蟾五草組分散組方篩選及體外藥效作用

陳貴兵

（成都軍區(qū)總醫(yī)院普外中心，成都 610083）

蟾皮華蟾毒配基組分是一種有效的抗癌藥物，但具有肝毒性及免疫抑制[1-4]。因其可導(dǎo)致肝細胞壞死和抑制淋巴細胞活性的毒副作用，嚴(yán)重限制了蟾皮華蟾毒配基組分在抗腫瘤方面的應(yīng)用。為實現(xiàn)對蟾皮華蟾毒配基組分的減毒增效，從中醫(yī)經(jīng)方中發(fā)現(xiàn)蟾酥常與甘草、黃芪、五味子配伍以期望達到祛邪不傷正的功效[5-6]。本實驗嘗試根據(jù)組分中藥理論及前期實驗結(jié)果采用中藥組分間配伍以優(yōu)化蟾皮華蟾毒配基組分抗癌作用[1]。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑 酶標(biāo)分析儀（北京普朗）；細胞增殖與毒性檢測（CCK-8）試劑盒（南京凱基生物）、RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基（美國Sigma公司）；蟾皮華蟾毒配基組分、五味子組分、黃芪組分和甘草酸均由中國科學(xué)院大連化物所提供。

1.2 細胞株 人結(jié)直腸腺癌SW620細胞株和人正常肝細胞L02細胞株系解放軍總醫(yī)院普外研究所凍存。人細胞因子誘導(dǎo)性殺傷T細胞（CIK細胞）參照本實驗室已有方法分離培養(yǎng)獲得[7]。

1.3 藥液配制 將蟾皮華蟾毒配基組分、五味子組分、黃芪組分和甘草酸以二甲基亞砜（DMSO）充分溶解，加入無血清培養(yǎng)液配制貯存液并用0.22 μm過濾器除菌，-20℃避光保存，控制DMSO終濃度小于0.05%。

1.4 細胞培養(yǎng) 人SW620和L02細胞株使用高糖DMEM（含10%FBS）完全培養(yǎng)基培養(yǎng)（恒溫培養(yǎng)箱條件37℃、5%CO2），取對數(shù)生長期細胞進行實驗或凍存。人CIK細胞的培養(yǎng)參照本實驗室已有方法[7]，實驗前經(jīng)臺盼藍染色鏡下計數(shù)確定活細胞數(shù)＞90%。

1.5 利用析因設(shè)計分析4種藥物組分間的交互作用 選取蟾皮華蟾毒配基組分（A）、五味子組分（B）、黃芪組分（C）和甘草酸（D）作為研究因素，每個因素取兩個水平0和1（0代表無藥，1代表有藥）。4個因素的水平1分別給定藥物終濃度為蟾皮華蟾毒配基組分（A）1 μg/mL、五味子組分（B）10 μg/mL、黃芪組分（C）10 μg/mL 和甘草酸（D）20 μg/mL。將A、B、C、D 分別交叉組合（24），共有 16個實驗方案，分 別 簡 寫 為 A、B、C、D、AB、AC、AD、BC、BD、CD、ABC、ABD、ACD、BCD、ABCD 和對照組即 A0B0C0D0,見表2。各組藥物劑量為各因素各水平的累加值，然后分別干預(yù)SW620、L02和CIK細胞的增殖。按已有實驗方法接種、培養(yǎng)細胞[1]。16個實驗組均設(shè)3個復(fù)孔，按時完成加藥后培養(yǎng)72 h，取出96孔板光鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，再每孔加入10 μL CCK-8試劑檢測溶液，置于37℃孵育4 h，選定酶標(biāo)分析儀波長450 ηm處測定各孔吸光度A450值。實驗重復(fù)3次。按下例公式計算細胞增殖抑制率：

抑制率=（1-藥物組A值／對照組A值）×100%

1.6 利用正交設(shè)計優(yōu)化組分間配伍劑量 經(jīng)析因?qū)嶒灡砻?種組分間存在交互效應(yīng)，確定了藥味組成，但未能明確藥味間的配伍劑量。于是進一步用正交實驗優(yōu)選4種藥味組分（因素）間配伍劑量。根據(jù)析因?qū)嶒灱扒捌陬A(yù)實驗結(jié)果，每個因素設(shè)3個水平值（見表1），選擇L9（34）正交表。以SW620、L02、CIK 3種細胞的增殖抑制率為評價指標(biāo)，其檢測方法及計算方法均同上文。為方便后文敘述完成篩選后將方劑命名：蟾五草組分散。

