糖腎1號(hào)方含藥血清對(duì)高糖環(huán)境下培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中 TGF-β1、α-SMA、FN mRNA和蛋白水平的影響*

王麗君，楊熙凱，徐 冰，趙 晰，王耀光

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300073）

隨著糖尿病腎?。―N）的患病率越來(lái)越高，DN進(jìn)入終末期腎?。‥SRD）的人數(shù)逐漸上升，DN給個(gè)人、家庭、社會(huì)都帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)[1-2]。腎纖維化幾乎是所有慢性腎臟病進(jìn)展為ESRD的共同途徑，其中以DN腎纖維化最為顯著[3]。隨著對(duì)DN研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)腎小管間質(zhì)纖維化在DN進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，延緩腎小管間質(zhì)纖維化的研究對(duì)改善患者預(yù)后有重要意義[4]。目前干預(yù)DN腎纖維化主要從原發(fā)病入手，如控制血糖、調(diào)節(jié)血脂、改善腎臟血流動(dòng)力學(xué)、保護(hù)腎功能等，而抗腎纖維化方面尚缺乏靶向藥物。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)注重整體觀念，在治療上主張“分期辨治，辨證論治，綜合治療”，中醫(yī)藥干預(yù)、治療DN具有較好療效，近年來(lái)越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始把研究方向指向中醫(yī)學(xué)。

糖腎1號(hào)方是王耀光教授治療DN的經(jīng)驗(yàn)方，在改善DN患者臨床癥狀、調(diào)節(jié)糖脂代謝、降低尿白蛋白方面具有良好的療效[5]。糖腎1號(hào)方早期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)糖腎1號(hào)方對(duì)早期DN大鼠的尿蛋白及尿微量白蛋白有明顯改善作用，可增強(qiáng)機(jī)體氧自由基的清除能力，調(diào)節(jié)血清中炎癥介質(zhì)，進(jìn)而延緩腎小球硬化程度，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化程度而改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能[6]。為了進(jìn)一步探究糖腎1號(hào)方的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以高糖環(huán)境下誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）為研究模型，運(yùn)用蛋白免疫印跡（Western blot）法和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）方法檢測(cè)了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、α-平滑肌蛋白（α-SMA）、纖維連接蛋白（FN），及調(diào)控基因的mRNA表達(dá)量。以期通過(guò)現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段，揭示糖腎1號(hào)方可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)所用的HK-2細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠12只，體質(zhì)量（250±10）g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，大鼠飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，普通飼料喂養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 糖腎1號(hào)方：黃芪30 g，白術(shù)15 g，丹參 15 g，山藥 30 g，鬼箭羽 15 g，川芎 12 g，防風(fēng)15 g，防己 15 g，萆薢 15 g，生地 12 g，石菖蒲 15 g，地龍12 g，天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院國(guó)藥堂提供，用時(shí)旋蒸濃縮，批號(hào)：2018002。

1.4 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 MEM ALPHA細(xì)胞培養(yǎng)基（批號(hào)C12571500BT，Gibco公司）；胎牛血清（批號(hào) sv30087.03，HyClone公司）；胰蛋白酶 1∶250（Genview，貨號(hào)：GP3108）；4-甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，Beyotime公司），貨號(hào)/批號(hào)：C0009/081817171103）；TGF-β1、α-SMA、FN 抗體（Abcam 公司）；葡萄糖（批號(hào)201710102，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司），配制為30 mmol/L的溶液。FORMA3111 CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher公司）；AIRTECH生物安全柜（產(chǎn)地：中國(guó)）；Nikon TE 300倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；Osterode離心機(jī)（德國(guó)Thermo Fisher公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；電泳儀（北京六一儀器廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HK-2細(xì)胞置于MEM ALPHA培養(yǎng)基中，并加入10%青霉素及鏈霉素100 μg/mL，在 95%O2、5%CO2、37 ℃條件下傳代培養(yǎng)。

