量分布不同，因此可得到不同細菌之間不同片段長度的DNA指紋圖譜［10-11］。目前，ERIC-PCR為細菌基因?qū)W分型最簡便、快速、穩(wěn)定的方法。

本研究結(jié)果顯示，應用ERIC-PCR基因分型可將本院的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌分為7個基因型，但在ICU和急診科主要為2個基因型，具有很高的菌株分型相似度；耐碳青霉烯類大腸埃希菌則分為8個基因型，散在分布于臨床的各個科室。我院耐碳青霉烯類大腸埃希菌在全院為散發(fā)狀態(tài)；但在ICU和急診科的部分菌株屬于同一基因型，且均為肺炎克雷伯菌。因此，我院存在耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌局部流行暴發(fā)趨勢的可能性極大，應當加強醫(yī)院內(nèi)的監(jiān)測工作，增強醫(yī)務(wù)人員的無菌操作意識，采取必要的措施隔離相關(guān)患者，合理、規(guī)范地使用抗菌藥物，以防止耐碳青霉烯類腸桿菌的大規(guī)模暴發(fā)。

綜上所述，細菌之間的同源性分析為醫(yī)務(wù)人員早期預防和控制院內(nèi)感染提供了可靠的依據(jù)。