表1 正交設(shè)計的因素和水平值Tab.1 Orthogonal design’s factors and levels

1.7 蟾五草組分散對體外細胞存活率的影響 為進一步驗證蟾五草組分散的增效減毒作用，選擇對數(shù)生長期SW620、L02、CIK 3種細胞，按上述方法進行接種至96孔板，培養(yǎng)24 h更換新鮮培養(yǎng)基后分3組（蟾五草組分散組、蟾皮華蟾毒配基組分組、無藥對照組）并設(shè)空白對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔。分別于加藥后第1、3、5天取相應(yīng)96孔板進行CCK-8檢測，具體方法同上。按照以下公式計算細胞存活率：

細胞存活率=（藥物組A值-空白對照組A值）/（無藥對照組A值-空白對照組A值）×100%

1.8 蟾五草組分散對L02細胞釋放丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的影響消化對數(shù)生長期L02細胞，臺盼藍計數(shù)后調(diào)整細胞濃度至1×106/mL，以每孔100 μL細胞懸液接種至96孔培養(yǎng)板，輕輕搖勻并標(biāo)記，置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)24 h后仔細吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，更換新鮮DMEM培養(yǎng)基每孔100 μL，分3組（蟾五草組分散組、蟾皮華蟾毒配基組分組、對照組）并分別加入相應(yīng)藥物（其中蟾皮華蟾毒配基組分劑量為2 μg/mL）。然后補充培養(yǎng)基至總體積每孔200 μL，每組3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)3 d，收集每組3個復(fù)孔的上清液于同一1.5 mL EP 管離心（1 500 r/min，10min），移液器吸取上清液至另一1.5 mL EP管標(biāo)記并送檢。標(biāo)本于檢驗科全自動生化分析儀上檢測ALT和AST的含量。實驗重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。析因設(shè)計采用析因設(shè)計方差分析、正交設(shè)計采用直觀分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4種藥物組分間的交互作用 通過對析因設(shè)計結(jié)果分析，見表2。首先主體效應(yīng)檢驗明確了抑制SW620細胞增殖的主因素是A和C（P＜0.01）；保護L02和CIK細胞增殖的主因素是B和D（P＜0.01）；而因素A對3種細胞增殖均有明顯抑制作用（P＜0.01）。其次主體間交互效應(yīng)明確了AD和ABCD對SW620細胞增殖有交互作用（P＜0.01）；ACD 和ABCD分別對L02和CIK細胞增殖有交互作用（P＜0.05）。綜合以上結(jié)果鑒于4種組分配伍（ABCD）經(jīng)交互影響能增強抗腫瘤作用同時降低其毒性，所以藥味選擇時4種組分均被選用，即選取ABCD組方方案。

2.2 優(yōu)化組分間配伍劑量析因設(shè)計 已分析4種組分間的三階交互作用，此處正交設(shè)計僅比較各組合優(yōu)劣，所以選用較為簡便的直觀分析法進行優(yōu)選配伍劑量。具體實驗結(jié)果見表3、表4。首先比較各單因素不同水平對抑制SW620細胞的影響，可以從表4看出因素A，取A3比取A1和A2的抑制率都高；同理分析因素B、C和D對SW620抑制率最高水平值分別為B2、C2和D3。綜合結(jié)果后組合得出抑制SW620最佳配伍劑量：A3B2C2D3。再比較4個因素的極差值R時，極差越大提示該因素對該細胞株的影響越大。

其次比較各單因素不同水平對抑制L02和CIK細胞的影響。因本實驗?zāi)康闹皇菫榱私档蚅02和CIK細胞的抑制率，所以應(yīng)選擇低抑制率的劑量。同理用上述分析方法分析表4后得出保護L02和CIK細胞的最優(yōu)配伍劑量分別為：A1B3C3D1和A1B2C1D3。但是本研究以抗腫瘤為主要目的，所以A因素須選擇A3水平才能達到較好抑制腫瘤細胞生長（對SW620抑制率＞50%）。因素B在保護L02和CIK方面，B2和B3水平作用相近，但B2對SW620增效更明顯，所以B因素選擇B2。因素C在保護L02和CIK方面，C3和C1水平影響均微弱，但C2對SW620抑制較明顯，所以C因素選擇C2。因素D在保護L02和CIK方面，D1和D3水平均較好，但兩者對L02和CIK作用均不十分明顯，但兩者劑量差距巨大，且在方劑配伍中D為“使”，所以D因素選擇低劑量的D1。綜合以上結(jié)果并組合最優(yōu)配伍劑量，即A3B2C2D1（蟾皮華蟾毒配基組分2 μg/mL，五味子組分 10 μg/mL，黃芪組分 5 μg/mL和甘草酸10 μg/mL，并命名：蟾五草組分散）。

表2 24析因設(shè)計中各組合對不同細胞增殖抑制率的影響（±s）Tab.2 Results on different cells'survival rate of each combination of Factorial design(24)（±s）%