2.2 含藥血清的制備 取健康SD雄性大鼠12只，測(cè)體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量分層隨機(jī)分為空白血清組、糖腎1號(hào)方低劑量組、糖腎1號(hào)方高劑量組，每組4只，依據(jù)人臨床用藥劑量，計(jì)算出大鼠的等效劑量，本實(shí)驗(yàn)中糖腎1號(hào)低劑量組為等效劑量，高劑量組為等效劑量的5倍，低劑量組用藥劑量18 g/kg，高劑量組用藥劑量90 g/kg，灌胃給藥；空白血清組使用生理鹽水灌胃。灌胃劑量10 mL/kg，1次/日，共7 d。于第7天灌胃后30 min經(jīng)大鼠股動(dòng)脈取血10 mL，離心制備血清，56℃滅活，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組 1）空白組：MEM ALPHA培養(yǎng)基；2）高糖組：MEM ALPHA培養(yǎng)基+30 mmol/L葡萄糖；3）空白血清對(duì)照組：MEM ALPHA培養(yǎng)基+30 mmol/L葡萄糖+10%空白血清；4）糖腎1號(hào)方低劑量組：MEM ALPHA培養(yǎng)基+30 mmol/L葡萄糖+10%低劑量含藥血清；5）糖腎1號(hào)方高劑量組：MEM ALPHA培養(yǎng)基+30 mmol/L葡萄糖+10%高劑量含藥血清。

3 RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法

3.1 引物設(shè)計(jì) 在NCBI基因庫(kù)中查詢所需要的相關(guān)基因序列，然后通過(guò)Primer 5引物設(shè)計(jì)軟件來(lái)設(shè)計(jì)引物序列，設(shè)置好后與blast網(wǎng)站中的基因序列進(jìn)行對(duì)比，最后確定目的基因的序列，具體信息見(jiàn)表1。

表1 引物序列列表Tab.1 List of primer sequences

3.2 實(shí)驗(yàn)方法 用Trizol提取腎HK-2細(xì)胞總RNA后，采用TIANScript RT KIT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到所需cDNA,選擇β-actin為內(nèi)參基因，用熒光定量PCR儀，進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析，具體實(shí)驗(yàn)步驟及添加試劑按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行，所設(shè)置的反應(yīng)體系 20 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃、15 min、1 個(gè)循環(huán)，95 ℃、10 s、40 個(gè)循環(huán)，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s。

4 Western Blot實(shí)驗(yàn)方法

提取總蛋白后用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定各細(xì)胞樣本蛋白含量。根據(jù)蛋白定量的結(jié)果，于離心管中加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品和蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液并輕輕混勻，置于95℃加熱片中進(jìn)行蛋白變性處理10 min，然后迅速插入冰中冷卻待用；將變性后的蛋白樣品輕輕用加樣器小心加至凝膠孔中，設(shè)置電泳儀參數(shù)為穩(wěn)壓狀態(tài)并接通電源，將電壓調(diào)至80 V進(jìn)行電泳；裁剪好PVDF膜并置于100%甲醇中浸泡2～3 min使其活化，然后用水和電轉(zhuǎn)液分別漂洗2 min；同時(shí)剪裁與膠同樣大小的6層濾紙，并用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡備用。電泳結(jié)束后取下電泳板，小心剝離夾板中的墊片并去掉上層玻璃板，切除濃縮膠部分，用電轉(zhuǎn)液將含樣品膠漂洗1次；按照從黑色負(fù)極開(kāi)始依次為海綿墊片、3層濾紙、樣品膠、PVDF膜、3層濾紙、海綿墊片，排列整齊后用玻璃棒輕壓以排除多余的氣泡，固定好放入含有轉(zhuǎn)膜緩沖液的轉(zhuǎn)移電泳槽中；設(shè)置電流130 mA，電壓20 V左右，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，逐層掀去各層，小心取出PVDF膜標(biāo)記好正反面及樣品順序后放入封閉液中，水平搖床上緩慢震蕩室溫封閉1 h；將一抗用封閉液稀釋；將封閉后的膜直接放入一抗工作液中，置于水平搖床上緩慢振蕩室溫孵育4 h；回收一抗，用TBST洗膜3次，將洗滌后的一抗反應(yīng)膜以1∶3 000的比例放入二抗工作液中，室溫、避光放搖床上緩慢搖動(dòng)作用60 min；回收二抗，用1×TBST洗膜3次，用凝膠成像系統(tǒng)曝光及洗片，用Image J軟件分析灰度值。

5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用軟件SPSS 22.0進(jìn)行分析處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

6.1 RT-PCR檢測(cè)HK-2細(xì)胞中TGF-β1、α-SMA、FN mRNA的表達(dá)

6.1.1 TGF-β1 mRNA表達(dá) 與空白組相比，高糖組TGF-β1 mRNA表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與高糖組相比，空白血清組 TGF-β1 mRNA表達(dá)量較多，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與高糖組相比，糖腎1號(hào)方低劑量組和糖腎1號(hào)方高劑量組TGF-β1 mRNA表達(dá)量均減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與糖腎1號(hào)方低劑量組比較，糖腎1號(hào)方高劑量組TGF-β1 mRNA表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

6.1.2 α-SMA mRNA表達(dá) 與空白組相比，高糖組α-SMA mRNA表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與高糖組相比，空白血清組α-SMA mRNA表達(dá)增多，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與高糖組相比，糖腎1號(hào)方低劑量組和糖腎1號(hào)方高劑量組α-SMA mRNA表達(dá)量均減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與糖腎1號(hào)方低劑量組相比，糖腎1號(hào)方高劑量組α-SMA mRNA表達(dá)量減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

6.1.3 FN mRNA表達(dá) 與空白組相比，高糖組FN mRNA 表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與高糖組相比，空白血清組FNmRNA表達(dá)無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與高糖組相比，糖腎1號(hào)方低劑量組和糖腎1號(hào)方高劑量組FN mRNA表達(dá)量均減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與糖腎1號(hào)方低劑量組相比，糖腎1號(hào)方高劑量組FN mRNA表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 RT-PCR檢測(cè)檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1、α-SMA、FN mRNA的表達(dá)（相對(duì)β-actin的相對(duì)表達(dá)量，±s）Tab.2 RT-PCR detection of tubular epithelial cells TGF-β1,α-SMA,FN mRNA expression(relative to β-actin relative expression,±s)

表2 RT-PCR檢測(cè)檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1、α-SMA、FN mRNA的表達(dá)（相對(duì)β-actin的相對(duì)表達(dá)量，±s）Tab.2 RT-PCR detection of tubular epithelial cells TGF-β1,α-SMA,FN mRNA expression(relative to β-actin relative expression,±s)

注：與空白組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，#P＜0.05；與糖腎 1 號(hào)方低劑量組比較，△P＜0.05。

組別 n TGF-β1 α-SMA FN空白組 3 1.10±0.19 1.00±0.04 1.02±0.04高糖組 3 19.19±2.87* 3.05±0.40* 5.99±0.80*空白血清組 3 17.41±1.03* 2.70±0.39* 5.98±0.54*糖腎 1 號(hào)方低劑量組 3 8.69±1.64*# 1.81±0.05*# 3.5±0.68*#糖腎 1 號(hào)方高劑量組 3 4.55±0.65*#△ 1.45±0.09# 2.0±0.44#△

6.2 WesternBlot法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞中TGF-β1、α-SMA、FN蛋白的表達(dá)

6.2.1 TGF-β1蛋白表達(dá) 與空白組相比，高糖組TGF-β1蛋白表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與高糖組相比，空白血清組TGF-β1蛋白表達(dá)量減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與高糖組相比，糖腎1號(hào)方低劑量組和糖腎1號(hào)方高劑量組TGF-β1蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與糖腎1號(hào)方低劑量組相比，糖腎1號(hào)方高劑量組TGF-β1蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3和圖1。

6.2.2 α-SMA蛋白表達(dá) 與空白組相比，高糖組α-SMA蛋白表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與高糖組相比，空白血清組α-SMA蛋白表達(dá)減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與高糖組相比，糖腎1號(hào)方低劑量組α-SMA蛋白表達(dá)量減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與高糖組相比，糖腎1號(hào)方高劑量組α-SMA蛋白表達(dá)量減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與糖腎1號(hào)方低劑量組相比較，糖腎1號(hào)方高劑量組α-SMA蛋白表達(dá)減少，但減少的灰度值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表3和圖1。