表2 24析因設(shè)計中各組合對不同細胞增殖抑制率的影響（±s）Tab.2 Results on different cells'survival rate of each combination of Factorial design(24)（±s）%

編號 組合 SW620 L02 CIK抑制率 F值 P值 抑制率 F值 P值 抑制率 F值 P值1 A 42.00 2 020.54 0.000 40.33 3 880.72 0.000 50.23 4 140.94 0.000 2 B -0.17 4.314 0.046 -1.21 24.043 0.000 -1.33 10.828 0.002 3 C 6.27 26.551 0.000 2.33 2.111 0.156 1.67 1.663 0.206 4 D -1.87 1.014 0.322 -1.67 19.025 0.000 -1.73 30.504 0.000 5 AB 45.10 0.000 0.983 34.00 0.008 0.927 49.00 0.124 0.727 6 AC 49.20 3.452 0.072 37.47 1.680 0.204 44.33 2.141 0.153 7 AD 48.33 11.560 0.002 33.67 0.263 0.612 44.97 2.008 0.166 8 BC 11.83 0.111 0.741 -2.43 0.016 0.899 -1.73 1.024 0.319 9 BD 1.37 0.544 0.466 -4.53 0.241 0.627 -4.50 1.693 0.202 10 CD 4.73 2.288 0.140 -1.83 1.129 0.296 -2.00 3.446 0.073 11 ABC 46.00 0.030 0.864 36.70 2.258 0.143 44.57 3.277 0.080 12 ABD 49.07 1.992 0.168 32.50 0.307 0.583 37.90 0.889 0.353 13 ACD 47.33 0.507 0.482 38.20 3.328 0.077 42.83 6.564 0.015 14 BCD 4.23 0.227 0.637 -5.10 0.918 0.345 -5.00 1.489 0.231 15 ABCD 55.00 8.232 0.007 34.80 5.101 0.031 42.43 0.341 0.563 16 對照 0 0 0

表3 正交表L9（34）各因素組合及實驗結(jié)果（±s）Tab.3 Orthogonal design L9(34)’s each combination and its results（±s）

表3 正交表L9（34）各因素組合及實驗結(jié)果（±s）Tab.3 Orthogonal design L9(34)’s each combination and its results（±s）

組別 因素組合 細胞增殖抑制率（%）SW620 L02 CIK 1 A1B1C1D1 5.67 9.90 14.93 2 A1B2C3D3 8.73 8.30 9.69 3 A1B3C2D2 9.07 6.50 11.93 4 A2B3C3D1 30.83 29.00 42.97 5 A2B2C1D2 30.26 32.47 37.33 6 A2B1C2D3 33.20 33.80 42.20 7 A3B3C1D3 55.77 34.77 41.50 8 A3B2C2D1 59.45 36.63 45.17 9 A3B1C3D2 56.40 39.40 47.07

2.3 蟾五草組分散對體外細胞存活的影響 與蟾皮華蟾毒配基組分相比，高效低毒的蟾五草組分散對蟾皮華蟾毒配基組分抑制SW620的增效作用集中在第5天（P＜0.01）；而蟾五草組分散降低蟾皮華蟾毒配基組分對L02、CIK的毒性集中體現(xiàn)在第3天（P＜0.05），隨著時間延長保護作用減弱，見表5。

表4 直觀分析的結(jié)果Tab.4 Direct-viewing analysis’results

2.4 蟾五草組分散對L02細胞釋放ALT、AST的影響 蟾皮華蟾毒配基組分與對照組比較有明顯升高 ALT、AST 的作用（P＜0.05），見表 6。蟾五草組分散的L02細胞釋放ALT相對蟾皮華蟾毒配基組分有明顯下降（P＜0.05），但AST只有下降趨勢（P＞0.05）。說明蟾五草組分散對其蟾皮華蟾毒配基組分造成的L02細胞損傷有一定保護作用。

表5 3種細胞不同時間點細胞存活率（±s）Tab.5 Survival rate of three kinds cell lines in different time（±s）%

表5 3種細胞不同時間點細胞存活率（±s）Tab.5 Survival rate of three kinds cell lines in different time（±s）%

注：與蟾皮華蟾毒配基組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 SW620 L02 CIK第1天 第3天 第5天 第1天 第3天 第5天 第1天 第3天 第5天蟾五草組分散 74.50±3.25 42.53±3.66 17.97±2.78** 86.03±2.13 64.20±3.32* 22.77±2.55 80.90±3.75 56.03±4.00* 33.20±2.55蟾皮華蟾毒配基組分 79.73±3.12 47.63±4.24 29.20±2.57 82.30±3.22 57.16±2.00 20.30±3.25 77.30±3.63 46.97±3.15 28.43±1.94