6.2.3 FN蛋白表達(dá) 與空白組相比，高糖組FN蛋白表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與高糖組相比，空白血清組FN蛋白表達(dá)減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與高糖組相比，糖腎1號(hào)方低劑量組和糖腎1號(hào)方高劑量組FN蛋白表達(dá)量減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與糖腎1號(hào)方低劑量組比較，糖腎1號(hào)方高劑量組FN蛋白表達(dá)減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3和圖1。

表3 Western blot法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1、α-SMA、FN蛋白的表達(dá)（相對(duì) β-actin的灰度值，±s）Tab.3 Western blot to detect the expression of TGF-β1,α-SMA and FN in renal tubular epithelial cells(relative to the gray value of β-actin,±s)

表3 Western blot法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1、α-SMA、FN蛋白的表達(dá)（相對(duì) β-actin的灰度值，±s）Tab.3 Western blot to detect the expression of TGF-β1,α-SMA and FN in renal tubular epithelial cells(relative to the gray value of β-actin,±s)

注：與空白組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，#P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) TGF-β1 α-SMA FN空白組 3 0.28±0.03 0.32±0.14 0.31±0.06高糖組 3 0.58±0.10* 0.49±0.03* 0.63±0.20*空白血清組 3 0.56±0.11* 0.42±0.04 0.54±0.14*糖腎 1 號(hào)方低劑量組 3 0.58±0.04* 0.38±0.09 0.43±0.05*#糖腎 1 號(hào)方高劑量組 3 0.61±0.05* 0.28±0.07# 0.37±0.03#

圖1 各組TGF-β1、α-SMA、FN蛋白表達(dá)的比較Fig.1 Comparison of TGF-β1,α-SMA and FN proteinexpression in treatment groups of each group

7 討論

DN是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，早期臨床表現(xiàn)為微量白蛋白尿，病理表現(xiàn)上表現(xiàn)為腎小球肥大、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）增多、腎小球硬化和間質(zhì)纖維化[7]。本病屬于中醫(yī)“關(guān)格”、“水腫”、“腎消”、“內(nèi)消”、“下消”等范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其病因主要與先天稟賦不足、后天飲食不節(jié)、平素情志失調(diào)、房勞過(guò)度、六淫邪毒等密切相關(guān)，病位主要在肺脾腎三臟?；静C(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，早期多為氣陰兩傷，瘀血阻絡(luò)，腎失封藏；日久脾腎俱損，陰陽(yáng)兩虛，夾有瘀血和水濕潴留，泛溢肌膚；病變晚期，腎陽(yáng)衰憊，水濕泛濫，濁毒內(nèi)停，上凌心肺。治療上，因病機(jī)多為氣陰虧虛，瘀血阻絡(luò)，脾腎虧虛，故治以益氣養(yǎng)陰，活血化瘀，健脾益腎。王耀光教授總結(jié)多年治療DN的臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為DN的基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜，本虛以脾腎虧虛、氣陰兩虛為主，以血瘀、痰濁、水濕為標(biāo)，故提出健脾補(bǔ)腎、益氣養(yǎng)陰、活血祛濁法為治療DN的基本原則，自擬“糖腎1號(hào)方”。其主要藥物組成為：黃芪、生地、白術(shù)、山藥、丹參、鬼箭羽、川芎、石菖蒲、防己等。方中黃芪、生地、白術(shù)、山藥益氣養(yǎng)陰，健脾補(bǔ)腎；鬼箭羽、丹參、川芎、石菖蒲、防己破血通經(jīng)、養(yǎng)血活血、祛風(fēng)通絡(luò)、化濕祛濁、利水消腫，標(biāo)本兼治，共奏益氣養(yǎng)陰、健脾補(bǔ)腎、活血化濁法。此外，繼承黃文政教授活血通絡(luò)、散結(jié)通絡(luò)思想，認(rèn)為DN腎纖維化屬于濕濁瘀毒互織之“微型癥瘕”，因此臨床上多配伍蟲(chóng)蟻搜剔之品以破血逐瘀通絡(luò)，祛頑痰、破死血。瘀阻輕者可用蟬蛻、白僵蠶、地龍，稍重者可加用全蝎，瘀阻嚴(yán)重者可加用蜈蚣、烏梢蛇等[8]。

DN腎纖維化的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，與氧化應(yīng)激、糖脂代謝紊亂、炎癥反應(yīng)等有關(guān)，還涉及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等。目前干預(yù)DN腎纖維化主要從原發(fā)病入手，如控制血糖、調(diào)節(jié)血脂、改善腎臟血流動(dòng)力學(xué)、保護(hù)腎功能等，經(jīng)過(guò)前期臨床觀察，發(fā)現(xiàn)“糖腎1號(hào)方”可以控制血糖、調(diào)節(jié)血脂、降低24 h尿蛋白定量保護(hù)腎功能[5]。TGF-β1是目前公認(rèn)的致纖維化細(xì)胞因子，在腎纖維化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，可調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[9]。EMT是腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。α-SMA是EMT的主要標(biāo)記蛋白，是肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的標(biāo)志[10]。α-SMA表達(dá)的增多，說(shuō)明成纖維細(xì)胞被活化，分泌和增殖膠原的能力增強(qiáng)，細(xì)胞外基質(zhì)形成增多，促進(jìn)纖維化的形成。因此，TGF-β1和α-SMA的表達(dá)對(duì)于EMT和ECM的進(jìn)展及預(yù)后具有重要意義[11]。FN異常增高提示細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度積聚，是糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化的主要表現(xiàn)之一[12]。因此腎病纖維化的進(jìn)程可以通過(guò)TGF-β1、α-SMA、FN的表達(dá)水平來(lái)反應(yīng)。HK-2細(xì)胞自身具有非常強(qiáng)的可塑性，為適應(yīng)不同的生存環(huán)境，可針對(duì)外來(lái)不同刺激作出相應(yīng)的自身調(diào)節(jié)反應(yīng)。高糖培養(yǎng)HK-2細(xì)胞24 h時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞伸長(zhǎng)呈梭形，輪廓界限不清晰。高糖培養(yǎng)短時(shí)間刺激其增殖，刺激ECM的分泌，促進(jìn)表達(dá)，長(zhǎng)時(shí)間刺激誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞大量凋亡，并可誘導(dǎo)小鼠腎小管上皮向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[13]。本實(shí)驗(yàn)以高糖環(huán)境下培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞為模型，經(jīng)糖腎1號(hào)方含藥血清干預(yù)后，TGF-β1、α-SMA、FN mRNA 表達(dá)水平明顯被抑制（P＜0.05），相應(yīng)的 α-SMA、FN 蛋白的表達(dá)水平也出現(xiàn)了明顯的下調(diào)（P＜0．05），這說(shuō)明糖腎 1號(hào)方抗腎病纖維化的作用機(jī)制可能與其能夠影響腎纖維化環(huán)路中關(guān)鍵基因及蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。在高濃度含藥血清與低濃度含藥血清的比較中發(fā)現(xiàn)不同濃度對(duì)于TGF-β1和FN mRNA的表達(dá)有明顯的差異，且高濃度含藥血清功效明顯優(yōu)于低濃度含藥血清。說(shuō)明藥量的不同，其藥物效應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生一定的變化。

綜上所述，糖腎一號(hào)方可治DN纖維化的作用機(jī)制可能為：該方可干預(yù)高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞TGF-β1、α-SMA、FN mRNA 及蛋白表達(dá)水平，通過(guò)下調(diào)TGF-β1、α-SMA及FN mRNA表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)α-SMA及FN蛋白表達(dá)，從而抑制腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中關(guān)鍵的EMT和ECM過(guò)度沉積過(guò)程，在一定程度上達(dá)到抑制腎間質(zhì)纖維化過(guò)程的目的。故糖腎I號(hào)方或可在DN治療中具有一定意義，有助于延緩DN進(jìn)展至ESRD的進(jìn)程。