表6 蟾五草組分散對L02細胞釋放ALT、AST的影響（±s）Tab.6 Effect of L02 cell releasing the ALT and AST with CFP（±s）U/L

表6 蟾五草組分散對L02細胞釋放ALT、AST的影響（±s）Tab.6 Effect of L02 cell releasing the ALT and AST with CFP（±s）U/L

注：與對照組比較，*P＜0.05；與蟾五草組分散組比較，#P＜0.05。

組別 ALT AST蟾五草組分散 2.16±0.15 3.83±0.25蟾皮華蟾毒配基組分 2.63±0.25*# 4.43±0.40*對照組 2.03±0.21 3.43±0.25

3 討論

中藥配伍理論是中藥方劑最寶貴的方藥理論，通過配伍來改變原藥物藥效而實現(xiàn)增效減毒[8-9]。通過前期實驗已明確蟾皮華蟾毒配基組分具有較強抗腫瘤作用，所以是本實驗的君藥[1]。選用五味子、黃芪、甘草的有效組分與之配伍以期降低其毒副作用，從而達到祛邪不傷正的目的。

利用析因?qū)嶒灧治隽怂幬镏g的主體效應(yīng)和交互效應(yīng)，明確藥味在組方中的必要性。主體效應(yīng)提示蟾皮華蟾毒配基組分（A）、五味子組分（B）和甘草酸（D）的作用最為突出，但交互效應(yīng)提示蟾皮華蟾毒配基組分（A）與五味子組分（B）、黃芪組分（C）和甘草酸（D）有交互影響，而且4種藥物（ABCD）共同配伍時交互影響有顯著意義。文獻也報道黃芪和甘草合用能提高機體抗應(yīng)激能力[10]，而五味子和甘草合用能提高肝藥酶的代謝[11]，說明它們之間同本實驗一樣存在交互作用。藥物組方時4種組分均被選用以增效減毒，并為下一步實驗確定了藥味組成。

通過正交實驗設(shè)計來優(yōu)選4種藥味不同劑量水平下的配伍劑量。為合理控制實驗規(guī)模，各藥味（因素）設(shè)3個水平。結(jié)果提示抑制SW620最優(yōu)配伍劑量：A3B2C2D3，而保護L02和CIK細胞的最優(yōu)配伍劑量分別為：A1B3C3D1和A1B2C1D3。陳云華等[12]發(fā)現(xiàn)甘草酸對肝細胞的體外最大保護效能33%，不成量效關(guān)系。孫華麗等[13]發(fā)現(xiàn)五味子成分在25 μg/mL時可以顯著降低肝細胞轉(zhuǎn)氨酶。各因素對不同細胞的作用劑量呈不同效應(yīng)，符合文獻提示的不成量效關(guān)系。本實驗以抗腫瘤為主要目的，所以A為君藥并選擇A3水平。另外，相似療效下以低劑量水平更符合用藥原則，所以B因素選擇B2水平，C因素選擇C2水平，D因素選擇D1水平。綜合各結(jié)果最終確定優(yōu)化配伍劑量為：A3B2C2D1，并命名：蟾五草組分散。然而正交實驗是部分水平的組合，且水平數(shù)有限又為體外實驗，不能全面分析所有組合，可能還有更優(yōu)配伍需后續(xù)深入挖掘。

蟾五草組分散對L02和CIK細胞存活率僅在一定時間范圍內(nèi)可以起到保護作用。在第3天時效果最明顯，隨后保護作用下降，這可能與細胞代謝障礙有關(guān)。在體外實驗條件下，藥物之間的多重作用下可能細胞功能難以得到連動并長期維持。也可能與細胞長期處于蟾皮華蟾毒配基組分毒性環(huán)境下細胞代謝減弱，而其他藥物保護作用逐漸失去效應(yīng)有關(guān)。從L02細胞釋放ALT、AST濃度變化中，發(fā)現(xiàn)蟾五草組分散有保護L02細胞的作用。有文獻報道甘草酸降低轉(zhuǎn)氨酶在小鼠體內(nèi)顯著[14-15]，而五味子在16.7 μg/mL濃度下可以降低肝細胞轉(zhuǎn)氨酶[13]。由于復(fù)方的藥代動力學(xué)相對單藥代謝更為復(fù)雜，也許在小鼠體內(nèi)更能體現(xiàn)出降低轉(zhuǎn)氨酶作用。

通過本實驗確定了蟾五草組分散的組成和配伍劑量，初步得到了高效低毒的復(fù)方組分群，為進一步觀察在小鼠體內(nèi)藥效實驗奠定了基礎(chǔ)。